Isolatie van muizendarmmesenchym resulterend in een hoge opbrengst van telocyten

Ons protocol voor het isoleren van intestinale mesenchym resulteert in een hoge opbrengst aan telocyten. Deze methode biedt een eerste platform om cel-cel interactie met telocyten te bestuderen in homeostase en ziekte. Telocyten zijn unieke cellen die gevoelig zijn voor beschikbare weefseldissociatieprotocollen.

Daarom is het belangrijkste voordeel van deze techniek de isolatie van mesenchym, inclusief verrijkte levensvatbare telocyten. Mesenchym, inclusief telocyten, kan dienen als een bron voor het signaleren van moleculen en groeifactoren die nodig zijn voor georganiseerde groei ex vivo. Om te beginnen, was de darm, gescheiden van een geëuthanaseerde muis, in een petrischaal met koude, steriele PBS.

Leg de darm in een petrischaaltje. En gebruik een schaar met een balpunt, open de darmbuis in de lengterichting en spoel de ontlasting uit. Breng de darm over in een nieuwe schaal met verse, koude PBS.

Nadat je de darm nog een keer hebt gewassen, snijd je de dunne darm in segmenten van een centimeter lang en breng je ze over in een conische buis van 15 milliliter gevuld met acht milliliter PBS. Schud de buis handmatig met één of twee cycli per seconde gedurende één minuut. Giet de oplossing in een petrischaaltje.

En breng met behulp van een tang het segment over in een conische buis van 50 milliliter gevuld met 20 milliliter oplossing A.Plaats de buizen gedurende 20 minuten in een orbitale shakerincubator bij 37 graden Celsius. Schud de buis na incubatie krachtig met de hand bij vier of vijf cycli per seconde gedurende één minuut om het epitheel te dissociëren. Herhaal deze stap nogmaals.

Na het snijden en wassen van de fragmenten zoals eerder gedemonstreerd, brengt u ze over in een nieuwe buis van 50 milliliter gevuld met 10 milliliter steriele PBS en keert u de buis om met één of twee cycli per seconde gedurende één minuut. Giet de oplossing in een petrischaaltje. Breng de segmenten over in een nieuwe buis van 15 milliliter gevuld met 10 milliliter steriele PBS en kantel zachtjes op en neer met één of twee cycli per seconde gedurende twee minuten.

Gebruik onder een bioveiligheidskast een tang om de segmenten op een steriel laboratoriumdoekje te plaatsen om ze te drogen. Eenmaal gedroogd, snijd je de segmenten verder in stukjes. Breng de gesneden stukken met een tang over in een plaat met zes putten gevuld met vier milliliter voorverwarmde digestieoplossing per put.

Incubeer de plaat op 37 graden Celsius gedurende 50 minuten en schud de plaat voorzichtig handmatig om de 20 minuten. Breng vervolgens de stukken over met behulp van een Pasteur-pipet in een conische buis van 15 milliliter gevuld met vier milliliter DMEM. Schud de buis handmatig met vier of vijf cycli per seconde gedurende één minuut om een suspensie met één cel te krijgen.

Filter de suspensie door een zeef van 100 micrometer in een conische buis van 50 milliliter. Centrifugeer het filtraat op 700 g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Gooi het supernatant weg door aspiratie en resuspensie van de celkorrel in vijf milliliter 2% FBS / PBS.

Nadat u de suspensie nog een keer bij 700 g gedurende vijf minuten hebt gecentrifugeerd, gooit u het supernatant weg en resuspensie u de celpellet in 12 milliliter kweekmedium. Tot slot, zaai de celsuspensie in zes-putplaten. Na mesenchymdissociatie verliezen telocyten hun cellulaire kenmerken, vertonen ze ronde cellulaire morfologie en reflecteren ze minder aantal GFP-positieve cellen op dag één in vergelijking met de volgende dagen.

Een paar dagen later vertonen telocyten een kleine, uitgerekte celmorfologie met korte cellulaire processen. Na zeven tot 10 dagen zaaien krijgen telocyten hun cellulaire kenmerken terug en vertonen ze grote, uitgerekte celmorfologie met lange cytoplasmatische processen. Flowcytometrie onthult de celsamenstelling.

Over het algemeen was 69% van de geïsoleerde cellen levensvatbaar op basis van DAPI-kleuring. En hiervan vertegenwoordigde 60,9% epitheliale besmetting en immuun- en endotheelcellen. De telocytfractie verspreidde zich boven respectievelijk 100k en 70k FSC en SSC en vertegenwoordigde bijna 10% van het gated mesenchym.

FACS-analyse toonde aan dat de subset van telocyten kan worden gedefinieerd door positieve kleuring naar CD201 en GP38. Immunostaining van eendaags gekweekt mesenchym met behulp van deze markers toonde expressie van deze moleculaire markers, ondanks dat cellen hun cellulaire kenmerken niet vertoonden. Deze procedure resulteert in een levensvatbare eencellige suspensie van stromale cellen, die niet alleen voor 2D-cultuur kan worden gebruikt, maar voor elke andere toepassing, zoals 3D-cocultuur met organoïden of bioprinting.