Name: Verrode fluorescentie-geassocieerde β-galactosidase-sonde voor identificatie en verrijking van senescente tumorcellen door flowcytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T13:40:00.000+00:00
Duration: 14 min 1 s
Description: Leer een snelle flowcytometrie-methode voor het detecteren van therapie-geïnduceerde senescentie in tumorcellen met dubbele markers. Deze techniek verbetert de betrouwbaarheid en maakt verrijking van senescente cellen voor verdere analyse mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken de Cytometry and Antibody Core Facility van de Universiteit van Chicago voor de ondersteuning bij flowcytometrie-instrumentatie. Het Animal Research Center van de Universiteit van Chicago zorgde voor dierenhuisvesting.

<ol><li>Saleh, T., Tyutyunyk-Massey, L., Gewirtz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+escape+from+therapy-induced+senescence+as+a+model+of+disease+recurrence+after+dormancy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor cell escape from therapy-induced senescence as a model of disease recurrence after dormancy.</a> Cancer Research. 79 (6), 1044-1046 (2019).</li>
<li>Wang, B., Kohli, J., Demaria, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+cells+in+cancer+therapy%3A+friends+or+foes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Senescent cells in cancer therapy: friends or foes.</a> Trends in Cancer. 6 (10), 838-857 (2020).</li>
<li>Prasanna, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapy-induced+senescence%3A+Opportunities+to+improve+anticancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Therapy-induced senescence: Opportunities to improve anticancer therapy.</a> Journal of the National Cancer Institute. 113 (10), 1285-1298 (2021).</li>
<li>Velarde, M. C., Demaria, M., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+cells+and+their+secretory+phenotype+as+targets+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Interdisciplinary+Topics+in+Gerontology+and+Geriatrics%22%5BJournal%5D)">Senescent cells and their secretory phenotype as targets for cancer therapy.</a> Interdisciplinary Topics in Gerontology and Geriatrics. 38, 17-27 (2013).</li>
<li>Ou, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+in+cancer%3A+from+mechanisms+to+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence in cancer: from mechanisms to detection.</a> Molecular Oncology. 15 (10), 2634-2671 (2021).</li>
<li>Hernandez-Segura, A., Nehme, J., Demaria, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cellular senescence.</a> Trends in Cell Biology. 28 (6), 436-453 (2018).</li>
<li>Bojko, A., Czarnecka-Herok, J., Charzynska, A., Dabrowski, M., Sikora, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+the+senescence+phenotype+of+cancer+cells+treated+with+chemotherapeutic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Diversity of the senescence phenotype of cancer cells treated with chemotherapeutic agents.</a> Cells. 8 (12), 1501(2019).</li>
<li>Mikuła-Pietrasik, J., Niklas, A., Uruski, P., Tykarski, A., Książek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+significance+of+therapy-induced+and+spontaneous+senescence+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and significance of therapy-induced and spontaneous senescence of cancer cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (2), 213-229 (2020).</li>
<li>Lee, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+beta-galactosidase+is+lysosomal+beta-galactosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+cell%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase.</a> Aging cell. 5 (2), 187-195 (2006).</li>
<li>Itahana, K., Itahana, Y., Dimri, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+detection+of+senescence-associated+%CE%B2+galactosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Colorimetric detection of senescence-associated β galactosidase.</a> Methods in Molecular Biology. 965, 143-156 (2013).</li>
<li>Dimri, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9363-9367 (1995).</li>
<li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+%28SA-betagal%29+activity%2C+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).</li>
<li>Noppe, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+flow+cytometric+method+for+measuring+senescence+associated+beta-galactosidase+activity+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts.</a> Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).</li>
<li>Tung, C. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+%CE%B2-galactosidase+activity+using+far+red+fluorescent+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of β-galactosidase activity using far red fluorescent switch.</a> Cancer Research. 64 (5), 1579-1583 (2004).</li>
<li>Gong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Galactosidase+activity+assay+using+far-red-shifted+fluorescent+substrate+DDAOG%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">beta-Galactosidase activity assay using far-red-shifted fluorescent substrate DDAOG.</a> Analytical Biochemistry. 386 (1), 59-64 (2009).</li>
<li>Terman, A., Brunk, U. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofuscin%3A+Mechanisms+of+formation+and+increase+with+age%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%22%5BJournal%5D)">Lipofuscin: Mechanisms of formation and increase with age.</a> APMIS. 106 (2), 265-276 (1998).</li>
<li>Georgakopoulou, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+lipofuscin+staining+as+a+novel+biomarker+to+detect+replicative+and+stress-induced+senescence.+A+method+applicable+in+cryo-preserved+and+archival+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">Specific lipofuscin staining as a novel biomarker to detect replicative and stress-induced senescence. A method applicable in cryo-preserved and archival tissues.</a> Aging. 5 (1), 37-50 (2013).</li>
<li>Wang, B., Demaria, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quest+to+define+and+target+cellular+senescence+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The quest to define and target cellular senescence in cancer.</a> Cancer Research. 81 (24), 6087-6089 (2021).</li>
<li>Appelbe, O. K., Zhang, Q., Pelizzari, C. A., Weichselbaum, R. R., Kron, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-guided+radiotherapy+targets+macromolecules+through+altering+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Image-guided radiotherapy targets macromolecules through altering the tumor microenvironment.</a> Molecular Pharmaceutics. 13 (10), 3457-3467 (2016).</li>
<li>Maciorowski, Z., Chattopadhyay, P. K., Jain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+multicolor+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Basic multicolor flow cytometry.</a> Current Protocols in Immunology. 117, 1-38 (2017).</li>
<li>Fan, Y., Cheng, J., Zeng, H., Shao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+cell+depletion+through+targeting+BCL-family+proteins+and+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Senescent cell depletion through targeting BCL-family proteins and mitochondria.</a> Frontiers in Physiology. 11, 593630(2020).</li>
<li>Kim, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+senescent+cell+surface+targetable+protein+DPP4%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Identification of senescent cell surface targetable protein DPP4.</a> Genes and Development. 31 (15), 1529-1534 (2017).</li>
<li>Flor, A. C., Kron, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-derived+reactive+aldehydes+link+oxidative+stress+to+cell+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discovery%22%5BJournal%5D)">Lipid-derived reactive aldehydes link oxidative stress to cell senescence.</a> Cell Death Discovery. 7 (9), 2366(2016).</li>
<li>Jochems, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cancer+SENESCopedia%3A+A+delineation+of+cancer+cell+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">The Cancer SENESCopedia: A delineation of cancer cell senescence.</a> Cell reports. 36 (4), 109441(2021).</li>
<li>Fallah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxorubicin+and+liposomal+doxorubicin+induce+senescence+by+enhancing+nuclear+factor+kappa+B+and+mitochondrial+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Doxorubicin and liposomal doxorubicin induce senescence by enhancing nuclear factor kappa B and mitochondrial membrane potential.</a> Life Sciences. 232, 116677(2019).</li>
<li>Kasper, M., Barth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleomycin+and+its+role+in+inducing+apoptosis+and+senescence+in+lung+cells+-+modulating+effects+of+caveolin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Cancer+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Bleomycin and its role in inducing apoptosis and senescence in lung cells - modulating effects of caveolin-1.</a> Current Cancer Drug Targets. 9 (3), 341-353 (2009).</li>
<li>Muthuramalingam, K., Cho, M., Kim, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+and+EMT+crosstalk+in+bleomycin-induced+pathogenesis+of+pulmonary+fibrosis-an+in+vitro+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence and EMT crosstalk in bleomycin-induced pathogenesis of pulmonary fibrosis-an in vitro analysis.</a> Cell Biology International. 44 (2), 477-487 (2020).</li>
<li>Flor, A. C., Wolfgeher, D., Wu, D., Kron, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+signature+of+enhanced+lipid+metabolism%2C+lipid+peroxidation+and+aldehyde+stress+in+therapy-induced+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discovery%22%5BJournal%5D)">A signature of enhanced lipid metabolism, lipid peroxidation and aldehyde stress in therapy-induced senescence.</a> Cell Death Discovery. 3, 17075(2017).</li>
<li>Burd, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+tumorigenesis+and+senescence+in+vivo+with+a+p16%28INK4a%29-luciferase+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Monitoring tumorigenesis and senescence in vivo with a p16(INK4a)-luciferase model.</a> Cell. 152 (1-2), 340-351 (2013).</li>
<li>Liu, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+exhibiting+strong+p16+%28INK4a%29+promoter+activation+in+vivo+display+features+of+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cells exhibiting strong p16 (INK4a) promoter activation in vivo display features of senescence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2603-2611 (2019).</li>
<li>Wang, L., Lankhorst, L., Bernards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+senescence+for+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Exploiting senescence for the treatment of cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 22 (6), 340-355 (2022).</li>
<li>Baek, K. -H., Ryeom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+oncogene-induced+senescence+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection of oncogene-induced senescence in vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 1534, 185-198 (2017).</li>
<li>González-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Muñoz-Espín, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+assessing+cellular+senescence+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo.</a> The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden voor deze studie.

In de afgelopen tien jaar is flowcytometrie een gebruikelijker testplatform geworden in kankeronderzoek vanwege de opkomende populariteit van tumorimmunologie, de ontwikkeling van goedkopere flowcytometers en de verbetering van gedeelde instrumentatiefaciliteiten bij academische instellingen. Multicolor assays zijn nu standaard, omdat de meeste nieuwere instrumenten zijn uitgerust met violette, blauwgroene en rode tot verrode optische arrays. Dit DDAOG-protocol is dus waarschijnlijk compatibel met een breed scala aan flo...

Senescente cellen hopen zich normaal gesproken op in organismen gedurende de jaren tijdens normale biologische veroudering, maar kunnen zich ook snel ontwikkelen in tumorcellen als reactie op schade veroorzaakt door verschillende kankerbehandelingen, waaronder bestraling en chemotherapie. Hoewel ze niet langer prolifereren, kunnen door therapie geïnduceerde senescente (TIS) tumorcellen bijdragen aan de behandelingsresistentie en recidief veroorzaken 1,2,3. Factoren die door TIS-cellen worden uitgescheiden, kunnen de tumormaligniteit verergeren door immuunontwijking of metastasete bevorderen 4,5. TIS-cellen ontwikkelen complexe, contextspecifieke fenotypen, veranderde metabole profielen en unieke immuunresponsen 6,7,8. Daarom is de identificatie en karakterisering van TIS-tumorcellen geïnduceerd door verschillende kankerbehandelingsbenaderingen een onderwerp van voortdurende interesse voor de kankeronderzoeksgemeenschap.
Om TIS-tumorcellen te detecteren, worden conventionele senescentietests op grote schaal gebruikt, voornamelijk gebaseerd op het detecteren van verhoogde activiteit van het senescentiemarkerenzym, het lysosomale bèta-galactosidase GLB19. Detectie bij een bijna neutrale (in plaats van zure) lysosomale pH maakt specifieke detectie van senescentie-geassocieerde bèta-galactosidase (SA-β-Gal)10 mogelijk. Een standaard SA-β-Gal-test die al tientallen jaren wordt gebruikt, gebruikt X-Gal (5-broom-4-chloor-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), een blauw chromogeen bèta-galactosidase-substraat, om SA-β-Gal in vaste cellen te detecteren door lichtmicroscopie11. De X-Gal-test maakt de kwalitatieve visuele bevestiging van TIS mogelijk met behulp van algemeen beschikbare reagentia en laboratoriumapparatuur. Een basistransmissielichtmicroscoop is de enige instrumentatie die nodig is om de aanwezigheid van het blauwe chromogeen te evalueren. De X-Gal-kleuringsprocedure kan echter niet gevoelig zijn en soms meer dan 24 uur nodig hebben om de kleur te ontwikkelen. Kleuring wordt gevolgd door een subjectieve score met lage doorvoer van individuele senescente cellen op basis van het tellen van de cellen die een bepaald intensiteitsniveau van het blauwe chromogeen vertonen onder een lichtmicroscoop. Omdat X-Gal celdoordringbaar is, vereist deze test oplosmiddelvaste cellen, die niet kunnen worden teruggewonnen voor downstream-analyse. Bij het werken met beperkte monsters van dieren of patiënten kan dit een groot nadeel zijn.
Verbeterde SA-β-Gal-assays met behulp van celpermeant, fluorescerend enzymsubstraten, waaronder C12-FDG (5-dodecanoylaminofluoresceïne Di-β-D-Galactopyranoside, groen) en DDAOG (9H-(1,3-dichloor-9,9-dimethylacridin-2-one-7-yl) β-D-Galactopyranoside, verrood) zijn eerder in de literatuur verschenen 12,13,14,15. De chemische sondestructuur en optische eigenschappen van DDAOG zijn weergegeven in aanvullende figuur S1. Deze celpermeant sondes maken de analyse van levende (in plaats van vaste) cellen mogelijk, en fluorescerende in plaats van chromogene sondes vergemakkelijken het gebruik van snelle fluorescentieanalyseplatforms met hoge doorvoer, waaronder screeningsinstrumenten met hoge inhoud en flowcytometers. Sorteerstroomcytometers maken het herstel mogelijk van verrijkte populaties van levende senescente cellen uit celculturen of tumoren voor downstream-analyse (bijv. Western blotting, ELISA of 'omics'). Fluorescentieanalyse biedt ook een kwantitatief signaal, waardoor het percentage senescente cellen in een bepaald monster nauwkeuriger kan worden bepaald. Extra fluorescerende sondes, waaronder levensvatbaarheidsondes en fluorofoor-gelabelde antilichamen, kunnen gemakkelijk worden toegevoegd voor multiplexanalyse van doelen buiten SA-β-Gal.
Net als DDAOG is C12-FDG een fluorescerende sonde voor SA-β-Gal, maar de groene fluorescerende emissie overlapt met intrinsieke cellulaire AF, die ontstaat tijdens senescentie als gevolg van de accumulatie van lipofuscine-aggregaten in cellen16. Door gebruik te maken van de verrode DDAOG-sonde kan groene cellulaire AF worden gebruikt als secundaire parameter om senescentie te bevestigen17. Dit verbetert de betrouwbaarheid van de test door een tweede marker te gebruiken naast SA-β-Gal, die vaak onbetrouwbaar kan zijn als een enkele marker voor senescentie18. Omdat de detectie van endogene AF in senescente cellen een labelvrije benadering is, is het een snelle en eenvoudige manier om de specificiteit van onze op DDAOG gebaseerde test uit te breiden.
In dit protocol demonstreren we het gebruik van DDAOG en AF als een snelle, dual-parameter flowcytometrietest voor de identificatie van levensvatbare TIS-tumorcellen uit in vitro culturen of geïsoleerd uit met geneesmiddelen behandelde tumoren die bij muizen zijn vastgesteld (figuur 1). Het protocol maakt gebruik van fluoroforen die compatibel zijn met een breed scala aan standaard commerciële flowcytometrie-analysers en sorteerders (tabel 1). Kwantificering van het percentage levensvatbare senescente cellen met behulp van standaard flowcytometrieanalyse is mogelijk. Indien gewenst kan een optionele immunolabelingstap worden uitgevoerd om antigenen van het celoppervlak gelijktijdig met senescentie te evalueren. Geïdentificeerde senescente cellen kunnen ook worden verrijkt met behulp van de standaard fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) methodologie.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64176/64176fig01.jpg"> Figuur 1: Experimentele workflow. Een schematische samenvatting van de belangrijkste punten van de DDAOG-test. (A) Een TIS-inducerend geneesmiddel wordt toegevoegd aan gekweekte cellen van zoogdieren of toegediend aan tumordragende muizen. Er wordt dan tijd toegestaan voor het begin van TIS: voor cellen, 4 dagen na de behandeling; voor muizen, 22 dagen in totaal, met drie behandelingen om de 5 dagen plus 7 dagen herstel. Cellen worden geoogst of tumoren worden gedissocieerd in suspensie. (B) Monsters worden behandeld met Baf om de lysosomale pH aan te passen voor detectie van SA-β-Gal gedurende 30 minuten; vervolgens wordt de DDAOG-sonde gedurende 60 minuten toegevoegd om SA-β-Gal te detecteren. Monsters worden 2x gewassen in PBS en een levensvatbaarheidsvlek wordt kort toegevoegd (15 min). Optioneel kunnen monsters worden gekleurd met fluorescerende antilichamen in open fluorescentiekanalen en / of worden gefixeerd voor latere analyse. (C) Monsters worden geanalyseerd met behulp van een standaard flowcytometer. Levensvatbare cellen worden gevisualiseerd in dot plots met rode DDAOG (wat wijst op SA-β-Gal) versus groene autofluorescentie (lipofuscine). Een poort om het percentage TIS-cellen te bepalen wordt vastgesteld op basis van onbehandelde controlemonsters (niet weergegeven). Als een sorteercytometer (FACS) wordt gebruikt, kunnen TIS-cellen worden verzameld en teruggeplaatst in cultuur voor verdere in vitro assays of worden gelyseerd en verwerkt voor moleculaire biologie-assays. Afkortingen: DDAO = 9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-Galactoside; TIS = therapie-geïnduceerde senescentie; FL-Ab = fluorofoor-geconjugeerd antilichaam; Baf = Bafilomycine A1; SA-β-Gal = senescentie-geassocieerde bèta-galactosidase; PBS = fosfaatgebufferde zoutoplossing; FACS = fluorescentie-geactiveerde celsortering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64176/64176fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Fluorofoor</td>
			<td>Detecteert</td>
			<td>Ex /Em (nm)</td>
			<td>Cytometerlaser (nm)</td>
			<td>Cytometer detector / bandpass filter (nm)</td>
		</tr><tr><td>DDAOG</td>
			<td>SA-β-Gal</td>
			<td>645/6601</td>
			<td>640</td>
			<td>670 / 30</td>
		</tr><tr><td>Af</td>
			<td>Lipofuscine</td>
			<td>< 600</td>
			<td>488</td>
			<td>525 / 50</td>
		</tr><tr><td>Cv450</td>
			<td>Levensvatbaarheid</td>
			<td>408/450</td>
			<td>405</td>
			<td>450 / 50</td>
		</tr><tr><td>PE</td>
			<td>Antilichaam/oppervlaktemarker</td>
			<td>565/578</td>
			<td>561</td>
			<td>582 / 15</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Fluoroforen en cytometer optische specificaties. Cytometerspecificaties die in dit protocol worden gebruikt, worden vermeld voor een instrument met in totaal 4 lasers en 15 emissiedetectoren. DDAOG gedetecteerd bij 645/660 nm is de vorm van de sonde gesplitst door SA-β-Gal1. Uncleaved DDAOG kan een lage fluorescentie vertonen bij 460/610 nm, maar wordt verwijderd door wasstappen in het protocol. Afkortingen: DDAO = 9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-Galactoside; AF = autofluorescentie; PE = phycoerythrin; SA-β-Gal = senescentie-geassocieerde bèta-galactosidase.

<table><tbody><tr><td>Bafilomycin A1</td><td>Research Products International</td><td>B40500</td><td></td></tr><tr><td>Bleomycin sulfaat&nbsp;</td><td>Cayman</td><td>13877</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumine (BSA)</td><td>US Biological</td><td>A1380</td><td></td></tr><tr><td>Calcein Violet 450 AM levensvatbaarheidskleurstof</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>65-0854-39</td><td>eBioscience</td></tr><tr><td>DPP4-antilichaam, PE-conjugaat</td><td>Biolegend</td><td>137803</td><td>Clone H194-112</td></tr><tr><td>Cellijn: A549 menselijke longadenocarcinoom</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>Cellijn: B16-F10 muismelanoom</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-6475</td><td></td></tr><tr><td>Celschraper</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Celzeefjes, 100 &micro;m</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>DDAO-Galactoside</td><td>Life Technologies</td><td>D6488</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-medium 1x</td><td>Life Technologies</td><td>11960-069</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Doxorubicine, hydrochloride-injectie (USP)</td><td>Pfizer</td><td>NDC 0069-3032-20</td><td></td></tr><tr><td>Doxorubicine, PEG-gelipide (USP)</td><td>Sun Pharmaceutical</td><td>NDC 47335-049-40</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M</td><td>Life Technologies</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Etoposide&nbsp;</td><td>Cayman</td><td>12092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Omega&nbsp;</td><td>FB-11</td><td></td></tr><tr><td>Fc-receptorblokkeringsreagens</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td>Anti-muis CD16/32</td></tr><tr><td>Flowcytometer (celanalyser)</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>Verschillende</td><td>LSRFortessa</td></tr><tr><td>Flowcytometer (celsorteerder)</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>Verschillende</td><td>FACSAria</td></tr><tr><td>GlutaMax 100x</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Lonza</td><td>BW17737</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TL</td><td>Sigma</td><td>5401020001</td><td>Roche</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 16%</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine 100x</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) 1x</td><td>Corning</td><td>MT21031CV</td><td>Dulbecco's PBS (zonder calcium en magnesium)</td></tr><tr><td>Rainbow kalibratiedeeltjes, ultrakit</td><td>SpheroTech</td><td>UCRP-38-2K</td><td>3,5-3,9 &micro;m, 2E6/mL</td></tr><tr><td>RPMI-1640 medium 1x</td><td>Life Technologies</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride 0,9% (USP)</td><td>Baxter Healthcare Corporation</td><td>2B1324</td><td></td></tr><tr><td>Software voor cytometergegevensverwerving, "FACSDiva"</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>n/a</td><td>Contact BD voor licentie</td></tr><tr><td>Software voor cytometergegevensanalyse, "FlowJo"</td><td>TreeStar</td><td>n/a</td><td>Contact TreeStar voor licentie</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA 0,25%</td><td>Life Technologies</td><td>25200-114</td><td></td></tr></tbody></table>

verrode fluorescentie-geassocieerde β-galactosidase-sonde voor identificatie en verrijking van senescente tumorcellen door flowcytometrie

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated &#946;-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

Cellulaire senescentie is een toestand van proliferatieve arrestatie veroorzaakt door biologische schade die normaal gesproken in de loop van de jaren oploopt in ouder wordende cellen, maar ook snel kan ontstaan in tumorcellen als reactie op schade veroorzaakt door verschillende kankerbehandelingen. Tumorcelsenescentie wordt over het algemeen als ongewenst beschouwd, omdat senescente cellen resistent worden tegen de dood en tumorremissie blokkeren terwijl tumormaligniteit en behandelingsresistentie worden verergerd. Daarom is de identificatie van senescente tumorcellen van voortdurend belang voor de kankeronderzoeksgemeenschap. Er bestaan verschillende senescentietests, waarvan vele gebaseerd zijn op de activiteit van de bekende senescentiemarker, senescentie-geassocieerde bèta-galactosidase (SA-β-Gal). 
Typisch wordt de SA-β-Gal-test uitgevoerd met behulp van een chromogeen substraat (X-Gal) op vaste cellen, met de langzame en subjectieve opsomming van "blauwe" senescente cellen door lichtmicroscopie. Verbeterde testen met behulp van celpermeant, fluorescerende SA-β-Gal substraten, waaronder C12-FDG (groen) en DDAO-Galactoside (DDAOG; verrood), hebben de analyse van levende cellen mogelijk gemaakt en het gebruik van high-throughput fluorescerende analyseplatforms mogelijk gemaakt, inclusief flowcytometers. C12-FDG is een goed gedocumenteerde sonde voor SA-β-Gal, maar de groene fluorescerende emissie overlapt met intrinsieke cellulaire autofluorescentie (AF) die ontstaat tijdens senescentie als gevolg van de accumulatie van lipofuscineaggregaten. Door gebruik te maken van de verrode SA-β-Gal probe DDAOG, kan groene cellulaire autofluorescentie worden gebruikt als een secundaire parameter om senescentie te bevestigen, waardoor betrouwbaarheid aan de test wordt toegevoegd. De resterende fluorescentiekanalen kunnen worden gebruikt voor kleuring van de levensvatbaarheid van cellen of optionele fluorescerende immunolabeling.
Met behulp van flowcytometrie demonstreren we het gebruik van DDAOG en lipofuscine autofluorescentie als een dual-parameter assay voor de identificatie van senescente tumorcellen. Kwantificering van het percentage levensvatbare senescente cellen wordt uitgevoerd. Indien gewenst kan een optionele immunolabelingstap worden opgenomen om antigenen van het celoppervlak van belang te evalueren. Geïdentificeerde senescente cellen kunnen ook flowcytometrisch worden gesorteerd en verzameld voor downstream-analyse. Verzamelde senescente cellen kunnen onmiddellijk worden gelyseerd (bijvoorbeeld voor immunoassays of 'omics-analyse' ) of verder worden gekweekt.

Verschillende experimenten werden uitgevoerd om de vergelijkbaarheid van DDAOG met X-Gal en C12-FDG aan te tonen voor de detectie van senescentie door SA-β-Gal. Eerst werd X-Gal gebruikt om senescente B16-F10 melanoomcellen geïnduceerd door ETO te kleuren (figuur 2A). Een intense blauwe kleur ontwikkelde zich in een subset van met ETO behandelde cellen, terwijl andere cellen minder intense blauwe kleuring vertoonden. Morfologie werd vergroot in de meeste met ETO behandelde cellen....

Een protocol voor fluorescerende, flowcytometrische kwantificering van senescente kankercellen geïnduceerd door chemotherapiegeneesmiddelen in celkweek of in muizentumormodellen wordt gepresenteerd. Optionele procedures omvatten co-immunostaining, monsterfixatie om grote batch- of tijdpuntanalyse te vergemakkelijken en de verrijking van levensvatbare senescente cellen door flowcytometrische sortering.

Verrode fluorescentie-geassocieerde β-galactosidase-sonde voor identificatie en verrijking van senescente tumorcellen door flowcytometrie

Cellular senescence is a state of proliferative arrest induced by biological damage that normally accrues over years in aging cells but may also emerge ...

Ons multi-parameter flowcytometrieprotocol maakt snelle en verbeterde detectie van therapie-geïnduceerde senescentie in tumorcellen mogelijk, wat een voorwaarde is voor lopende studie in kankerbiologie en -therapie. Onze flowcytometrie senescentietest is sneller dan bestaande op microscopie gebaseerde assays. We gebruiken twee markers, in plaats van slechts één, om senescente cellen te identificeren, waardoor de betrouwbaarheid van de test wordt verbeterd.Cellen kunnen worden samengevoegd met fluorescerende antilichamen om extra interessante doelen te detecteren. Flowcytometriesortering kan worden gebruikt om populaties van senescente cellen te verrijken voor downstream-analyse. De test kan senescente cellen detecteren in gekweekte kankercellijnen of in hele tumormonsters na zachte dissociatie.Voordat u deze techniek probeert, is het belangrijk om bekend te zijn met de algemene operationele procedures van de flowcytometer die wordt gebruikt. Raadpleeg de tekst voor de aanbevolen specificaties van de flowcytometer. Een dag voorafgaand aan senescentie-inductie door geneesmiddelen, oogst de kankercellijncultuur met 0,25% trypsine EDTA.Plaats de cellen gedurende vijf minuten op 37 graden Celsius om trypsine te activeren en maak de celmonolaag los. Wanneer de monolaag zichtbaar is losgemaakt, neutraliseer trypsine door een gelijk volume van het volledige kweekmedium toe te voegen. Breng de celsuspensie over in een steriele conische buis.Tel de cellen met behulp van de standaard hemocytometermethode en registreer cellen per milliliter. Plaatcellen op één moment 10 tot de derde tot 10 keer 10 tot de derde cellen per vierkante centimeter in een standaard zes-well plastic kweekplaat. Incubeer de plaat een nacht bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide en vochtigheid.Behandel de cellen de volgende dag met het senescentie-inducerende middel van belang, zoals etoposide. Incubeer vervolgens gedurende vier dagen om het begin van senescentie mogelijk te maken. Onderzoek de cellen dagelijks onder een lichtmicroscoop op verwachte morfologische veranderingen.Na het begin van de senescentie, oogst de cellen door trypsine EDTA toe te voegen gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius. Wanneer de cellen worden gedissocieerd in suspensie, neutraliseer trypsine met een gelijk volume van het volledige medium. Breng elke put van celsuspensie over in een microcentrifugebuis van 1,7 milliliter.Tel de cellen opnieuw en aliquoteer een gelijk aantal cellen per monster in een nieuwe set buizen. Centrifugeer de buizen gedurende vijf minuten bij 1.000 g bij vier graden Celsius en verwijder het supernatant. Pas eerst de lysosomale pH van gekweekte celmonsters aan door een oplossing van één micromolaire bafilomycine A in DMEM aan de celpellet toe te voegen in een concentratie van één keer 10 tot de zesde cellen per milliliter en pipet om te mengen.Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius op een rotator met een lage snelheid. Voeg vervolgens DDAOG-stockoplossing met 10 microgram per milliliter toe aan de monsters zonder te wassen om te kleuren voor senescentie-geassocieerde bèta-galactosidase. Plaats op een rotator gedurende 60 minuten beschermd tegen direct licht.Net als voorheen, centrifugeer de buizen, verwijder het supernatant en was de pellet met een milliliter ijskoude 0,5% BSA in PBS. Voeg vervolgens 300 microliter verdunde Calcein Violet 450 AM-oplossing toe aan de gewassen celpellets. Incubeer gedurende 15 minuten op ijs in het donker.Breng de celmonsters over naar flowcytometrie-instrumentcompatibele buizen. Open in de data-acquisitiesoftware een violet kanaalhistogram en een verrood kanaal versus een groene kanaalpuntplot. Start cytometergegevensverzameling bij een lage innamesnelheid en plaats de positieve controlemonsters gekleurd met DDAOG op de innamepoort.Begin met het verzamelen van voorbeeldgegevens. Pas de kanaalspanningen zo aan dat meer dan 90% van de gebeurtenissen zich in elke plot bevinden. Wanneer alle instellingen optimaal zijn, registreert u 10.000 gebeurtenissen per monster.Plaats de met DDAOG gekleurde controlemonsters voor alleen het voertuig op de inlaatpoort. Start gegevensverzameling en noteer 10.000 gebeurtenissen per steekproef. Zoek naar een toename van autofluorescentie, of AF, en DDAO-galactoside signaal versus positieve controle.Sla de voorbeeldgegevens op in fcs-bestandsindeling en exporteer de bestanden naar een werkstationcomputer die is uitgerust met flowcytometrie-analysesoftware. Met behulp van cytometrie data analyse software, laad de fcs gegevensbestanden voor alle verkregen monsters. Om levensvatbare cellen te gateen, dubbelklikt u eerst op de voorbeeldgegevens voor het besturingselement voor alleen voertuigen om het gegevensvenster te openen.Visualiseer de gegevens als een violet kanaal histogram. De levensvatbare cellen gekleurd, gekleurd door CV 450, zijn gebaseerd op hun helderdere fluorescentie dan de dode cellen. Teken een poort met het gereedschap Histogram met één poort om alleen levensvatbare cellen op te nemen.Noem de poort levensvatbaar. Sleep vervolgens de Viable-poort naar de andere celmonsters vanuit het voorbeeldlay-outvenster om de poort uniform toe te passen. Open het venster Lay-out.Visualiseer in het venster Lay-out alle voorbeelden als violette kanaalhistogrammen. Controleer of levensvatbare celgating geschikt is voor monsters. Zo niet, pas dan indien nodig aan.Om vervolgens senescente cellen te gateen, dubbelklikt u op de gated viable cell data voor de vehicle-only control om het datavenster te openen. Visualiseer vervolgens de gegevens als een dot plot voor het verrode kanaal versus het groene kanaal. Teken een poort met het gereedschap Rectangle Gating om minder dan 5% van de DDAO-positieve en AF-positieve cellen uit het kwadrant rechtsboven op te nemen.Noem de poort Senescent. Sleep vervolgens de Senescent-poort naar de levensvatbare subset van alle samples uit het voorbeeldlay-outvenster om de poort uniform toe te passen. Sleep in het venster Lay-out alle levensvatbare cell-gated subsets naar en zet deze neer.Visualiseer alle levensvatbare monsters als ver-rode versus groene kanaalpuntplots en observeer de resultaten. Zorg ervoor dat de senescente poort zichtbaar is op alle percelen en dat de poort voor de voertuigbesturingen minder dan 5% senescente cellen vertoont. De analyse is nu afgerond.Gegevens kunnen nu naar wens worden geëxporteerd in grafisch en tabelformaat. Vergeleken met onbehandelde cellen vertoonden senescente B16-F10 melanoomcellen geïnduceerd door etoposide een vergrote morfologie en blauwe kleuring als gevolg van splitsing van X-gal door verhoogde senescentie-geassocieerde bèta-galactosidase. Kleuring van met etoposide behandelde cellen met fluorescerende C12FDG of DDAOG toonde vergelijkbare kleuringspatronen en intensiteitsvariaties als X-gal.Cellulaire autofluorescentie die overlapt met groene C12FDG-emissie bleek zich echter op te hopen in niet-gekleurde senescente cellen. Autofluorescentie daarentegen was typisch verwaarloosbaar in het verrode emissiebereik van DDAOG. Flowcytometer data-acquisitie-instellingen voor scatterplots, vijf-piek commerciële regenboog fluorescerende kalibratiemicrosferen en single-channel fluorescentiegegevens van gekleurde cellen worden hier weergegeven.DDAOG flowcytometer senescentietestgegevens voor B16-F10 melanoomcellen toonden aan dat therapie-geïnduceerde senescentie, of TIS, geïnduceerd door etoposide optrad in 35% van de levensvatbare cellen, en het senolytische middel ABT-263 elimineerde bijna TIS-cellen. In A549 longkankercellen verminderde bleomycine-geïnduceerde TIS in 66% van de levensvatbare cellen en ABT-263 het percentage tot 15. ABT-263 alleen was niet giftig voor onbehandelde prolifererende cellen.In een antilichaam co-kleuring assay toonde een histogram van PE-kanaalgegevens aan dat 42% van de met etoposide behandelde cellen positief waren voor de senescentiemarker DPPP4-positief. Verder gaf visualisatie met tweedimensionale dot plots aan dat 44% van de met etoposide behandelde cellen dubbel positief waren voor DDAOG en DPP4 versus 4% van de cellen met alleen voertuigen. Fixatie van DDAOG-gekleurde cellen werd vervolgens geëvalueerd.Vergeleken met niet-gefixeerde controlemonsters vertoonden vaste monsters een iets hogere achtergrond in onbehandelde cellen met een hoger percentage cellen dat scoorde als senescent in met BLM behandelde cellen. Dit effect werd ook waargenomen in vaste monsters die 's nachts en gedurende een week bij vier graden Celsius werden bewaard. Flowcytometrie sortering en validatie van verrijkte senescente celpopulaties door morfologie en proliferatiemarkers worden getoond.Gesorteerde senescente cellen vertoonden een vergrote morfologie, zoals verwacht, gevisualiseerd door actine te kleuren met fluorescerend falloïdine. Een vermindering van het signaal voor proliferatiemarker Ki67 werd ook waargenomen door immunofluorescente kleuring. Ten slotte werd de kwantificering van senescentie in tumoren behandeld met chemotherapiegeneesmiddelen beoordeeld.X-galkleuring in weefsels was relatief zwak, maar blauwe kleuring was duidelijk in tumoren behandeld met doxorubicine, of gepegyleerde liposomale doxorubicine, met name in tumoren die ook positief scoorden voor senescentie door DDAO-galactoside flow assay. Zoals verwacht vertoonden zoutoplossing-only tumoren verwaarloosbare senescentie. Hier, zoals bij elke levende celtest, moeten de protocolstappen efficiënt, maar voorzichtig worden uitgevoerd.Langdurige kleuringsprocedures of incubaties buiten de genoemde tijden moeten worden vermeden. Als senescente cellen flowcytometrisch worden gesorteerd, kunnen ze terug in cultuur worden geplaatst voor immunoassays, of gelyseerd, en verwerkt voor omics-analyse, inclusief transcriptomics of proteomics. Deze techniek heeft ons laboratorium en anderen in staat gesteld om nieuwe kenmerken van senescente tumorcellen te identificeren, waaronder kwantificering van DNA-schade, eiwitexpressie en veranderingen in het metabolisme.

far-red-fluorescent-senescence-associated-galactosidase-probe-for

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

This video illustrates a flow cytometry-based assay for quantifying therapy-induced senescent cancer cells with dual senescence markers. The detection and quantification of senescent cells involve using a β-galactosidase substrate. The substrate is cleaved by active lysosomal β-galactosidase within the senescent cells, producing a fluorescent product that, in conjunction with autofluorescent lipofuscin granules, marks the senescent cancer cells.

Flow Cytometry-Based Quantification of Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Of veroudering voorkomt of bevordert het ontstaan ​​van tumoren blijft controversieel. Sinds chemotherapeutische drugs kankercellen ertoe kunnen bewegen senesce, studeren veroudering is essentieel voor het voorstellen van nieuwe therapieën. De standaard en breed gebruikt β-galactosidase test geeft belangrijke nadelen. We stellen hier een snelle en gevoelige flowcytometrie gebaseerde bepaling senescentie kwantificeren.

Een gevoelige methode om Senescent kankercellen kwantificeren

Intracellulaire ROS heeft aangetoond dat een belangrijke rol spelen in de inductie van cellulaire senescentie. Hier beschrijven we een gevoelige assay voor het kwantificeren van ROS niveaus tijdens cellulaire senescentie. We bieden ook protocollen voor de beoordeling van het senescentie-geassocieerde secretoire fenotype, die naar verluidt aan verschillende leeftijdsgebonden disfuncties bijdraagt.

Een kwantitatieve meting van reactieve zuurstof soorten en senescentie-geassocieerde secretoire fenotype in normale menselijke fibroblasten tijdens oncogen-geïnduceerde senescentie

Cellulaire senescentie is de belangrijkste factor in de ontwikkeling van chronische leeftijdsgebonden pathologieën. Identificatie van therapeutische middelen die gericht zijn op senescentie cellen tonen belofte voor het verlengen van gezonde veroudering. Hier presenteren we een nieuwe assay voor de identificatie van senotherapeutica op basis van meting van senescentie geassocieerde β-galactosidase activiteit in enkelvoudige cellen.

Op SA-β-galactosidase gebaseerde screeningstest voor de identificatie van Senotherapeutische geneesmiddelen

Hier presenteren we een op flowcytometrie gebaseerde methode voor visualisatie en kwantificering van meerdere senescentie-geassocieerde markers in enkele cellen.

Gelijktijdige beeldvorming en flowcytometrie-gebaseerde detectie van meerdere fluorescerende senescentiemarkers in therapie-geïnduceerde senescente kankercellen

Dit protocol biedt gereflecteerd licht confocale microscopie voor objectieve, enkelceldetectie van senescence-geassocieerde bèta-galactosidase (SA-β-gal) activiteit in de stromale vasculaire fractie die is geïsoleerd uit menselijk vetweefsel. De methode is compatibel met immunocytochemie, bevat pH-controles voor kwantitatieve beoordeling en biedt bovendien een gevoeliger en minder subjectief alternatief voor conventionele SA-β-gal kleuring.

Senescentiedetectie met behulp van gereflecteerd licht in de vetachtige stromale vaatfractie

Dit artikel presenteert een levende-cel LysoTracker-protocol om lysosomale hervorming tijdens senescentie in IMR-90 menselijke fibroblasten te meten.

Lysosomale profilering met LysoTracker voor kwantitatieve beoordeling van cellulaire senescentie bij menselijke fibroblasten

Een efficiënte screening-protocol wordt gepresenteerd voor de identificatie van kleine moleculen ter bevordering van astroglial differentiatie in glioblastoma stamcellen (GSCs). De bepaling is gebaseerd op een stamcel differentiatie verslaggever waarbij de expressie van de verbeterde GFP (eGFP) wordt gedreven door de menselijke promotor van het algemeen kaderakkoord voor vrede.

Stroom Cytometry gebaseerde Drug Screening systeem voor de identificatie van kleine moleculen die bevordering van celdifferentiatie van Glioblastoma stamcellen

Dit protocol is te herstellen en zeldzame doelcellen een mengsel met de doelsoort achtergrond cellen voorbereiden moleculaire genetische karakterisering op het niveau van één cel. DNA kwaliteit is gelijk aan niet-behandelde afzonderlijke cellen en zorgt voor eencellige toepassing (beide screening gebaseerd en gerichte analyse).

Target cel pre verrijking en hele genoom versterking voor eencellige Downstream karakterisering

De experimentele procedure op de immunophenotyping van lymfkliertest orthotopic PDAC homografts is gericht op de profilering van de tumor immuno-communicatie. Tumoren zijn orthotopically geïmplanteerd via chirurgie. Tumoren van 200 – 600 mm3 in grootte werden geoogst en losgekoppeld om te bereiden eencellige schorsingen, gevolgd door multi immuun marker FACS analyse met behulp van verschillende fluorescently gelabelde antilichamen.

Immunophenotyping van Orthotopic Homograft (Syngeneic) van de alvleesklier ductaal adenocarcinoom lymfkliertest primaire KPC door Stroom Cytometry

Leer een snelle flowcytometrie-methode voor het detecteren van therapie-geïnduceerde senescentie in tumorcellen met dubbele markers. Deze techniek verbetert de betrouwbaarheid en maakt verrijking van senescente cellen voor verdere analyse mogelijk.

Verrode fluorescentie-geassocieerde β-galactosidase-sonde voor identificatie en verrijking van senescente tumorcellen door flowcytometrie (Video) | JoVE Journal

Verrode fluorescentie-geassocieerde β-galactosidase-sonde voor identificatie en verrijking van senescente tumorcellen door flowcytometrie

Meer video's verkennen