Organotypische retinale explantculturen van makaken

Het retinale model van primaten dat in deze studie is vastgesteld, bieden we het onderzoek naar het uitgebreide mechanisme en de therapeutische ontwikkeling van cGMP-PKG-afhankelijke retinale verslechtering. Dit individuele niet-menselijke primatenmodel reserveert retinale weefselbevestiging en intercellulaire interacties die een betere simulatie van in vivo omstandigheden mogelijk maken. Het vermindert ook het gebruik van dieren en het verkort de experimentele duur.

Het bieden van een controle-experimentele benadering voor het onderzoeken van retinale ontwikkeling of degeneratie. Begin met de bereiding van de retinale explantaten door de oogbollen geïsoleerd van wilde makaken gedurende 30 seconden te wassen met 10 milliliter 5% povidonjodium. Om bacteriële besmetting te voorkomen, dompelt u de oogbollen gedurende één minuut in een 5% penicilline streptomycine PBS-oplossing voordat u gedurende vijf minuten incubeert in 10 milliliter R16-medium.

Dompel de oogbollen vervolgens onder in 10 milliliter eiwit Ace-K-oplossing voorverwarmd op 37 graden Celsius en gedurende twee minuten geïncubeerd. Voer de volgende incubatie uit in 10 milliliter één op één R16 plus foetale runderserumoplossing gedurende vijf minuten. Geef een laatste wasbeurt in 10 milliliter verse R16.

Als u klaar bent, scheidt u de sclera, het hoornvlies, de iris, de lens en het glasachtig lichaam. Knip vervolgens het netvlies van vier kanten af met een pincet en een schaar. Gebruik vervolgens een vier milliliter boom fijn mes om de retinale explant te snijden op een 1,5 millimeter van de neuszijde, vier millimeter van de temporale kant en een twee millimeter van de superieure en inferieure zijden van de oogzenuwkop.

Snijd vervolgens met behulp van een zes millimeter boom fijn mes de centrale kant van de retinale explant met daarin de optische schijf en macula. Trek met behulp van een brede pipet aan de netvliesexplantatie met het netvlies en het vaatvlies en plaats deze in het midden van de insert met de fotoreceptorzijde naar boven. Dompel het netvlies volledig onder in één milliliter van het volledige medium op de plaat onder het membraan.

Kweek de retinale explantaten en plaats ze in een 37 graden Celsius incubator met bevochtigde 5% koolstofdioxide. Geef de juiste geneesmiddelconcentratiebehandeling aan explantaten gedurende vier dagen. Gebruik ten minste drie explantaten per behandelingsconditie en gebruik de explantaten zonder het medicijn als een positieve controle.

Voor fixatie en cryo-sectie, behandel de retinale explantaten met één milliliter paraform aldehyde gedurende 45 minuten. Na een korte spoeling met een milliliter PBS incubeer je de explantaten serieel in 10% sucrose gedurende 10 minuten, 20% sucrose gedurende 20 minuten en 30% sucrose gedurende 30 minuten. Snijd de retinale explantaten gelijkmatig met vier kwadranten in de periferie en zes millimeter in het midden.

Breng vervolgens de retinale explantaten over in een blikken doos van ongeveer 1,5 bij 1,5 bij 1,5 centimeter met een optimale snijtemperatuur samengesteld inbeddingsmedium dat de explant bedekt. Vries de weefselsecties onmiddellijk in vloeibare stikstof in en plaats ze in een koelkast van 20 graden voor opslag. Snijd vervolgens de agar in een klein blokje met het weefselmonster.

Snijd de blokken in blokken van 10 micrometer en plaats de secties op adhesiemicroscoopglaasjes met behulp van een zachte borstel. Droog de secties vervolgens 45 minuten bij 40 graden Celsius en bewaar ze bij min 80 graden Celsius tot gebruik. Voor cyclische guanosinemonofosfaat- of cGMP-kleuring tekent u een hydrofobe ring rond de gedroogde netvliessecties met een vloeistofblokkerpen en bedekt u de monsters.

Dompel de dia's gedurende 10 minuten onder in 200 microliter 0,3% PBS en Triton-X100 of PBST, gevolgd door een behandeling van een uur in 200 microliter blokkerende oplossing bij kamertemperatuur. Incubeer vervolgens de monsterglaasje 's nachts met de 200 microliter primair antilichaam bereid in de blokkerende oplossing bij vier graden Celsius en spoel het driemaal met PBS gedurende 10 minuten. Incubeer de dia in 200 microliter secundair antilichaam gedurende een uur bij kamertemperatuur.

Na drie keer wassen van PBS gedurende 10 minuten bedek de monsters met een antifade montagemedium dat DAPI bevat en bewaar het bij vier graden Celsius gedurende ten minste 30 minuten voordat het beeld wordt gemaakt. Droog de dia gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en trek met een vloeistofblokkerpen een waterafstotende barrièrering rond het netvliesweefselmonster. Na incubatie met 40 milliliter PBS gedurende 15 minuten behandel de secties met 42 milliliter 0,05 molaire tris-buffer of TBS bij 37 graden Celsius.

Zuig de TBS op, incuber de monsters met zes microliter proteïnase K gedurende vijf minuten en was de dia's driemaal met PBS gedurende vijf minuten. Stel de dia's bloot aan 40 milliliter ethanolazijnzuuroplossing in de chaplin. Bedek het met een transparant vel en incubeer vijf minuten bij min 20 graden Celsius.

Was de dia's driemaal met TBS gedurende telkens vijf minuten. Stel de dia's bloot aan 200 tot 300 microliter blokkeeroplossing of 1% BSA en incubeer ze gedurende een uur in een vochtigheidskamer. Geef bij ongeveer 130 microliter TMR-rode oplossing per dia en geef na een uur twee wasbeurten van 200 microliter PBS gedurende elk vijf minuten.

Plaats afdekplaten met één tot twee druppels antifade montagemedium met DAPI over de monsters en incuber de dia's bij vier graden Celsius gedurende ten minste 30 minuten voordat ze worden afgebeeld. Ga na sequentiële kleuring met tunnel en cGMP verder voor licht- en fluorescentiemicroscopie door de cameraparameters aan te passen. Leg de beelden van vier velden uit elke sectie vast met behulp van de software met een digitale camera met een vergroting van 20x.

Verkrijg representatieve foto's van de centrale delen van het netvlies met behulp van DAPI, EGFP en TMR met z-stack scanning en een interval van één micrometer en optioneel op 1.251 micrometer. In de retinale explantaten behandeld met verschillende concentraties van de PDE6-remmers Zaprinast was het aantal tunnel- en cGMP-positieve cellen sterk verhoogd in de buitenste nucleaire laag in vergelijking met de controlegroep. Het hoge percentage tunnelpositieve cellen suggereerde dat de toename van cGMP-activiteit de pre-nest geïnduceerde retinale celdegeneratie kan verbeteren en cGMP-accumulatie speelt een rol bij fotoreceptordegeneratie.

De voorbereiding van de explant moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd. Op dier strooien vijven en eventuele accumulatie omdat het de celoverleving verbetert en de status van vezels van bulkstapelreeksen verbetert. Voor een grootste mate zichtbaar moet het glasvocht worden gereinigd met steroïden.

Vermijd contact met de retinale zenuwvezellagen bij het overbrengen van retinale explantaten om mechanisch celletsel te voorkomen. Let op, om een soepele overdracht van retinale explantaten naar kweekinzetstukken uit te geven, kan het huisdier vooraf in iets worden gedrenkt om het vochtig te houden voordat het netvliesweefsel wordt overgebracht. Bovendien moet het hele proces worden uitgevoerd in de steroïde atmosfeer om besmetting tijdens het proces te voorkomen.