Studie van de functies en activiteiten van Neuronale K-Cl Co-Transporter KCC2 met behulp van Western Blotting

Dit protocol kan helpen om de mechanismen te begrijpen die betrokken zijn bij KCC2-regulatie door de fosforylering van kinasemoleculaire grootte direct te beoordelen, waardoor licht wordt geworpen op de fysiologische functies en activiteiten. Het kan worden gebruikt om moleculen zoals interessante eiwitten uit complexe mengsels van verwante moleculen te identificeren en te karakteriseren, zelfs als een eiwitexpressie erg klein is. De techniek is een essentieel hulpmiddel voor eiwitanalyse van complexe systemen en het identificeren van potentiële mechanismen die ten grondslag liggen aan een afwijkende weefselfunctie of ziekte.

De procedures worden gedemonstreerd door Sunday Solomon Josiah, een promovendus uit mijn laboratorium. Begin met het voorbewapenen van alle reagentia in het kraalbad van 37 graden Celsius en het volledig ontdooien van de stabiel getranseceerde rat KCC2b menselijke embryonale nier 293-cellen volledig in het kralenbad. Breng vervolgens de cellen van de cryoflaconbuis over in een centrifugebuis met vijf milliliter verse media en centrifugeer de cellen gedurende drie tot vijf minuten bij 1.200 g.

Na het aanzuigen van het supernatant met behulp van een aspiratorpipet die aan een vacuümpomp is bevestigd, resuspenseert u de cellen in 10 milliliter verse media. Breng de suspensie over op een schotelplaat van 10 centimeter en laat deze 48 uur groeien in een incubator met een temperatuur van 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Zodra de cellen 90% confluency bereiken, splits ze door de oude media aan te zuigen en ze te spoelen met twee milliliter PBS.

Voeg twee milliliter trypsine toe en incubeer ze ongeveer één tot twee minuten bij kamertemperatuur. Was de trypsinized cellen met twee milliliter van de volledige media. Voeg negen milliliter verse media toe aan de nieuwe gerechten.

Voeg vervolgens een milliliter oplossing van het oude gerecht toe aan het nieuwe gerecht. Breng de gesplitste celschalen gedurende 48 uur over naar de incubator om meer dan 90% samenvloeiing te bereiken. Behandel de cellen met dimethylsulfoxide, acht micromolaire staurosporine of 0,5 millimolair N-ethylmaleimide gedurende 15 minuten voordat u in lysisbuffer oogst.

Haal de media uit de getranseceerde kweekschaal, plaats de kweekschalen op ijs en was de cellen met ijskoude PBS. Adem de PBS aan en voeg 1,0 milliliter ijskoude lysisbuffer toe aan het gerecht. Nadat u de cellen van de bodem van de schaal hebt geschraapt met behulp van een koude plastic celschraper, brengt u de celsuspensie over in een microcentrifugebuis die op ijs is geplaatst, gevolgd door constante agitatie gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius.

Na het centrifugeren van de cellysaten in een koude centrifuge, plaatst u deze op ijs. Verzamel het supernatant in een voorgekoelde verse buis en gooi de pellet weg. Pipetteer 300 microliter Protein G Sepharose in een microcentrifugebuis.

Centrifugeer vervolgens de oplossing op 500 G gedurende twee minuten. Nadat u het supernatant hebt weggegooid, voegt u 500 microliter PBS en vortex goed toe. Gooi het supernatant na centrifugatie weg en herhaal de stap.

Meng vervolgens een milligram anti-KCC2 threonine 906 en anti-KCC2 threonine 1007 antilichamen met 200 microliter Protein G Sepharose kralen voordat u het volume tot 500 microliter met PBS maakt. Na twee uur schudden op een trillend platform of draaiend wiel bij vier graden Celsius, herhaal je twee wasbeurten met PBS. Voer eiwitkwantificering uit op de cellysaten en voeg één milligram van het cellysaat toe aan de gewassen kralen en incubeer in een end-to-end rotator voordat je naar beneden draait.

Geef drie wasbeurten met PBS die 150 millimol natriumchloride bevatten, gevolgd door drie wasbeurten met 200 microliter PBS voordat de uiteindelijke pellet in 100 microliter LDS-monsterbuffer wordt geresuspendeerd. Schud de buizen in een rotorschudder bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Incubeer ze in een verwarmingsblok en centrifugeer ze voordat je het supernatant gebruikt voor het laden van gel.

Monteer het Western Blot-gietapparaat en giet vers bereide 8% scheidingsgel om de gel te gieten, waardoor ongeveer twee centimeter ruimte vanaf de bovenkant van het gietglas ontstaat. Voeg 200 microliter absolute isopropanol toe aan de opstelling en laat het 60 minuten op kamertemperatuur staan. Verwijder de isopropanol met een pipet en spoel de gel voorzichtig af met ongeveer 200 microliter gedestilleerd water.

Na het toevoegen van vers bereide 6% stapelgel aan de gietopstelling, plaats je voorzichtig in de putkam en laat je 30 minuten op kamertemperatuur staan. Bevestig vervolgens de gegoten gel in de elektroforesetank. Nadat u de lopende buffer in de tank hebt gegoten, laadt u vijf microliter moleculaire gewichtsmarker in de eerste put en een gelijke hoeveelheid eiwit in elke put van de SDS-PAGE-gel.

Vul de lege putjes met LDS en laat de gel ongeveer 90 tot 120 minuten op 120 volt draaien. Hydrateer het nitrocellulosemembraan met transferbuffer die 20% methanol bevat. Spoel de gel en het membraan af met de transferbuffer en spreid ze voorzichtig uit op de bereidingsstapel.

Rangschik de over te brengen sandwich in deze volgorde: negatieve elektrode, sandwichschuim, filterpapier gespoelde SDS-PAGE-gel, gespoeld nitrocellulosemembraan, filterpapier, sandwichschuim, positieve elektrode. Als u klaar bent, stapelt u de gemonteerde sandwich in de overdrachtstank en draait u gedurende 90 minuten op 90 volt of 30 volt gedurende 360 minuten. Blokkeer het droge membraan gedurende een uur bij kamertemperatuur met behulp van een blokkerende buffer.

Incubeer de membranen met geschikte verdunningen van primair antilichaam en bèta-actine in blokkerende buffer gedurende één uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij vier graden Celsius. Geef vervolgens drie wasbeurten tbst gedurende elk vijf minuten. Incubeer het gewassen membraan met een secundair antilichaam verdund in een blokkerende buffer gedurende 60 minuten en herhaal drie wasbeurten van TBST.

Als u klaar bent, plaatst u het gewassen membraan op het beeldplaatje. Om de signalen te ontwikkelen, verspreidt u de oplossing bereid door gelijke volumes van elk verbeterd chemiluminescentieregenns op het membraan te mengen voordat u de beeldvormingskaart naar het beeldvormingssysteem overbrengt voor beeldvorming. De behandeling van HEK293-cellen met staurosporine en N-ethylmaleimide of NEM veroorzaakte verminderde fosforylering op SPAK-doellocaties, threonine 233 gelegen in het T-luskinasedomein en de S-lus fosforyleringsplaats serine 373 van endogene tot expressie gebracht SPAK.

Staurosporine verminderde de fosforylering van serine 940 in HEK294-cellen die KCC2b stabiel tot expressie brachten, maar NEM verhoogde de fosforylering aanzienlijk. Bovendien vermindert staurosporine de fosforylering op de threonine 505-site, terwijl NEM een lichte maar onbeduidende toename van fosforylering op dezelfde locatie veroorzaakte. De differentiële effecten van beide verbindingen op de fosforylering van eiwitkinase C op de threonine 505-site en KCC2b op de serine 940-site correleren goed.

Het representatieve resultaat toonde ook aan dat NEM een significante toename van de expressie van de totale KCC2-hoeveelheid veroorzaakte, terwijl de uitdrukking van de totale NKCC1 en SPAK niet significant veranderde wanneer ze met beide verbindingen werden behandeld. Bovendien veroorzaakten de twee verbindingen een verminderde fosforylering van SPAK op threonine 233 en serine 373 locaties, en dit correleerde met de verkorte fosforylering van respectievelijk threonine 906/1007 en threonine 203/207/212 en endogene uitgedrukte NKCC1. Bovendien verminderden en verhoogden staurosporine en NEM de fosforylering van eiwitkinase C op respectievelijk de serine 940-site en stabiel tot expressie gebracht KCC2b, wat correleerde met de vermindering en toename van de fosforylering van eiwitkinase C-delta op de threonine 505-site bij respectievelijk staurosporine- en NEM-behandeling.

Als een onjuist primair of secundair antilichaam wordt gebruikt, wordt de band niet gezien tijdens de beeldvorming. Ook is het signaal mogelijk niet zichtbaar als een te lage concentratie antilichaam wordt gebruikt. De techniek is een relevant hulpmiddel bij de kwantitatieve analyse van eiwitten en heeft het gebruik ervan voor vele wetenschappelijke en hulpbronnendoeleinden mogelijk gemaakt, waaronder als een effectief vroeg diagnostisch hulpmiddel.