Ontleedende cel-autonome functie van fragiele X mentale retardatie-eiwit in een auditief circuit door In Ovo-elektroporatie

Ons protocol is een in vivo methode om de cel-autonome functies van FMRP tijdens de ontwikkeling te onderzoeken. Dit kan helpen om de celtype-specifieke pathofysiologie van het fragiele X-syndroom te begrijpen. Deze methode maakt gebruik van fase-, plaats- en richtingsspecifieke elektroporatie van een geneesmiddelinduceerbaar vectorsysteem dat Fmr1 klein haarspeld-RNA bevat.

Met deze methode bereiken we de selectieve FMRP-knockdown in het auditieve circuit. Deze methode kan ook worden toegepast om de functie van andere genen in het auditieve circuit of het vestibulaire systeem te onderzoeken. Begin met het horizontaal plaatsen van de eieren om het embryo op de bovenkant van het ei te plaatsen voor eenvoudige manipulatie.

Incubeer bij 38 graden Celsius gedurende 46 tot 48 uur tot Hamburger en Hamilton, of HH stadium 12, voor neurale buistransfectie of gedurende 54 tot 56 uur tot HH 13 voor otocyste transfectie. Verwijder de eieren uit de broedmachine, een dozijn eieren per keer. Eieren langer dan een uur uit hun broedmachine houden, introduceert ontwikkelingsvariaties en vermindert de levensvatbaarheid.

Gebruik een zaklamp om licht van de bodem van het ei te werpen. De locatie van het embryo verschijnt als een donker gebied op de eierschaal. Markeer de locatie van het embryo op de eierschaal met een potlood.

Veeg de eieren af met gaas dat 75% ethanol bevat en boor een gat in het puntige uiteinde van de eieren met behulp van de schaarpunt. Verwijder vervolgens twee milliliter albumine met een naaldspuit van 18 gauge. Zorg ervoor dat het gat alleen groot genoeg is om de naald in te brengen.

Veeg eventuele lekkende albumine weg met gaas en sluit het gat af met doorzichtige tape. Bedek de bovenkant van de eieren met doorzichtige tape, gecentreerd op het met potlood gemarkeerde donkere gebied om scheuren te minimaliseren en vallend schelpafval tijdens het vensteren te voorkomen. Veeg alle operatiegereedschappen af met gaas dat 75% ethanol bevat en veeg het met tape bedekte gebied af met 75% ethanol.

Gebruik een kleine schaar om een venster van één tot twee vierkante centimeter rond de omtrek van het potloodmerk te knippen. Houd de schaar plat om te voorkomen dat het embryo eronder wordt beschadigd. Plaats het vensterei onder een stereomicroscoop met een 10X oogstuk en 2X zoom.

Vul een spuit van één milliliter met de inktoplossing en plaats vervolgens een naald van 27 gauge. Buig de naald in een hoek van 45 graden met een tang. Steek onder de microscoop voorzichtig vanaf de rand van het gebied opaqua en steek de naald onder het embryo in.

Injecteer ongeveer 50 microliter inkt, die onder het gebied pellucida diffundeert, voor embryovisualisatie. De inkt vormt een donkere achtergrond voor de heldere visualisatie van het embryo. Trek glazen haarvaten in pipetten met behulp van een pipettrekker.

Open onder een ontleedmicroscoop voorzichtig de punt van de capillaire naald tot 10 tot 20 micrometer in diameter met een tang. Bewaar de pipetten in een opbergdoos tot gebruik. Vul vervolgens een capillaire pipet met 0,5 tot 1 microliter van het plasmidemengsel door negatieve druk uit te oefenen door een rubberen buis aan het einde van de pipet met een spuit.

Leg het ei onder de microscoop zodat het embryo verticaal georiënteerd is met de staart bij je in de buurt. Houd de capillaire pipet met één hand of met de drieassige manipulator en drijf de punt van de pipet naar de rhombomeer 5 tot 6. in een staart-tot-kop richting.

Prik de punt voorzichtig door het vitellinmembraan en in de dorsale neurale buis en trek vervolgens de pipet een beetje terug zodat de punt in het lumen van de neurale buis zit. Injecteer het plasmidemengsel door luchtdruk uit te oefenen totdat het getinte plasmide volledig diffundeert in rhombomeer 5 tot 6 en zich uitstrekt tot rhombomeer 3 en rhombomeer 4. Controleer op een succesvolle injectie, die wordt bereikt wanneer de blauwe plasmide-oplossing snel door de neurale buis diffundeert zonder te lekken.

Wanneer er lekkage optreedt, vervaagt het blauw snel. Plaats onmiddellijk na de injectie een platina bipolaire elektrode aan weerszijden van de neurale buis. Lever twee pulsen van 12 volt en 50 milliseconden met een elektroporator.

Observeer luchtbellen aan de uiteinden van de bipolaire elektrode, met meer aan de negatieve kant. Controleer op succesvolle elektroporatie, die wordt bereikt wanneer het getinte plasmidemengsel het neurale buisweefsel in de buurt van de positieve kant van de elektrode binnendringt. Verwijder na elektroporatie voorzichtig de bipolaire elektrode.

Bedek het venster op de eierschaal met een stuk transparante film voorgesneden tot vierkanten van twee inch en besproeid met 75% ethanol. Leg het ei terug in de broedmachine. Reinig de bipolaire elektrode door 10 tot 20 pulsen van 12 volt en 50 milliseconden in zoutoplossing af te geven voordat u doorgaat naar het volgende ei.

Plaats het ei onder de microscoop zo dat het embryo verticaal is met de staart bij u in de buurt. Houd de capillaire pipet vast en prik de rechterotocyst voorzichtig in dorsolaterale richting. Injecteer het plasmidemengsel met luchtdruk totdat de otocyst is gevuld met een blauwe oplossing.

Controleer op een succesvolle injectie, die wordt bereikt wanneer het blauwe plasmidemengsel zich in de otocyste bevindt en niet lekt. Plaats onmiddellijk na de injectie de bipolaire elektrode op de otocyste en positioneer de positieve en negatieve zijden respectievelijk voor en achter de otocyste. Lever twee pulsen van 12 volt en 50 milliseconden met de elektroporator.

Controleer op succesvolle elektroporatie, die wordt bereikt wanneer het blauwe plasmidemengsel het weefsel van de otocyste in de buurt van de positieve kant van de elektrode binnendringt. Verwijder na elektroporatie voorzichtig de bipolaire elektrode en bedek het venster op de eierschaal met een transparante film. Breng ten slotte het ei terug naar de couveuse.

De representatieve afbeelding toont een voorbeeld van embryonale dag drie, of E3, na neurobuistransfectie en doxbehandeling op embryonale dag twee, of E2. Getransfecteerde cellen met Fmr1 shRNA en EGFP op de doorsnede worden hier weergegeven. EGFP-expresserende cellen waren beperkt tot één kant van de neurale buis en de hersenstam. Een doorsnede bij E15 met EGFP-expressing nucleus magnocellularis, of NM neuronen, aan de getransfecteerde kant wordt hier getoond.

Aan de contralaterale kant werden EGFP-bevattende axonen gezien in het ventrale deel van de nucleus laminaris, of NL. Het knockdown-effect van Fmr1 shRNA werd gevalideerd door duidelijke reducties in FMRP-immunoreactiviteit in getransfecteerde NM-neuronen in vergelijking met naburige niet-getransfecteerde neuronen. Het auditieve ganglion op E19 met FMRP-immunoreactiviteit wordt hier weergegeven. Auditieve ganglionneuronen waren niet getransfecteerd.

Sommige gliacellen afgeleid van de craniale neurale crest cellen werden getransfecteerd. De representatieve beelden tonen FMRP knock-down in het gehoorkanaal na otocyste transfectie. Auditieve kanalen op E9 vertoonden uitgebreide EGFP-fluorescentie.

Op dwarsdoorsnedes bevonden zich EGFP-expressiecellen in de basilaire papilla en het auditieve ganglion. Het knockdown-effect van Fmr1 shRNA werd gevalideerd door verminderde FMRP-immunoreactiviteit in getransfecteerde haarcellen in vergelijking met naburige niet-getransfecteerde haarcellen. Evenzo was FMRP-immunoreactiviteit grotendeels verminderd in getransfecteerde auditieve ganglionneuronen.

De centrale projectie van de getransfecteerde auditieve ganglionneuronen werd via de gehoorzenuw met gekarakteriseerde eindbulbterminals naar de hersenstam gevolgd. Tijdens het proberen van deze procedure is het belangrijkste om de plaats en richting van elektroporatie voor selectieve transfectie te regelen. Na deze procedure kan single cell type filling, immunostaining, cell sorting gevolgd door mass spectrum of single-cell sequencing worden uitgevoerd om de veranderingen op morfologische en biochemische niveaus te onthullen.

Deze techniek maakt ook selectieve bewerking van andere genen mogelijk met temporele controle en componentspecificiteit in het gehoor voor stamcircuits en kan worden aangepast om het vestibulaire systeem te manipuleren.