Name: Het identificeren van caspasen en hun motieven die eiwitten splitsen tijdens influenza A-virusinfectie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Leer hoe caspasen eiwitten splitsen tijdens Influenza A-virusinfectie in zoogdiercellen. Deze methode identificeert specifieke splitsingsplaatsen op gastheereiwitten zoals cortactine.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteur erkent Jennifer Tipper, Bilan Li, Jesse vanWestrienen, Kevin Harrod, Da-Yuan Chen, Farjana Ahmed, Sonya Mros, Kenneth Yamada, Richard Webby, de BEI Resources (NIAID), de Health Research Council van Nieuw-Zeeland, de Maurice and Phyllis Paykel Trust (Nieuw-Zeeland), de H.S. en J.C. Anderson Trust (Dunedin), en de Afdeling Microbiologie en Immunologie en School of Biomedical Sciences (Universiteit van Otago).

Wettelijke goedkeuringen werden verkregen van de University of Otago Institutional Biological Safety Committee om te werken met de IAV en zoogdiercellen. Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) of menselijke longalveolaire epitheliale A549-cellen en IAV H1N1-subtypen werden gebruikt voor deze studie. IAV werd gekweekt in kippeneieren, zoals elders beschreven17. Steriele en aseptische omstandigheden werden gebruikt om met zoogdiercellen te werken, en een bioveiligheidsniveau 2 (of fysieke insluiting 2) faciliteit en klasse II bioveiligheidskast werden gebruikt om met IAV-subtypen te werken.
1. Beoordeling van de splitsing of afbraak van eiwitten in met IAV geïnfecteerde cellen door caspasen
<ol><li>Zaad 3 x 105 MDCK- of A549-cellen per put in een 12-well celkweekplaat. OPMERKING: Als u MDCK-cellen gebruikt, zorg er dan voor dat het antilichaam tegen het eiwit van belang zijn hondensoorten herkent.</li>
	<li>Zaai de putten in paren, d.w.z. een controlepaar - een put voor het niet-geïnfecteerde- mock-monster en een voor het geïnfecteerde-mock-monster - en een testpaar- een put voor niet-geïnfecteerde-remmer A-monster en een voor de geïnfecteerde-remmer A-monster. Verhoog het aantal paren met elke extra remmer (zie referenties 7,8).</li>
	<li>Incubeer de cellen bij 37 °C onder een CO2-atmosfeer van 5% 's nachts.</li>
	<li>Infecteer de cellen de volgende dag met IAV (een H1N1-subtype of een ander subtype).<ol><li>Bereid hiervoor het virusoculum voor door de virusvoorraad te verdunnen in 400 μL serumvrij minimaal essentieel medium (MEM) (zie Materiaaltafel) bij een veelvoud van infectie (MOI) van 0,5-3,0 plaquevormende eenheden (pfu)/cel 7,11 (een factor van de verdubbeling van het celgetal bij het berekenen van de MOI). OPMERKING: Voor het infecteren van MDCK-cellen, vul het virusoculum aan met tosylfenylalanylchloorhyoketon (TPCK)-trypsine in een eindconcentratie van 1 μg / ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Verwijder het oude kweekmedium uit de cellen (stap 1.3) en was de cellen met 1 ml/putje serumvrij MEM 2x.</li>
	<li>Voeg 400 μL virusoculum (stap 1.4.1) toe aan de cellen en incubeer ze gedurende 1 uur bij 35 °C onder een CO2-atmosfeer van 5%.</li>
	<li>Verdun in de tussentijd een caspaseremmer (bijv. Z-DEVD-FMK), een lysosoomremmer (bijv. NH4Cl) of een proteasoomremmer (bijv. MG132) (zie materiaaltabel) met een eindconcentratie van respectievelijk 40 μM, 20 mM of 10 μM in serumvrij MEM7 (zie Materiaaltabel). De laatste twee remmers dienen als controle. Verdun een gelijk volume van het oplosmiddel (indien anders dan water) dat wordt gebruikt om een van de remmers als een mock in serumvrij medium te reconstitueren.</li>
	<li>Verwijder het virus entmateriaal en was de cellen zoals in stap 1.5 (1x).</li>
	<li>Voeg de serumvrije MEM, 1 ml/put, mock of aangevuld met een remmer, toe aan de cellen en incubeer de cellen zoals in stap 1.6. Dit tijdstip wordt beschouwd als 0 h infectie.</li>
	<li>Oogst na 24 uur de cellen door ze te schrapen met een 1 ml spuitzuiger (rubberen kant) en breng ze over in een polypropyleenbuis van 1,5 ml.</li>
	<li>Centrifugeer de buis bij 12.000 x g gedurende 1-2 minuten bij kamertemperatuur. Verzamel het supernatant met een pipet. OPMERKING: Dit supernatant kan worden weggegooid of worden gebruikt voor een plaquetest8 om de titer van het vrijgegeven virus nageslacht te meten.</li>
	<li>Was de celpellet met 250 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) door hercentrifugering zoals in stap 1.11.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en lyseer de cellen door 80-100 μL cellysebuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5% natriumdodecylsulfaat (SDS), 0,5% natriumdeoxycholaat, 1% Triton X-100 en 1x proteaseremmercocktail toe te voegen, zie Materiaaltabel) en vortexing.</li>
	<li>Verwarm de buis gedurende 10 minuten op 98 °C om volledig te lyseren en bereid het totale cellysaat voor. Bewaar de lysaten bij 4 °C voor het uitvoeren van stappen 1.15-1.17 de volgende dag, maar voor het beste resultaat, voltooi deze stappen op dezelfde dag.</li>
	<li>Schat de eiwithoeveelheid in elk monster met behulp van een BCA-testkit (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Los gelijke hoeveelheden eiwit uit niet-geïnfecteerde en geïnfecteerde monsters op door standaard SDS-polyacrylamide gel-elektroforese (SDS-PAGE)11 samen met moleculaire gewichtsmarkers11.</li>
	<li>Breng het eiwit over naar een nitrocellulose- of polyvinylideendifluoride (PVDF)-membraan (zie Materiaal tabel). OPMERKING: PVDF-membraan kan een hoge achtergrond geven in sommige western blot-imagers; controleer op compatibiliteit.</li>
	<li>Voer western blotting uit om het eiwit van belang te detecteren met behulp van de elders beschreven methode11.</li>
	<li>Vergelijk de eiwitniveaus in de met mock behandelde en met remmers behandelde geïnfecteerde monsterstroken. OPMERKING: Als het eiwitgehalte is hersteld in de met caspaseremmers behandelde geïnfecteerde monsterstrook, wordt het eiwit gesplitst of afgebroken door caspasen. Anders wordt het afgebroken door lysosoom of proteasoom.</li>
	<li>Kwantificeer het eiwitherstel door de bandintensiteit in elke baan te meten van ten minste drie replicaties van hetzelfde experiment en deze te normaliseren met de overeenkomstige belastingscontroleband.</li>
	<li>Gebruik een hedendaagse imager en bijbehorende software (zie Tabel van materialen) om de western blots in beeld te brengen en het eiwitherstel te kwantificeren.</li>
</ol>2. Bevestiging van caspase-gemedieerde splitsing of afbraak van eiwitten in IAV-geïnfecteerde cellen door RNA-interferentie
<ol><li>Ontwerp of verkrijg een pre-design klein-interfererend RNA (siRNA) gericht op honden of menselijke caspase 3, caspase 6 en caspase 7 (beul caspases1) en een niet-gerichte controle siRNA (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Lever elk siRNA aan MDCK- of A549-cellen door omgekeerde transfectie 8,11.</li>
	<li>Verdun hiervoor in afzonderlijke buizen 100 nM controlesiRNA of caspase siRNA of een aanbevolen volume transfectiereagens (zie Materiaaltabel) in 100 μL geschikt medium (zoals OptiMEM, zie Materiaaltabel) en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Bereid elke verdunning in tweevoud voor. OPMERKING: Dit duplicaat bevat een replicaat voor het analyseren van de knockdown van caspase-expressie door RT-qPCR of western blotting (als antilichamen tegen caspasen beschikbaar zijn) en een andere voor het beoordelen van het herstel van het eiwit van belang door western blotting.</li>
	<li>Meng 100 μL van elke siRNA-oplossing met 100 μL transfectiereagensoplossing (stap 2.3) en incubeer gedurende 20-45 minuten bij kamertemperatuur om het siRNA-transfectiereagenscomplex te vormen.</li>
	<li>Splits en voeg ondertussen 1 x 105 MDCK- of A549-cellen toe in 800 μL van het volledige groeimedium, meng met 200 μL siRNA-transfectiereagenscomplex (stap 2.5) en voeg 1 ml van de suspensie toe aan een put van een 12-wells kweekplaat. Deze verdunning brengt de uiteindelijke concentratie van controle siRNA of caspase siRNA op 10 nM.</li>
	<li>Incubeer de cellen bij 37 °C onder een 5% CO2 atmosfeer gedurende 72 uur.</li>
	<li>Oogst de cellen van één replicaat zoals in stap 1.10 en verwerk ze om de knockdown van de expressie van caspase 3, caspase 6 en caspase 7 te valideren of te bevestigen, respectievelijk door RT-qPCR of western blotting, met behulp van standaardmethoden en protocollen 8,11.</li>
	<li>Infecteer de cellen in de andere replicaat met IAV zoals beschreven in stap 1.4-1.9 (zonder remmers).</li>
	<li>Na 24 uur, oogst, verwerk en analyseer de cellen door western blotting en meet en kwantificeer het eiwitherstel zoals beschreven in stappen 1.10-1.20.</li>
</ol>3. Plaatsgerichte mutagenese voor het lokaliseren van de caspase-splitsingsplaats(en) in het polypeptide
<ol><li>Kloon het gencoderende eiwit dat van belang is voor een zoogdierexpressieplasmide11 of verkrijg het uit een onderzoekslaboratorium of commerciële bron (zie Materiaaltabel). OPMERKING: Het heeft de voorkeur als het gen wordt gekloond met een epitooptag of als GFP-fusie om het ectopisch tot expressie gebrachte polypeptide te onderscheiden van het endogene tot expressie gebrachte polypeptide tijdens western blotting.</li>
	<li>Met behulp van caspase-substraatdatabases4 of eiwituitlijningstools, lokaliseer je de consensus caspase-splitsingsmotieven, XXXD en DXXD, op het polypeptide. Bijna alle caspase cleavage motieven bezitten het asparaginezuur op de splitsingsplaats (P1)3,4.</li>
	<li>Muteer het vermeende P1-asparaginezuur tot glutaminezuur of een niet-polair aminozuur (alanine, valine) door plaatsgerichte mutagenese gevolgd door DNA-sequencing11 met behulp van standaardmethoden en protocollen.</li>
	<li>Lever het wild-type (WT) en mutant plasmide-DNA aan MDCK- of A549-cellen door omgekeerde transfectie11.<ol><li>Verdun hiervoor 2 μg plasmide-DNA of een aanbevolen volume van het transfectiereagens in 100 μL van een geschikt medium (zie stap 2.3 en Materiaaltabel) in afzonderlijke buizen en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Meng 100 μL van elke plasmide-DNA-oplossing met 100 μL van de transfectiereagentia-oplossing en incubeer gedurende 20-45 minuten bij kamertemperatuur om het DNA-transfectiereagenscomplex te vormen.</li>
	</ol></li>
	<li>Splits in de tussentijd 3 x 105 MDCK- of A549-cellen aan 800 μL van het volledige groeimedium, meng met 200 μL DNA-transfectiereagenscomplex en voeg de 1 ml suspensie toe aan een put van een 12-well kweekplaat.</li>
	<li>Incubeer de cellen bij 37 °C onder een 5% CO2 atmosfeer.</li>
	<li>Infecteer na 48 uur de cellen met IAV zoals beschreven in stap 1.4-1.9 (zonder de remmers toe te voegen).</li>
	<li>Na 24 uur, oogst, verwerk en analyseer de cellen door western blotting (indien van toepassing, met behulp van het antilichaam tegen een epitoop tag of GFP). Meet en kwantificeer vervolgens het eiwitherstel zoals beschreven in stap 1.10-1.20.</li>
</ol>

<ol><li>Place, D. E., Lee, S., Kanneganti, T. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PANoptosis+in+microbial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">PANoptosis in microbial infection.</a> Current Opinion in Microbiology. 59, 42-49 (2021).</li>
<li>Zheng, M., Kanneganti, T. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+the+ZBP1-NLRP3+inflammasome+and+its+implications+in+pyroptosis%2C+apoptosis%2C+and+necroptosis+%28PANoptosis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The regulation of the ZBP1-NLRP3 inflammasome and its implications in pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis).</a> Immunological Reviews. 297 (1), 26-38 (2020).</li>
<li>Connolly, P. F., Fearnhead, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+hijacking+of+host+caspases%3A+An+emerging+category+of+pathogen-host+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Viral hijacking of host caspases: An emerging category of pathogen-host interactions.</a> Cell Death & Differentiation. 24 (8), 1401-1410 (2017).</li>
<li>Julien, O., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases+and+their+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Caspases and their substrates.</a> Cell Death & Differentiation. 24 (8), 1380-1389 (2017).</li>
<li>Balachandran, S., Rall, G. F., Gack, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benefits+and+perils+of+necroptosis+in+influenza+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Benefits and perils of necroptosis in influenza virus infection.</a> Journal of Virology. 94 (9), 01101-01119 (2020).</li>
<li>Ampomah, P. B., Lim, L. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+virus-induced+apoptosis+and+virus+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Influenza A virus-induced apoptosis and virus propagation.</a> Apoptosis. 25 (1-2), 1-11 (2020).</li>
<li>Chen, D. Y., Husain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-mediated+degradation+of+host+cortactin+that+promotes+influenza+A+virus+infection+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Caspase-mediated degradation of host cortactin that promotes influenza A virus infection in epithelial cells.</a> Virology. 497, 146-156 (2016).</li>
<li>Galvin, H. D., Husain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+virus-induced+host+caspase+and+viral+PA-X+antagonize+the+antiviral+host+factor%2C+histone+deacetylase+4%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Influenza A virus-induced host caspase and viral PA-X antagonize the antiviral host factor, histone deacetylase 4.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (52), 20207-20221 (2019).</li>
<li>Husain, M., Harrod, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+virus-induced+caspase-3+cleaves+the+histone+deacetylase+6+in+infected+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Influenza A virus-induced caspase-3 cleaves the histone deacetylase 6 in infected epithelial cells.</a> FEBS Letters. 583 (15), 2517-2520 (2009).</li>
<li>Husain, M., Cheung, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+6+inhibits+influenza+A+virus+release+by+downregulating+the+trafficking+of+viral+components+to+the+plasma+membrane+via+its+substrate%2C+acetylated+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase 6 inhibits influenza A virus release by downregulating the trafficking of viral components to the plasma membrane via its substrate, acetylated microtubules.</a> Journal of Virology. 88 (19), 11229-11239 (2014).</li>
<li>Chen, D. Y., Husain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-mediated+cleavage+of+human+cortactin+during+influenza+A+virus+infection+occurs+in+its+actin-binding+domains+and+is+associated+with+released+virus+titres%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Caspase-mediated cleavage of human cortactin during influenza A virus infection occurs in its actin-binding domains and is associated with released virus titres.</a> Viruses. 12 (1), 87(2020).</li>
<li>Zhirnov, O. P., Syrtzev, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+pathogenicity+is+determined+by+caspase+cleavage+motifs+located+in+the+viral+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Genetic+Medicine%22%5BJournal%5D)">Influenza virus pathogenicity is determined by caspase cleavage motifs located in the viral proteins.</a> Journal of Molecular and Genetic Medicine. 3 (1), 124-132 (2009).</li>
<li>Zhirnov, O. P., Klenk, H. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+caspase+cleavage+motifs+of+NP+and+M2+proteins+attenuate+virulence+of+a+highly+pathogenic+avian+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Alterations in caspase cleavage motifs of NP and M2 proteins attenuate virulence of a highly pathogenic avian influenza virus.</a> Virology. 394 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Zhirnov, O. P., Konakova, T. E., Garten, W., Klenk, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-dependent+N-terminal+cleavage+of+influenza+virus+nucleocapsid+protein+in+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Caspase-dependent N-terminal cleavage of influenza virus nucleocapsid protein in infected cells.</a> Journal of Virology. 73 (12), 10158-10163 (1999).</li>
<li>Robinson, B. A., Van Winkle, J. A., McCune, B. T., Peters, A. M., Nice, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-mediated+cleavage+of+murine+norovirus+NS1%2F2+potentiates+apoptosis+and+is+required+for+persistent+infection+of+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Caspase-mediated cleavage of murine norovirus NS1/2 potentiates apoptosis and is required for persistent infection of intestinal epithelial cells.</a> PLOS Pathogens. 15 (7), 1007940(2019).</li>
<li>Richard, A., Tulasne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+cleavage+of+viral+proteins%2C+another+way+for+viruses+to+make+the+best+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Caspase cleavage of viral proteins, another way for viruses to make the best of apoptosis.</a> Cell Death & Disease. 3 (3), 277(2012).</li>
<li>Brauer, R., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+propagation+in+embryonated+chicken+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Influenza virus propagation in embryonated chicken eggs.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), e52421(2015).</li>
<li>Lüthi, A. U., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CASBAH%3A+A+searchable+database+of+caspase+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The CASBAH: A searchable database of caspase substrates.</a> Cell Death & Differentiation. 14 (4), 641-650 (2007).</li>
<li>Kumar, S., van Raam, B. J., Salvesen, G. S., Cieplak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+cleavage+sites+in+the+human+proteome%3A+CaspDB%2C+a+database+of+predicted+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Caspase cleavage sites in the human proteome: CaspDB, a database of predicted substrates.</a> PLoS One. 9 (10), 110539(2014).</li>
<li>Igarashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CutDB%3A+A+proteolytic+event+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research.+35+%28Database+issue%29%22%5BJournal%5D)">CutDB: A proteolytic event database.</a> Nucleic Acids Research. 35 (Database issue). 35, 546-549 (2007).</li>
<li>Crawford, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DegraBase%3A+A+database+of+proteolysis+in+healthy+and+apoptotic+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The DegraBase: A database of proteolysis in healthy and apoptotic human cells.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 12 (3), 813-824 (2013).</li>
<li>Rawlings, N. D., Tolle, D. P., Barrett, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEROPS%3A+The+peptidase+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">MEROPS: The peptidase database.</a> Nucleic Acids Research. 32, Database issue 160-164 (2004).</li>
<li>Lange, P. F., Overall, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopFIND%2C+a+knowledgebase+linking+protein+termini+with+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">TopFIND, a knowledgebase linking protein termini with function.</a> Nature Methods. 8 (9), 703-704 (2011).</li>
<li>Fortelny, N., Yang, S., Pavlidis, P., Lange, P. F., Overall, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+TopFIND+3.0+with+TopFINDer+and+PathFINDer%3A+Database+and+analysis+tools+for+the+association+of+protein+termini+to+pre-+and+post-translational+events%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Proteome TopFIND 3.0 with TopFINDer and PathFINDer: Database and analysis tools for the association of protein termini to pre- and post-translational events.</a> Nucleic Acids Research. 43, Database issue 290-297 (2015).</li>
</ol>

De auteur heeft geen belangenconflicten te onthullen.

Het is vastgesteld dat virussen de gastheerfactoren en -paden in hun voordeel afstemmen. Op hun beurt weerstaan de gastheercellen dat door verschillende strategieën toe te passen. Een van die strategieën is PANoptosis, die gastheercellen gebruiken als een antivirale strategie tegen virusinfecties. Virussen zoals IAV hebben echter hun eigen strategieën ontwikkeld om PANoptosis tegen te gaan en in hun voordeel te exploiteren 1,3,6...

Influenza A-virus (IAV) is het prototypische lid van de Orthomyxoviridae-familie en staat erom bekend wereldwijde epidemieën en onvoorspelbare pandemieën te veroorzaken. IAV veroorzaakt menselijke ademhalingsziekte, influenza, algemeen bekend als "griep". De griep is een acute ziekte die resulteert in de inductie van gastheer pro- en anti-inflammatoire aangeboren immuunresponsen en de dood van epitheelcellen in de menselijke luchtwegen. Beide processen worden beheerst door een fenomeen dat geprogrammeerde celdood1 wordt genoemd. De signalering voor geprogrammeerde celdood wordt geïnduceerd zodra verschillende pathogeenherkenningsreceptoren de binnenkomende virusdeeltjes in gastheercellen detecteren. Dit leidt tot de programmering van de dood van geïnfecteerde cellen en signalering aan de naburige gezonde cellen door drie onderling verbonden paden genaamd pyroptose, apoptose en necroptose - onlangs bedacht als één proces, PANoptosis1.
PANoptosis omvat de proteolytische verwerking van veel gastheer- en virale eiwitten van inductie tot uitvoering. Een dergelijke verwerking van eiwitten wordt voornamelijk geleid door een familie van cysteïneproteasen genaamd caspases 1,2. Er zijn maximaal 18 caspasen (van caspase 1 tot caspase 18) bekend3. De meeste caspasen worden uitgedrukt als pro-caspasen en geactiveerd door hun eigen proteolytische verwerking te ondergaan, hetzij door autokatalyse of andere caspasen4 als reactie op een stimulus zoals een virusinfectie. De PANoptosis van IAV-geïnfecteerde cellen werd beschouwd als een gastheerverdedigingsmechanisme, maar IAV heeft manieren ontwikkeld om het te ontwijken en te exploiteren om de replicatie ervan te vergemakkelijken 1,2,5,6. Een daarvan is om de gastheerfactoren te antagoniseren via caspase-gemedieerde splitsing of afbraak die inherent antiviraal zijn of interfereren met een van de stappen van de IAV-levenscyclus. Hiertoe zijn gastheerfactoren, cortactine, HDAC4 en HDAC6 ontdekt om caspase-gemedieerde splitsing of afbraak te ondergaan in IAV-geïnfecteerde epitheelcellen 7,8,9. De HDAC4 en HDAC6 zijn anti-IAV-factoren 8,10 en cortactine interfereert met IAV-replicatie in een later stadium van infectie, mogelijk tijdens virale assemblage en ontluikende11.
Daarnaast worden ook verschillende caspasen geactiveerd, die op hun beurt meerdere eiwitten splitsen om de ontstekingsreactie van de gastheer tijdens IAV-infectie te activeren 1,2. Bovendien ondergaan nucleoproteïne (NP), ionkanaal M2-eiwit van IAV 12,13,14 en verschillende eiwitten van andere virussen 3,15,16 ook caspase-gemedieerde splitsing tijdens infectie, wat de virale pathogenese beïnvloedt. Daarom is er een voortdurende behoefte om caspase-gemedieerde splitsing of afbraak van gastheer- en virale eiwitten tijdens IAV en andere virusinfecties te bestuderen om de moleculaire basis van virale pathogenese te begrijpen. Hierin worden de methoden gepresenteerd om (1) de splitsing of afbraak van dergelijke eiwitten door caspasen te beoordelen, (2) die caspasen te identificeren en (3) de splitsingsplaatsen te lokaliseren.

<table><tbody><tr><td>A549 cellen</td><td>ATCC</td><td>CRM-CCL-185</td><td>Mens, epitheel, long</td></tr><tr><td>Ammoniumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Caspase 3-remmer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>264156-M</td><td>Ook bekend als 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem'</td></tr><tr><td>cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Geitenanti-NP-antilichaam</td><td></td><td></td><td>Gift van Richard Webby (St Jude Children&rsquo;s Research Hospital, Memphis, USA) aan MH</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfectiereagens</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX Transfectiereagens</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>MDCK cellen</td><td>ATCC</td><td>CCL-34</td><td>Hond, epitheel, nier</td></tr><tr><td>MG132</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7449</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium (MEM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11095080</td><td>Voeg L-glutamine, antibiotica of andere supplementen toe zoals vereist</td></tr><tr><td>MISSION siRNA Universal Negative Control #1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIC001</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Fc imager met Image Studio Lite software 5.2&nbsp;</td><td>LI-COR</td><td></td><td>Odyssey Fc is vervangen door Odyssey XF en Image Studio Lite software is vervangen door Empiria Studio software.</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid dat menselijk cortactin-GFP-fusie-nbsp; uitdrukt</td><td>Addgene</td><td>50728</td><td>Gift van Kenneth Yamada aan Addgene</td></tr><tr><td>Vooruit ontworpen kleine interfererende RNA (siRNA) naar caspase 3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NM_004346</td><td>siRNA ID: SASI_Hs01_00139105</td></tr><tr><td>Vooruit ontworpen kleine interfererende RNA naar caspase 6</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NM_001226</td><td>siRNA ID: SASI_Hs01_00019062</td></tr><tr><td>Vooruit ontworpen kleine interfererende RNA naar caspase 7</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NM_001227</td><td>siRNA ID: SASI_Hs01_00128361</td></tr><tr><td>Vooruit ontworpen SYBR Green RT-qPCR Primer paren</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>KSPQ12012</td><td>Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1</td></tr><tr><td>Protran Premium nitrocellulose membraan</td><td>Cytiva (Voorheen GE Healthcare)</td><td>10600003</td><td></td></tr><tr><td>Konijnenanti-actine antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab8227</td><td></td></tr><tr><td>Konijnenanti-cortactin antilichaam</td><td>Cell Signaling</td><td>3502</td><td></td></tr><tr><td>Konijnenanti-GFP antilichaam</td><td>Takara</td><td>632592</td><td></td></tr><tr><td>SeeBlue Vooraf gekleurde eiwitstandaard</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC5625</td><td></td></tr><tr><td>Transfectiemedium, Opti-MEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsine, TPCK-behandeld</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4370285</td><td></td></tr></tbody></table>

het identificeren van caspasen en hun motieven die eiwitten splitsen tijdens influenza a-virusinfectie

Identifying Caspases and their Motifs that Cleave Proteins During Influenza A Virus Infection

Caspases, een familie van cysteïneproteasen, orkestreert geprogrammeerde celdood als reactie op verschillende stimuli, waaronder microbiële infecties. Aanvankelijk beschreven als optredend door apoptose, is nu bekend dat geprogrammeerde celdood drie onderling verbonden paden omvat: pyroptose, apoptose en necroptose, samen bedacht als één proces, PANoptosis. Invloed Een virusinfectie (IAV) induceert PANoptosis in zoogdiercellen door de activering van verschillende caspasen te induceren, die op hun beurt verschillende gastheer- en virale eiwitten splitsen, wat leidt tot processen zoals de activering van de aangeboren antivirale respons van de gastheer of de afbraak van antagonistische gastheereiwitten. In dit verband is caspase 3-gemedieerde splitsing van gastheercorticactine, histondeacetylase 4 (HDAC4) en histondeacetylase 6 (HDAC6) ontdekt in zowel dierlijke als menselijke epitheelcellen als reactie op de IAV-infectie. Om dit aan te tonen, werden remmers, RNA-interferentie en plaatsgerichte mutagenese gebruikt, en vervolgens werden de splitsing of resistentie tegen splitsing en het herstel van cortactine, HDAC4 en HDAC6 polypeptiden gemeten door western blotting. Deze methoden, in combinatie met RT-qPCR, vormen een eenvoudige maar effectieve strategie om de gastheer te identificeren, evenals virale eiwitten die caspase-gemedieerde splitsing ondergaan tijdens een infectie van IAV of andere menselijke en dierlijke virussen. Het huidige protocol werkt de representatieve resultaten van deze strategie uit en de manieren om deze effectiever te maken worden ook besproken.

Behandeling met caspase 3-remmer Er is ontdekt dat gastheer cortactine, HDAC4 en HDAC6 polypeptiden degradatie ondergaan als reactie op IAV-infectie in zowel honden (MDCK) als menselijke (A549, NHBE) cellen 7,8,9. Door de bovenstaande benaderingen te gebruiken, werd ontdekt dat IAV-geïnduceerde gastheer caspasen, met name caspase 3, hun afbraak 7,8,9<...

Influenza A-virus (IAV) -infectie activeert de caspasen die gastheer en virale eiwitten splitsen, die op hun beurt pro- en antivirale functies hebben. Door gebruik te maken van remmers, RNA-interferentie, site-gerichte mutagenese en western blotting en RT-qPCR-technieken, werden caspasen geïdentificeerd in geïnfecteerde zoogdiercellen die gastheercorticonctine en histondeacetylasen splitsen.

Het identificeren van caspasen en hun motieven die eiwitten splitsen tijdens influenza A-virusinfectie

Caspases, a family of cysteine proteases, orchestrate programmed cell death in response to various stimuli, including microbial infections. Initially ...

Deze methode zal helpen om te bepalen en te bevestigen of een eiwit in met influenzavirus geïnfecteerde cellen afbraak of splitsing door caspasen ondergaat en de caspase-splitsingsplaatsen te identificeren. Deze methode vereist alleen elementaire moleculaire en cellulaire biologie laboratoriuminstellingen en onderzoeksvaardigheden en vereist geen gespecialiseerde apparatuur of softwaretraining. Deze methode kan worden aangepast om vergelijkbare doelstellingen te bereiken met betrekking tot infectie met andere dierlijke virussen of microben en blootstelling aan externe stimuli, zoals toxines en chemicaliën.Om te beginnen, zaad MDCK- of A549-cellen in een 12-well celkweekplaat. Incubeer de cellen 's nachts bij 37 graden Celsius onder een atmosfeer van 5% koolstofdioxide. Verwijder de volgende dag het oude kweekmedium uit de cellen en was de cellen in elke put twee keer met één milliliter serumvrij MEM.Infecteer vervolgens de cellen door 400 microliter influenza A-virus inoculum toe te voegen en plaats de plaat gedurende een uur voor incubatie. Verwijder na incubatie het virus entmateriaal en was de cellen met MEM. Voeg een milliliter serumvrije MEM toe aan elk putje en incubeer de cellen zoals getoond in de vorige stap.Oogst na 24 uur de cellen door ze te schrapen met een spuitzuiger van één milliliter en breng ze over in een buis van 1,5 milliliter. Centrifugeer de buis op 12.000G gedurende twee minuten bij kamertemperatuur en verzamel het supernatant. Was de celpellet met 250 microliter fosfaatgebufferde zoutoplossing en centrifuge.Verwijder het supernatant en voeg 100 microliter cellysebuffer toe. Meng per vortex. Verwarm de buis op 98 graden Celsius gedurende 10 minuten om de cellen volledig te lyseren.Los vervolgens gelijke hoeveelheden eiwit op uit niet-geïnfecteerde en geïnfecteerde monsters door standaard SDS-polyacrylamidegelelektroforese. Breng na elektroforese de eiwitgel over naar een nitrocellulose- of PVDF-membraan en voer Western blotting uit. Vergelijk de eiwitniveaus in de met mock behandelde en met remmers behandelde geïnfecteerde monsterstroken.Verdun in 100 microliter geschikt medium, zoals Opti-MEM, 100 nanomolaren van controle- of caspase siRNA, of een geschikt volume transfectiereagens. Incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Meng 100 microliter van elke siRNA-oplossing met 100 microliter transfectiereagensoplossing en incubeer gedurende 20 tot 45 minuten bij kamertemperatuur.Splits en voeg 100, 000 MDCK- of A549-cellen toe in 800 microliter van het volledige groeimedium. Voeg 200 microliter siRNA-transfectiereagenscomplex toe en voeg deze suspensie toe aan een 12-wells kweekplaat. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius onder een 5% koolstofdioxideatmosfeer gedurende 72 uur.Infecteer de cellen met influenza A-virus, maar zonder remmers. Voer Western blotting uit en vergelijk de eiwitniveaus zoals eerder getoond. Zoek de caspase cleavage motieven XXXD en DXXD op het polypeptide.Muteer het P1-asparaginezuur, twee glutaminezuur of alanine door plaatsgerichte mutagenese en bevestig door DNA-sequencing. Verdun in 100 microliter van een geschikt medium twee microgram wild-type of mutant plasma-DNA of het aanbevolen volume van het transfectiereagens en incubeer de buizen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Meng 100 microliter plasma-DNA-oplossing met 100 microliter van de transfectiereagensoplossing en incubeer gedurende 20 tot 45 minuten bij kamertemperatuur.Splits in de tussentijd 300,000 MDCK- of A549-cellen en voeg deze toe aan 800 microliter compleet groeimedium. Voeg 200 microliter DNA-transfectiereagenscomplex toe en voeg deze suspensie toe aan een 12-well kweekplaat. Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius onder een atmosfeer van 5% koolstofdioxide.Infecteer na 48 uur de cellen met influenza A-virus zonder remmers. Voer Western blotting uit en vergelijk de eiwitniveaus zoals eerder getoond. Met behulp van Western blotting werd de afbraak van gastheercoractine door influenza-geïnduceerde gastheer caspasen geëvalueerd.Behandeling van de met influenzavirus geïnfecteerde cellen met een caspase-3-remmer resulteerde in de redding van cortactine en virale NP-afbraak. Kwantificering van de intensiteit van cortactinebanden en de normalisatie ervan met de overeenkomstige actineband toonde aan dat het niveau van cortactine in met caspase-3-remmer behandelde geïnfecteerde cellen hoger was in vergelijking met onbehandelde geïnfecteerde cellen. In caspase-6 of caspase-7 uitgeputte cellen.Er werd geen significant herstel in cortactine polypeptide niveaus waargenomen, terwijl in caspase-3 uitgeputte cellen, cortactine hersteld van het influenzavirus geïnduceerde afbraak. Kwantificering en vergelijking van polypeptideniveaus toonde aan dat het cortiactinepolypeptideniveau in geïnfecteerde cellen met uitgeputte caspase-3-expressie hoger was dan cellen met normale caspase-3-expressie. De mutatie van asparaginezuur op positie 116 in glutaminezuur maakte het cortactinepolypeptide resistent tegen door influenzavirus geïnduceerde afbraak.Kwantificering en vergelijking van polypeptideniveaus toonde aan dat het niveau van mutant cortactinepolypeptide in geïnfecteerde cellen hoger was dan dat van wild-type cortactinepolypeptide. Het is vereist om tientallen mutanten te genereren en herhaalde Western blotting uit te voeren om de caspase-splitsingsplaats in het polypeptide te identificeren. Een in vitro biochemische assay met gezuiverde caspase en doelpolypeptide kan worden ontwikkeld om te bevestigen dat het eiwit van belang een direct op gas gebaseerd substraat is.Dit protocol zal helpen om de betekenis, de afbraak of splitsing van doeleiwit in het systeem dat wordt bestudeerd, zoals virusinfectie of een ziekte, te begrijpen.

identifying-caspases-their-motifs-that-cleave-proteins-during

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Influenza virussen repliceren hun RNA genoom in samenwerking met gastheer-cel chromatine. Hier we een methode intact viraal ribonucleoproteïne complexen zuiveren van chromatine van geïnfecteerde cellen. Gezuiverd virale complexen kunnen worden geanalyseerd door zowel Western blot en primer extension eiwit en RNA inhoud respectievelijk.

Affiniteit Zuivering van Influenza Virus ribonucleoproteïne Complexen van het chromatine van geïnfecteerde cellen

This video demonstrates the assessment of multiple caspase activations in bone marrow-derived macrophages through stimulation with the influenza virus. Following macrophage lysis, heat-inactivation of lysate, and centrifugation, intracellular caspases are collected for subsequent immunological analysis.

Assessment of the Activation of Multiple Caspases in Macrophages

The video demonstrates a method to assess caspase-mediated protein cleavage in virus-infected cells. Post-viral infection, caspases get activated and degrade various host cellular proteins and viral nucleoproteins while specific caspase inhibitors prevent this degradation, as confirmed by western blotting.

Assessing Caspase-Mediated Cleavage of Viral and Host Proteins in Virus-Infected Cells

De demontage van influenza A-viruskernen tijdens het binnendringen van het virus in gastheercellen is een proces in meerdere stappen. We beschrijven een in vitro methode om de vroege stadia van virale uncoating te analyseren. In deze benadering wordt snelheidsgradientcentrifugering gebruikt om de stappen die het begin van uncoating initiëren onder gedefinieerde omstandigheden biochemisch te ontleden.

In Vitro Demontage van influenza A-virus capsiden door gradiëntcentrifugatie

Dit protocol beschrijft caspase Bimolecular fluorescentie complementatie (BiFC); een door de imaging gebaseerde methode die kan worden gebruikt voor het visualiseren van geïnduceerde nabijheid van initiatiefnemer caspases, die is de eerste stap in hun activering.

Verlichting van de trajecten voor Caspase activeren met behulp van fluorescentie Bimolecular complementatie

Presenteren we een fluorogenic peptide decollete assay waarmee een snelle screening van de proteolytic activiteit van proteasen op peptiden die vertegenwoordigen de breukzijde van virale fusion peptiden. Deze methode kan ook worden gebruikt op elke andere aminozuur motief binnen een eiwit sequentie om te testen voor de protease-activiteit.

Een Fluorogenic Peptide decollete Assay aan het scherm voor Proteolytic activiteit: toepassingen voor coronavirus spike eiwit activering

We presenteren een algemeen protocol voor het identificeren van korte stukken van homologe gastheer-pathogen eiwit sequenties (SSHHP'S) ingebed in de virale poly eiwit. SSHHP'S worden herkend door virale proteasen en richten de gerichte vernietiging van specifieke gastheer proteïnen op door verschillende groep IV virussen.

Analyse van virale SSHHP'S in groep IV met gebruikmaking van in vitro en silico-methoden

Dit protocol beschrijft de workflow om monocyten-afgeleide macrofagen (MDM) te verkrijgen uit menselijke bloedmonsters, een eenvoudige methode om inflammatoire caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) -verslaggevers efficiënt in menselijke MDM te introduceren zonder de levensvatbaarheid en het gedrag van cellen in gevaar te brengen, en een op beeldvorming gebaseerde benadering om inflammatoire caspase-activering in levende cellen te meten.

Visualisatie van inflammatoire caspasen geïnduceerde nabijheid in menselijke monocyt-afgeleide macrofagen

Dit protocol beschrijft een uitgebreide methode voor het beoordelen van caspase-activering (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9 en caspase-11) in reactie op zowel in vitro als in vivo (bij muizen) modellen van infectie, steriele beledigingen en kanker om de initiatie van celdoodroutes te bepalen, zoals pyroptose, apoptose, necroptose en PANoptose.

Evaluatie van Caspase-activering om aangeboren immuunceldood te beoordelen

Hier presenteren we een protocol om recombinant Drosophila caspases Dronc en Drice uit te drukken en te zuiveren, en hun gebruik in in vitro splitsingstests.

In vitro Splitsingstests met gezuiverde recombinante Drosophila Caspases voor substraatscreening

Het huidige protocol beschrijft twee methoden om caspase-activiteit te meten via een fluorogeen substraat met behulp van flowcytometrie of een spectrofluorometer.

Caspase-activiteit meten met behulp van een fluorometrische test of flowcytometrie

Leer hoe caspasen eiwitten splitsen tijdens Influenza A-virusinfectie in zoogdiercellen. Deze methode identificeert specifieke splitsingsplaatsen op gastheereiwitten zoals cortactine.

Het identificeren van caspasen en hun motieven die eiwitten splitsen tijdens influenza A-virusinfectie

Meer video's verkennen