Name: Snelle en efficiënte spatiotemporale monitoring van normale en afwijkende cytosinemethylatie binnen intacte zebravisembryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Leer een snelle methode voor spatiotemporele monitoring van cytosinemethylatie in intacte Danio rerio embryo's. Deze kostenefficiënte techniek detecteert epigenetische veranderingen door chemische blootstelling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Onderzoeksondersteuning werd geleverd door een UCR Graduate Division Fellowship aan SAB, een NRSA T32 Training Program Fellowship (T32ES018827) aan SAB en een National Institutes of Health-beurs (R01ES027576) en USDA National Institute of Food and Agriculture Hatch Project (1009609) aan DCV.

Volwassen fokkers werden behandeld en behandeld in overeenstemming met een door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) goedgekeurd protocol voor diergebruik (# 20180063) aan de Universiteit van Californië, Riverside.
1. Embryoverzameling van zebravis en blootstelling aan chemische stoffen
<ol><li>Voeg kweekvallen in de tank toe aan tanks met geslachtsrijpe en reproductief levensvatbare volwassen mannelijke en vrouwelijke zebravissen. Voeg ten minste drie vallen per 6 L-tank toe ten minste 12 uur voorafgaand aan het verzamelen om ~ 9:00 uur, wat de geschatte tijd is van bevruchting en paaien van eieren in tanks.</li>
	<li>Bereid een verse belichtingsoplossing op de ochtend van het verzamelen. De blootstellingsoplossing wordt bereid met behulp van een pipet van 5 ml en voegt 5,0 ml deeltjesvrij systeemwater toe aan een glazen petrischaal van 60 mm.</li>
	<li>Gebruik vervolgens een 10 μL glazen microcapillaire pipet om 10 μL voertuig (dimethylsulfoxide of DMSO) of chemische voorraadoplossing over te brengen naar systeemwater in de glazen schaal.</li>
	<li>Draai de glazen petrischaal om ervoor te zorgen dat de voorraadoplossing verdwijnt. Voeg nog eens 5,0 ml systeemwater toe aan de glazen petrischaal. Draai de glazen petrischaal om de blootstellingsoplossing te homogeniseren.</li>
	<li>Herhaal dit voor elke behandelingsgroep in replicaties van vier om vier replicaties per behandeling op te leveren.</li>
	<li>Nadat blootstellingsoplossingen zijn bereid, sluit u de glazen schotels af met glazen deksels om verdamping te minimaliseren.</li>
	<li>Terwijl u de kweekvallen uit elke tank verwijdert, laat u het water in elke val voorzichtig uit de tank wegvloeien voordat u het uit de tanks verwijdert. Zorg ervoor dat de vallen rechtsboven blijven.</li>
	<li>Breng de kweekvallen over naar de gootsteen van het laboratorium en spoel ze af met een spuitfles gevuld met omgekeerde osmose (RO) water in een visnet dat eerder in 10% bleekmiddel was gedrenkt en met water was gespoeld. Spoel de embryo's totdat alle puin is opgeruimd en alleen schone embryo's overblijven.</li>
	<li>Breng de embryo's uit het visnet met behulp van een met RO water gevulde spuitfles in een plastic petrischaaltje van 100 mm. Sorteer willekeurig 50 levende embryo's op 0,75 uur na de bevruchting (hpf) en verwijder overtollig RO-water.</li>
	<li>Plaats met behulp van een microspatula gesorteerde embryo's in de behandelingsoplossing. Alle embryo's mogen zich niet eerder dan 9:45 uur in een voertuig of behandelingsoplossing bevinden. Draai de glazen schalen om ervoor te zorgen dat de embryo's gelijkmatig worden gecoat in de behandelingsoplossing.</li>
	<li>Nadat voor elke behandelingsgroep vier replicaten (N = 50 per replicate) zijn opgezet, plaatst u het glazen deksel op de blootstellingsschotels en brengt u alle gerechten over in een temperatuurgecontroleerde incubatorset op 28 °C tot 2 hpf, 4 hpf, 6hpf, 8 hpf of 10 hpf.</li>
	<li>Bereid verse 4% paraformaldehyde (PFA) ten minste 4 uur vóór het beëindigen van de blootstelling en bewaar bij 4 °C.<ol><li>Zet de kookplaat aan op 115 °C, maak 20 ml 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (2 ml 10x PBS + 18 ml RO-water) in een centrifugebuis van 50 ml en weeg 800 mg paraformaldehyde.</li>
		<li>Breng in een chemische zuurkast 1x PBS-oplossing over in een Erlenmeyer van 250 ml, voeg 800 mg paraformaldehyde toe en voeg vervolgens 2 μL 10 N NaOH toe. Plaats een thermometer in de kolf, plaats de kolf op de hete plaat en let al roerend op de temperatuur.</li>
		<li>Wanneer de temperatuur 62-65 ° Cremove de 4% PFA uit de hete plaat en laat deze afkoelen tot kamertemperatuur (RT). Bewaar de 4% PFA bij 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Zodra de blootstellingsduur is beëindigd, verwijdert u de embryo's uit de couveuse en brengt u alle levende embryo's over naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Aspirateer de resterende blootstellingsoplossing met behulp van een pipet van 1 ml. Zuig geen embryo's op.</li>
	<li>Voeg 500 μL gekoelde 4% PFA toe aan een microcentrifugebuis van 1,5 ml en meng de embryo's in 4% PFA door meerdere keren om te keren. Laat de embryo's 's nachts fixeren in 4% PFA. OPMERKING: Het wordt niet aanbevolen om embryo's langer dan 12 uur in PFA te laten blijven.</li>
</ol>2. Dechorionatie van embryo's
<ol><li>De volgende dag aspirateer de 4% PFA, resuspenseer de embryo's in 1x PBS en pipetteer voorzichtig op en neer gedurende 30 s. Stop indien nodig het protocol bij deze stap en bewaar de embryo's in 1x PBS bij 4 °C gedurende maximaal 48 uur.</li>
	<li>Breng met behulp van een plastic transferpipet zorgvuldig vaste embryo's over naar een met RO water gevulde glazen schaal en draai voorzichtig gedurende 30 s. Herhaal deze stap nog een keer.</li>
	<li>Gebruik spuitnaalden onder 5,0x vergroting met behulp van een standaard stereomicroscoop om alle embryo's handmatig te dechorioneren. Doe dit door de naaldpunt te gebruiken om het chorion te doorboren en voorzichtig af te pellen van de dooier en celmassa4.</li>
	<li>Zodra de embryo's zijn gedechorioneerd, gebruikt u een glazen microcapillaire pipet om tot 25 intacte embryo's in één immunochemische (IHC) mand te brengen en plaatst u de IHC-mand in een 96-well plaat. Gebruik een pipet van 1 ml om het RO-water uit elke put te zuigen.</li>
</ol>3. Immunohistochemie met behulp van 5-mC-specifiek antilichaam
<ol><li>Resuspenseer de embryo's in 500 μL blokkerende buffer (1x PBST + 2% schapenserum + 2 mg / ml runderserumalbumine) per put en wikkel de plaat met parafilm en aluminiumfolie om ze te beschermen tegen licht. Incubeer bij 4 °C gedurende 4 uur op een orbitale shaker (100 rpm).</li>
	<li>Verwijder de parafilmwikkel en aluminium en gebruik een pipet van 1 ml om de blokkerende buffer uit elke put te halen. Vervang het door 500 μL van een 1:100 verdunning van monoklonaal muis anti-5-mC antilichaam in de blokkerende buffer. Incubeer alle embryo's met primaire antilichamen, met uitzondering van een subset van voertuigcontroleembryo's die zullen worden geïncubeerd met de blokkerende buffer om rekening te houden met achtergrondgeluid. Pas op dat u de integriteit van embryo's niet verstoort, noch om embryo's tijdens deze stap te aspirateren.</li>
	<li>Verpak de plaat opnieuw in parafilm en aluminiumfolie en laat de plaat 's nachts bij 4 °C incuberen op een orbitale shaker (100 rpm).</li>
	<li>Verwijder de volgende dag de primaire antilichaamoplossing uit elke put en vervang deze door 1x PBS + 0,1% Tween-20 (1x PBST). Was elke put drie keer met 1x PBST gedurende 15 minuten per wasbeurt op een orbitale shaker (100 rpm).</li>
	<li>Vervang 1x PBST door een 1:500 verdunning van geiten anti-muis IgG antilichaam in blokkerende buffer en incubeer alle embryo's met het secundaire antilichaam. Laat de plaat een nacht bij 4 °C incuberen op een orbitale shaker (100 rpm).</li>
	<li>Verwijder de volgende dag het secundaire antilichaam en was de restoplossing drie keer met 1x PBST gedurende 15 minuten per wasbeurt op een orbitale shaker (100 rpm). OPMERKING: Het protocol kan hier tot 48 uur worden gestopt als de IHC-manden worden opgeslagen in schone putten gevuld met 1x PBS.</li>
	<li>Gebruik een pipet van 1 ml om 1x PBST uit elke put te zuigen en plaats de IHC-mand in een glazen petrischaal gevuld met RO-water. Onder een standaard stereomicroscoop sorteer je willekeurig intacte embryo's in een plaat met 96 putten, wat resulteert in één embryo per put.</li>
	<li>Verwijder met een pipet van 1 ml al het RO-water uit afzonderlijke putten en vervang het door 200 μL 1x PBS. Centrifugeer de plaat gedurende 3 min bij 1 x g.</li>
</ol>4. Geautomatiseerde beeldvorming van embryo's in 96-well platen
<ol><li>Beeld de embryo's af met een 2x objectief onder doorgelaten licht en FITC met behulp van een high-content screeningsysteem (Table of Materials). OPMERKING: Een fluorescerend beeld van elk embryo werd automatisch vastgelegd met behulp van de bovengenoemde vergroting en een FITC-filter19.<ol><li>Selecteer Autofocus om ervoor te zorgen dat de focus van de camera zich op de onderkant van de plaat bevindt en wordt gecompenseerd door de onderste dikte.</li>
		<li>Selecteer een FITC-golflengte met een belichtingsduur van 100 ms en stel de autofocus in op laser met een Z-offset. Observeer en bevestig de juiste beeldacquisitie in verschillende putten voordat u begint met het verwerven van platen. OPMERKING: Het instrument verkrijgt automatisch beelden van alle geselecteerde putten die embryo's bevatten. Een plaat met 96 putten had ongeveer 30 minuten nodig voor beeldacquisitie en gegevensopslag. Voor de duur van de acquisitieperiode werd de interne temperatuur in het beeldvormingssysteem op RT gehouden.</li>
	</ol></li>
	<li>Voer na beeldacquisitie gegevensanalyse uit met behulp van het screeningsysteem met hoge inhoud en een aangepaste geautomatiseerde beeldanalyseprocedure. Selecteer elk embryo op de 96-well plaat die moet worden geanalyseerd op totale oppervlakte en geïntegreerde intensiteit van fluorescentie. OPMERKING: De analyse omvatte het verstrekken van afbeeldingen die overlays van gegevenspunten uit de analyse bevatten.</li>
	<li>Voer vervolgens de gegevenspunten in tabelvorm uit en exporteer ze vanuit het screeningsysteem met hoge inhoud door onder Meten te gaan en Open gegevenslogboek naar een spreadsheet te selecteren. De gedeelten plaatacquisitie en gegevensanalyse zijn weergegeven in figuur 1.</li>
</ol>5. Data-analyse
<ol><li>Upload de geëxporteerde spreadsheet naar een computerprogramma waar het deployer-pakket (dplyr) wordt gebruikt om te sorteren, gegevens voor elke put op te tellen en te filteren op putnummer. Het writexl-pakket wordt vervolgens gebruikt om de samengevatte gegevens naar een spreadsheet te exporteren. De 5mC-programmacode wordt weergegeven in Supplemental File 1.</li>
</ol>

<ol><li>Zhang, H. -Y., Xiong, J., Qi, B. -L., Feng, Y. -Q., Yuan, B. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+existence+of+5-hydroxymethylcytosine+and+5-formylcytosine+in+both+DNA+and+RNA+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">The existence of 5-hydroxymethylcytosine and 5-formylcytosine in both DNA and RNA in mammals.</a> Chemical Communications. 52 (4), 737-740 (2016).</li>
<li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+determination+of+the+oxidation+products+of+5-methylcytosine+in+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Formation and determination of the oxidation products of 5-methylcytosine in RNA.</a> Chemical Science. 7 (8), 5495-5502 (2016).</li>
<li>Avila-Barnard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tris%281%2C3-dichloro-2-propyl%29+phosphate+disrupts+the+trajectory+of+cytosine+methylation+within+developing+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Research%22%5BJournal%5D)">Tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate disrupts the trajectory of cytosine methylation within developing zebrafish embryos.</a> Environmental Research. 211, 113078(2022).</li>
<li>Dasgupta, S., Cheng, V., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+zebrafish+embryos+to+reveal+disruptions+in+dorsoventral+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Utilizing zebrafish embryos to reveal disruptions in dorsoventral patterning.</a> Current Protocols. 1 (6), 179(2021).</li>
<li>Vliet, S. M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal-to-zygotic+transition+as+a+potential+target+for+niclosamide+during+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Maternal-to-zygotic transition as a potential target for niclosamide during early embryogenesis.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 380, 114699(2019).</li>
<li>Kupsco, A., Dasgupta, S., Nguyen, C., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+alterations+in+DNA+methylation+precede+Tris%281%2C3-dichloro-2-propyl%29phosphate-induced+delays+in+zebrafish+epiboly%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology+Letters%22%5BJournal%5D)">Dynamic alterations in DNA methylation precede Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced delays in zebrafish epiboly.</a> Environmental Science & Technology Letters. 4 (9), 367-373 (2017).</li>
<li>Dasgupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+interplay+among+nuclear+receptor+ligands%2C+cytosine+methylation%2C+and+the+metabolome+in+driving+tris%281%2C3-dichloro-2-propyl%29phosphate-induced+epiboly+defects+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Complex interplay among nuclear receptor ligands, cytosine methylation, and the metabolome in driving tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced epiboly defects in zebrafish.</a> Environmental Science & Technology. 53 (17), 10497-10505 (2019).</li>
<li>McGee, S. P., Cooper, E. M., Stapleton, H. M., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+zebrafish+embryogenesis+is+susceptible+to+developmental+TDCPP+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Early zebrafish embryogenesis is susceptible to developmental TDCPP exposure.</a> Environmental Health Perspectives. 120 (11), 1585-1591 (2012).</li>
<li>Geiman, T. M., Muegge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+in+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">DNA methylation in early development.</a> Molecular Reproduction and Development. 77 (2), 105-113 (2010).</li>
<li>Wossidlo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Hydroxymethylcytosine+in+the+mammalian+zygote+is+linked+with+epigenetic+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming.</a> Nature Communications. 2 (1), 1-8 (2011).</li>
<li>Rottach, A., Leonhardt, H., Spada, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation-mediated+epigenetic+control%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA methylation-mediated epigenetic control.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 108 (1), 43-51 (2009).</li>
<li>Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+in+human+disease+and+prospects+for+epigenetic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy.</a> Nature. 429 (6990), 457-463 (2004).</li>
<li>Ooi, S. K. T., O'Donnell, A. H., Bestor, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cytosine+methylation+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mammalian cytosine methylation at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (16), 2787-2791 (2009).</li>
<li>Baylin, S. B., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+exploring+the+cancer+epigenome-biological+and+translational+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">A decade of exploring the cancer epigenome-biological and translational implications.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (10), 726-734 (2011).</li>
<li>Robertson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+and+chromatin-unraveling+the+tangled+web%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">DNA methylation and chromatin-unraveling the tangled web.</a> Oncogene. 21 (35), 5361-5379 (2002).</li>
<li>Robertson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">DNA methylation and human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (8), 597-610 (2005).</li>
<li>Greenberg, M. V. C., Bourc'his, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diverse+roles+of+DNA+methylation+in+mammalian+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 590-607 (2019).</li>
<li>Yuan, B. -F., Feng, Y. -Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+analysis+of+5-methylcytosine+and+its+oxidation+products%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the analysis of 5-methylcytosine and its oxidation products.</a> Trends in Analytical Chemistry. 54, 24-35 (2014).</li>
<li>Lantz-McPeak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+toxicity+assay+using+high+content+screening+of+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos.</a> Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen bekende concurrerende financiële belangen of persoonlijke relaties hebben die het werk dat in dit artikel wordt gerapporteerd, lijken te beïnvloeden.

Tijdens dit protocol zijn er een paar stappen die van cruciaal belang zijn. Ten eerste is het bij het dechorioneren van embryo's belangrijk om de naald weg te wijzen van het weefsel van de embryo/ dooierzak / celmassa, omdat deze delen van het zich ontwikkelende embryo zeer kwetsbaar en gemakkelijk te doorboren zijn. Ten tweede, bij het overbrengen van gelabelde embryo's naar individuele putten, gebruik dan een glazen pipet om embryo's over te brengen, omdat ze zich hechten aan een plastic pipet. Ten derde, bij het uitvo...

Enzymatische modificaties stimuleren actieve methylering en demethylering van cytosine in 5-methylcytosine (5-mC) en daaropvolgende oxidatie van 5-mC in 5-hydroxymethylcytosine, 5-formylcytosine en 5-carboxylcytosine 1,2. Tris(1,3-dichloor-2-propyl)fosfaat (TDCIPP) is een veelgebruikte vlamvertrager in de Verenigde Staten waarvan eerder is aangetoond dat het het traject van cytosinemethylatie verandert na vroege embryonale blootstelling vanaf 0,75 uur na de bevruchting (hpf) door vroege gastrulatie (6 pkf)3,4,5,6,7,8 . Binnen gewervelde dieren zijn 5-mC en zijn gemodificeerde derivaten van cruciaal belang voor het reguleren van de vroege embryonale ontwikkeling9. Bevruchting van een embryo veroorzaakt demethylatie van ouderlijk DNA, gevolgd door maternale mRNA-afbraak, zygotische genoomactivering en remethylering van het zygotische genoom9. Biologisch relevante processen die cytosinemethylatie gebruiken, omvatten histonmodificatie, rekrutering van transcriptionele machines, RNA-methylatie, epigenetische herprogrammering en bepaling van chromatinestructuur10,11. Cytosinemethylatie wordt ook bewaard bij gewervelde soorten, wat het belang onderstreept van het begrijpen en onderzoeken van hoe afwijkende cytosinemethylatie het traject van de ontwikkeling van een organisme kan beïnvloeden11. Bovendien is de ontwikkeling in utero gevoelig voor maternale blootstelling en kan het nadelige uitkomsten veroorzaken, zoals onmiddellijke fenotypische gevolgen, langetermijneffecten op de gevoeligheid voor volwassen ziekten en transgenerationele effecten van erfelijke epigenetische kenmerken 12,13,14.
Lange stukken cytosine-guanineparen, of CpG-eilanden, zijn de primaire foci van onderzoekers geweest die tot doel hebben de dynamiek van cytosinemethylatie in het genoom te karakteriseren 15,16,17. Op bisulfiet gebaseerde strategieën zoals bisulfietsequencing van het hele genoom, bisulfietsequencing met verminderde representatie en bisulfiet ampliconsequencing vertegenwoordigen de gouden standaard voor het ondervragen van cytosinemethylatie bij basenpaarresolutie. Op sequencing gebaseerde benaderingen zijn echter onbetaalbaar en sluiten als zodanig de mogelijkheid uit om cytosinemethylatie in ontwikkelingsstadia, meerdere concentraties per chemische stof te controleren en embryo's per behandeling te repliceren. Bovendien bieden op sequencing gebaseerde benaderingen geen informatie over ruimtelijke lokalisatie, wat van cruciaal belang is voor het begrijpen van mogelijk aangetaste celtypen en gebieden binnen een zich ontwikkelend embryo. Evenzo vertrouwen globale DNA-methylatietests zoals methylatieafhankelijke restrictieanalyse, 5-mC enzymgebonden immunoassays (ELISA's) en 5-methyl-2'-deoxycytidine (5-mC) vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) op cel- of weefselhomogenaten en sluiten als zodanig de mogelijkheid uit om de lokalisatie en omvang van cytosinemethylatie over ruimte en tijd in intacte monsters te controleren12,18.
Vanwege het gemak van geautomatiseerde in vivo beeldvorming, genetische manipulaties, snelle ex-utero-ontwikkelingstijd en houderij tijdens embryogenese, worden zebravisembryo's nog steeds op grote schaal gebruikt als fysiologisch intacte modellen om xenobiotisch gemedieerde routes te ontdekken die bijdragen aan nadelige resultaten tijdens de vroege embryonale ontwikkeling. Daarom beschrijft het onderstaande protocol, met behulp van commercieel beschikbare antilichamen die specifiek zijn voor 5-mC, een kosteneffectieve strategie voor snelle en efficiënte spatiotemporale monitoring van cytosinemethylatie in individuele, intacte zebravisembryo's door gebruik te maken van whole-mount immunohistochemie (IHC), geautomatiseerde beeldvorming met hoge inhoud en efficiënte gegevensverwerking met behulp van programmeertaal voorafgaand aan statistische analyse.
Voor zover bekend is deze methode de eerste die 5-mC monitort binnen intacte zebravisembryo's. De methode maakt de detectie van DNA-methylatie in de celmassa mogelijk en heeft ook de mogelijkheid om cytosinemethylatie van dooier-gelokaliseerde maternale mRNA's te detecteren tijdens de maternale naar zygote overgang. Over het algemeen zal deze methode nuttig zijn voor de snelle identificatie van chemische stoffen die het potentieel hebben om cytosinemethylatie in situ te verstoren tijdens epigenetische herprogrammering.

```html
<table><tbody><tr><td>1.5-mL microcentrifuge tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>540225</td><td></td></tr><tr><td>10-&micro;L glass microcapillary pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>211762B</td><td></td></tr><tr><td>100-mm plastic Petri dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>08757100D</td><td></td></tr><tr><td>10x phosphate-buffered saline&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399500</td><td></td></tr><tr><td>1-mL pipette&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13690032</td><td></td></tr><tr><td>250-mL Erlenmeyer flask</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB501250</td><td></td></tr><tr><td>5-mL pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13690033</td><td></td></tr><tr><td>60-mm glass petri dishes with lids</td><td>Fisher Scientific</td><td>08747A</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>720089</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A21121</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP67110</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2311</td><td></td></tr><tr><td>Hotplate&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>1110016SH</td><td></td></tr><tr><td>In-tank breeding traps</td><td>Aquatic Habitats</td><td>N/A</td><td>Dit product is niet langer beschikbaar na de overname van Aquatic Habitats door Pentair.&nbsp; Onderzoekers kunnen gebruik maken van standaard broedtanks buiten het systeem die verkrijgbaar zijn bij meerdere leveranciers.</td></tr><tr><td>ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td>Elk high-content screening systeem uitgerust met doorgelaten licht en FITC-filter zal geschikt zijn.</td></tr><tr><td>Immunochemistry (IHC) basket</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Gemaakt in huis met microcentrifuge tubes waarvan het conische deel is verwijderd en de bodem is voorzien van gaas, geschikt voor 24- of 48-well platen.</td></tr><tr><td>MetaXpress 6.0.3.1658&nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td>Elke software die in staat is om de totale oppervlakte en geïntegreerde intensiteit van fluorescentie te kwantificeren zal geschikt zijn.</td></tr><tr><td>Microspatula</td><td>Fisher Scientific</td><td>2140115</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal mouse anti-5-mC antibody</td><td>Millipore Sigma</td><td>MABE146</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50998290</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>1337412</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>18612139</td><td></td></tr><tr><td>Plastic transfer pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>1368050</td><td></td></tr><tr><td>Rstudio</td><td>RStudio</td><td>N/A</td><td>RStudio is open-source software en kan worden gedownload via https://www.rstudio.com.</td></tr><tr><td>Sheep serum</td><td>Millipore Sigma</td><td>S3772-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>10450103</td><td></td></tr><tr><td>Temperature-controlled incubator&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PR505755L</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P7949-500ML</td><td></td></tr></tbody></table>
```

snelle en efficiënte spatiotemporale monitoring van normale en afwijkende cytosinemethylatie binnen intacte zebravisembryo's

Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos

Cytosinemethylatie is sterk geconserveerd bij gewervelde soorten en speelt, als een belangrijke aanjager van epigenetische programmering en chromatinetoestand, een cruciale rol in de vroege embryonale ontwikkeling. Enzymatische modificaties stimuleren actieve methylering en demethylering van cytosine in 5-methylcytosine (5-mC) en daaropvolgende oxidatie van 5-mC in 5-hydroxymethylcytosine, 5-formylcytosine en 5-carboxylcytosine. Epigenetische herprogrammering is een kritieke periode tijdens de ontwikkeling van de baarmoeder en maternale blootstelling aan chemicaliën heeft het potentieel om het epigenoom in nakomelingen te herprogrammeren. Dit kan mogelijk nadelige gevolgen veroorzaken, zoals onmiddellijke fenotypische gevolgen, langetermijneffecten op de gevoeligheid voor volwassen ziekten en transgenerationele effecten van erfelijke epigenetische kenmerken. Hoewel op bisulfiet gebaseerde sequencing onderzoekers in staat stelt om cytosinemethylatie met basenpaarresolutie te ondervragen, zijn op sequencing gebaseerde benaderingen onbetaalbaar en sluiten ze als zodanig de mogelijkheid uit om cytosinemethylatie in ontwikkelingsstadia, meerdere concentraties per chemische stof te controleren en embryo's per behandeling te repliceren. Vanwege het gemak van geautomatiseerde in vivo beeldvorming, genetische manipulaties, snelle ex-utero-ontwikkelingstijd en houderij tijdens embryogenese, blijven zebravisembryo's worden gebruikt als een fysiologisch intact model voor het blootleggen van xenobiotisch gemedieerde routes die bijdragen aan nadelige resultaten tijdens de vroege embryonale ontwikkeling. Daarom beschrijven we, met behulp van commercieel beschikbare 5-mC-specifieke antilichamen, een kosteneffectieve strategie voor snelle en efficiënte spatiotemporale monitoring van cytosinemethylatie binnen individuele, intacte zebravisembryo's door gebruik te maken van immunohistochemie met hele mount, geautomatiseerde beeldvorming met hoge inhoud en efficiënte gegevensverwerking met behulp van programmeertaal voorafgaand aan statistische analyse. Volgens de huidige kennis is deze methode de eerste die met succes 5-mC-niveaus in situ in zebravisembryo's detecteert en kwantificeert tijdens de vroege ontwikkeling. De methode maakt de detectie van DNA-methylatie in de celmassa mogelijk en heeft ook de mogelijkheid om cytosinemethylatie van dooier-gelokaliseerde maternale mRNA's te detecteren tijdens de maternale naar zygote overgang. Over het algemeen zal deze methode nuttig zijn voor de snelle identificatie van chemische stoffen die het potentieel hebben om cytosinemethylatie in situ te verstoren tijdens epigenetische herprogrammering.

Het algemene doel van dit protocol is om te bepalen of een behandeling de relatieve abundantie van 5-mC beïnvloedt door het totale gebied en de relatieve intensiteit van fluorescentie binnen vaste en gelabelde zebravisembryo's te beoordelen. Na het voltooien van het protocol kan een fluorescentiemicroscoop worden gebruikt om eerst te bepalen of de IHC met hele mount succesvol was. Wanneer gelabelde embryo's worden waargenomen onder een FITC- of GFP-filter, wordt een positief resultaat aangegeven door een positief FITC-si...

Dit artikel beschrijft een protocol voor de snelle en efficiënte spatiotemporale monitoring van normale en afwijkende cytosinemethylatie in intacte zebravisembryo's.

Snelle en efficiënte spatiotemporale monitoring van normale en afwijkende cytosinemethylatie binnen intacte zebravisembryo's

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical ...

Dit protocol biedt een relatief snelle en kostenefficiënte methode, evenals een geautomatiseerde acquisitie en analyse, waardoor een screening met een lage gevoeligheid van 5-methylcytosine wordt geproduceerd, een veel voorkomende epigenetische biomarker. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de flexibiliteit die het biedt een experimenteel ontwerp dat gebruikers kunnen optimaliseren voor hun model en ontwikkelingsfase. Deze techniek kan worden gebruikt om te detecteren hoe chemische blootstelling de relatieve abundantie van 5-methylcytosine in een zich ontwikkelend organisme verandert, wat normaal gesproken alleen zou kunnen worden gedaan door middel van dure hoge trpA-methoden zoals sequencing.Deze methode is nuttig voor elk onderzoek dat tot doel heeft NCG-methoden te gebruiken om epigenetische veranderingen van 5-Methylcytosine te begrijpen als reactie op omgevingsstimuli. Begin met het bereiden van een nieuwe belichtingsoplossing op de ochtend van het verzamelen. Voeg vijf milliliter deeltjesvrij systeemwater toe aan een petrischaaltje van 60 millimeter glas.Gebruik vervolgens een 10 microliter micro capillaire glazen pipet om 10 microliter dimethylsulfoxide of chemi

rapid-efficient-spatiotemporal-monitoring-normal-aberrant-cytosine

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Somitogenesis is een ritmische ontwikkelingsproces dat ruimtelijk patronen het lichaam as van gewervelde embryo's. Eerder ontwikkelden we transgene zebravis lijnen die fluorescerende verslaggevers gebruiken om de cyclische genen die dit proces sturen observeren. Hier hebben we cultuur verspreid cellen van deze lijnen en het imago van hun oscillaties in de tijd in vitro.

Generatie Dispersed presomitische Mesoderm Cell Cultures for Imaging van de zebravis Segmentatie Klok in enkele cellen

De zebravis, een kleine tropische vissen, is uitgegroeid tot een populair model voor het bestuderen van gen-functie tijdens gewervelde ontwikkeling en ziekte. De ruimtelijke en temporele expressie van de doelwitgenen worden...

Hoge resolutie Hele Mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in zebravis embryo&#39;s om genexpressie en functie te bestuderen

Eiwitniveaus in cellen en weefsels vaak zijn gereguleerd door het evenwicht van eiwitproductie en klaring. Met behulp van fluorescentie Decay Na Photoconversion (FDAP), kan de klaringskinetiek van eiwitten experimenteel worden gemeten in vivo.

Meten Eiwit Stabiliteit in Living zebravis embryo&#39;s met behulp van fluorescentie Decay Na Photoconversion (FDAP)

Mitose is cruciaal voor elk levend organisme en defecten leiden vaak tot kanker en ontwikkelingsstoornissen. Met behulp van dit beeldvormingsprotocol en zebravissen als modelsysteem, kunnen onderzoekers mitose visualiseren in een levend gewerveld organisme en de veelvoud aan defecten die ontstaan wanneer mitotische processen defect zijn.

Observeren mitotische deling en Dynamiek in een live zebravis embryo

De hier beschreven protocollen maken de studie van de elektrische eigenschappen van prikkelbare cellen mogelijk in de meest niet-invasieve fysiologische omstandigheden door het gebruik van zebravis-embryo's in een in vivo systeem, samen met een op fluorescentie resonantie energieoverdracht (FRET) gebaseerde, genetisch gecodeerde spanningsindicator (GEVI) die selectief wordt tot expressie gebracht in het celtype van belang.

Biosensing Motor Neuron Membraan Potentieel in Live Zebrafish Embryo&#39;s

Een combinatie van de geavanceerde optische technieken van laser scanning microscopie met lange golflengte fluorescentie multi foton excitatie werd uitgevoerd om vast te leggen van real-time, hoge resolutie, driedimensionale beeldvorming van neurale crest migratie in GS (sox10:EGFP) en GS (foxd3:GFP) zebrafish embryo's.

Multi foton Time Lapse Imaging te visualiseren van ontwikkeling in realtime: visualisatie van migreren neurale kamcellen in Zebrafish embryo's

Zebravis onlangs gewend waren als een modelsysteem in vivo DNA replicatie timing tijdens ontwikkeling bestuderen. Hier is gedetailleerde de protocollen voor het gebruik van embryo's de zebravis profiel replicatie timing. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast om te bestuderen van replicatie timing mutanten, individuele celtypes, ziekte modellen en andere soorten.

Profilering van DNA replicatie Timing met behulp van de zebravis als een modelsysteem In Vivo

We demonstreren een methode die gebruik maakt van snelle confocale scanscopie om live beeldvorming uit te voeren van microgliacellen in het zich ontwikkelende optische tectum van zebravissen, waardoor de dynamiek van deze cellen in vivo kan worden geanalyseerd.

Live beeldvorming en karakterisering van de dynamiek van microglia in het zebravisembryo

Er wordt een strategie voor de voorbereiding van monsters beschreven voor het afbeelden van vroege zebravisembryo's in een intact chorion met behulp van een light-sheet-microscoop. Het analyseert de verschillende oriëntaties die embryo's verwerven in het chorion in de 70% epiboly- en knopstadia en beschrijft beeldvormingsstrategieën voor het verkrijgen van resolutie op cellulaire schaal in het hele embryo met behulp van het light-sheet-systeem.

Light Sheet Microscopie, beeldvorming en montagestrategieën voor vroege zebravisembryo's

RASopathieën zijn multisysteem-genetische syndromen die worden veroorzaakt door hyperactivering van de RAS-MAPK-route. Potentieel pathogene varianten die wachten op validatie duiken continu op, terwijl slecht preklinisch bewijs de therapie beperkt. Hier beschrijven we ons in vivo protocol voor het testen en kruisvalideren van RASopathie-geassocieerde ERK-activeringsniveaus en de farmacologische modulatie ervan tijdens de embryogenese door middel van live FRET-beeldvorming in Teen-reporter...

Een efficiënt protocol om ERK-activiteitsmodulatie te beoordelen in vroege zebravismodellen van het Noonan-syndroom via live FRET-microscopie en immunofluorescentie

Deze studie stelt een op gevoelige immunofluorescentie gebaseerde beeldvormingsmethode vast om globale DNA-methylering in individuele zebravisembryonale harten te kwantificeren. Deze aanpak overwint de uitdaging van beperkt weefselmateriaal en omzeilt de noodzaak van bisulfietconversie.

Detectie van wereldwijde DNA-methylering in het hart van zebravislarven

Leer een snelle methode voor spatiotemporele monitoring van cytosinemethylatie in intacte Danio rerio embryo's. Deze kostenefficiënte techniek detecteert epigenetische veranderingen door chemische blootstelling.

Snelle en efficiënte spatiotemporale monitoring van normale en afwijkende cytosinemethylatie binnen intacte zebravisembryo's

Meer video's verkennen