Protocollen voor CRISPR/Cas9 Mutagenese van de Oosterse Fruitvlieg Bactrocera dorsalis

De oosterse fruitvlieg is een zeer invasieve en adaptieve plaagsoort. Effectieve methoden voor functioneel genonderzoek kunnen ons helpen om milieuvriendelijke strategieën voor ongediertebestrijding te ontwikkelen. Deze methode is hoog rendement en lage kosten.

Ons protocol zal dienen als een nuttige gids voor het genereren van gemuteerde vliegen voor oosterse fruitvliegonderzoekers. Om te beginnen, voorspel de structuur van doelgenen van belang en bepaal de grenzen tussen exonen en introns via bioinformatische analyse van het Bactroceras dorsalis-genoom. Gebruik de in de handel verkrijgbare gRNA-synthesekit om het ontworpen sgRNA te genereren.

Resuspendeer het gRNA-product in nucleasevrij water. Kwantificeer de concentratie met behulp van een UV-zichtbare spectrofotometer en bewaar bij 80 graden Celsius voor gebruik. Plaats B.dorsalis poppen in een plastic kooi, met een opfoktoestand van 55% relatieve vochtigheid, 26,5 graden Celsius en een 14:10 licht / dag cyclus.

Wanneer de volwassenen eclose, zorg dan voor een mengsel van suiker en gist als voedsel samen met water. De meeste volwassenen bereiken 10 dagen na opkomst geslachtsrijpheid. Gebruik een lichtstandaard met een licht van 30 tot 50 lux om de vruchtbaarheid van vrouwtjes te verbeteren, waardoor de efficiëntie van het verzamelen van embryo's wordt verbeterd.

Plaats vervolgens een gaas van 200 mazen in de ovipositiekamer, op ongeveer 1 tot 2 millimeter afstand van het kamerdeksel. Plaats een nieuwe ovipositiekamer in de kooi wanneer de micro-injectie-opstelling klaar is. Verzamel de embryo's elke 10 minuten met een fijne natte borstel en lijn ze uit op een zelfgemaakte injectieplaat.

Dompel de embryo's tijdens de injectie in halocarbonolie om verdere uitdroging te voorkomen. Bereid de werkoplossing door het Cas9-eiwit en het bijbehorende sgRNA te mengen tot een concentratie van 300 nanogram per microliter van elk. Voeg vervolgens 1 microliter fenolrood toe aan het mengsel om te dienen als een handige manier om geïnjecteerde embryo's te markeren.

Plaats het bereide mengsel op ijs om afbraak van het sgRNA te voorkomen. Bereid de glazen injectienaald voor met een micropipettetrekker. Voeg 3 microliter van het mengsel toe aan de injectienaald zonder luchtbellen te introduceren.

Open vervolgens de naald met behulp van een Microgrinder en sluit deze aan op de micromanipulator volgens de gebruikershandleiding. Stel de parameters voor de injector in als Pi op 500 hectopascal. Ti tot 0,5 seconden en PC tot 200 hectopascal.

Leg het bord met opgestelde embryo's op de objectieve tafel. Pas vervolgens de positie van de micropipette aan onder een fijne optische microscoop en zet de micropipette en het embryo op hetzelfde vlak. Steek de naaldpunt in de achterste of plantaardige pool van het embryo.

Druk vervolgens op het pedaal van de injector om de mengsels in het embryo af te leveren. Het verschijnen van een lichte roodachtige kleur is te wijten aan de toevoeging van fenolrood in het mengsel. Plaats de injectieplaat met de geïnjecteerde embryo's in een kunstmatige klimaatkamer.

Breng na 36 uur de uitgekomen larven over in een larvaal dieet met behulp van een fijne borstel. Verzamel de larven drie of vier keer per dag totdat er geen larven meer uitkomen. Plaats vervolgens de volwassen larven in het natte zand om te verpoppen.

De verpoppingsfase duurt 10 dagen. Verplaats de poppen na de verpopping naar een plastic kooi voordat de eclosie begint. Na het isoleren van genomisch DNA uit een vers poparium of een enkele middenpoot van individuele volwassenen en het ontwerpen van de specifieke primers om het doelgebied te versterken, polymerasekettingreactie of PCR uit te voeren, volgens fietsomstandigheden beschreven in het tekstmanuscript.

Volg vervolgens de gezuiverde PCR-producten op. Het detecteren van meerdere overlappende pieken naast de doellocatie suggereert succesvolle mutagenese. Meng voor het subklonen de gezuiverde PCR-producten met een stompe vector en liqueer ze gedurende 15 minuten op 25 graden Celsius.

Voeg vervolgens trans-T1-cellen toe en plaats het gedurende 30 minuten op ijs. Voeg vervolgens 500 microliter LB-medium toe en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 1 uur met schudden. Centrifugeer en gooi het supernatant weg.

Resuspendeer de pellet en verspreid deze op een LB-plaat. Plaats de plaat voor nachtelijke incubatie op 37 graden Celsius. Selecteer vervolgens individuele bacteriekolonies voor sequencing om het genotype van de mutanten te verifiëren.

In deze studie bevindt het voorbeeld van de doellocatie van het geselecteerde gen zich in het derde exon. De doellocatie is sterk geconserveerd en een enkele band werd gedetecteerd door gel-elektroforese voor het DNA-sjabloon voor synthetisch gRNA en gRNA verkregen in vitro transcriptie. B.dorsalis overleving en mutagenese na micro-injecties worden hier getoond.

Na sequencing van de PCR-producten zijn 80% van de G0-individuen mozaïekmutanten. Bij mutantscreening resulteerde de mutant met 8-base-pair deletie in voortijdige beëindiging van aminozuurtransformatie. Het inbrengen van de naald in het achterste gebied of de plantaardige pool van een embryo is een centrale stap omdat dit direct van invloed is op de overleving van eieren.

Deze technologie biedt een referentie voor het bestuderen van gebieden met genfuncties in B.Dorsalis Ze kunnen snel de mutanten vangen die ze willen via deze methode.