Microfluïdica-geassisteerde selectieve depolarisatie van axonale mitochondriën

Mitochondriën zijn essentieel voor de neuronale gezondheid. Bij veel neurodegeneratieve ziekten zijn axonale mitochondriën de eerste die lijden, maar het is niet duidelijk wat axonale mitochondriën zo speciaal maakt. De vloeistofdrukgradiënt in de kamers die in dit protocol worden gebruikt, maakt de selectieve behandeling van mitochondrion-axonen mogelijk.

Dit laat cellichaamprocessen ongestoord en stelt ons in staat om ons te concentreren op axonale biologie. We tonen hier de depolarisatie van mitochondriën met een membraanpotentiaalgevoelige kleurstof, maar deze methode kan worden toegepast op veel verschillende neuronale celtypen en fluorescerende uitlezingen. Plaats om te beginnen de gecodeerde zes putplaten in een steriele kap en was ze twee keer met steriel dubbel gedestilleerd water.

Laat de platen drie tot vijf minuten in een gekantelde positie drogen. Verwijder overtollig water door vacuüm zuigen of pipetteren. Week vervolgens de microfluïdische kamer in 80% ethanol.

Nogmaals, droog de microfluïdische kamer gedurende drie tot vijf minuten in een gekantelde positie en verwijder overtollige ethanol met een pipetpunt. Wanneer het volledig droog is, plaatst u de microfluïdische kamer in het midden van de put en de plaat. Tik voorzichtig op de microfluïdische kamer aan de randen en het microgroove-gedeelte in het midden voor een goede bevestiging aan de glasplaat.

Verzamel eerst het gewenste aantal gedissocieerde hippocampusneuronen in een reactiebuis van 1,5 milliliter. Centrifugeer de buis op 1000 maal G gedurende vier minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg en resuspenseer de pellet in acht microliter B-27 neuro basale media.

Doseer vervolgens de celoplossing in de kanaalingang van de microfluïdische kamer. Tik op de achterkant van de plaat om de stroom door het kanaal te ondersteunen. Gebruik een pipet om de resterende celsuspensie aan de uitgang van het kanaal aan te zuigen.

Incubeer de microfluïdische kamer met cellen gedurende 15 tot 20 minuten bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Vul vervolgens de bovenste axonale put met 50 microliter B-27 neurobasale media en tik op de achterkant van de plaat om de stroom te ondersteunen. Vul elke put aan de somazijde met 150 microliter B-27 neurobasale media, waardoor er een spanningsbel bovenop ontstaat.

Vul ook beide putten van de axonale kant met elk 100 microliter B-27 neurobasale media. Zorg er na zeven tot acht dagen in-vitrokweek voor dat de axonen door de microgrooves zijn gegroeid en zich hebben uitgebreid naar het axonale compartiment. Was het apparaat door het B-27 neurobasale medium te verwijderen en 100 microliter voorverwarmd beeldvormingsmedium toe te voegen aan de bovenste putjes van zowel de axonale als de somakanalen.

Laat het medium doorstromen naar de onderste putten. Verwijder het medium uit de onderste putjes en het overgebleven medium uit de bovenste putjes en herhaal dit met vers medium, waarbij de putjes aan het einde van de was leeg blijven. Voeg vervolgens 100 microliter van vijf nanomolaire TMRE-verdunning toe aan zowel de somatische als de axonale bovenste putten.

Laat het medium door beide compartimenten stromen, totdat er in alle putten een gelijk volume is. Vul met het TMRE-bevattende medium. Selecteer een interessegebied in het somatische compartiment en volg het door de microgrooves naar het axonale compartiment.

Zorg ervoor dat de microgroeven in de somatische en axonale compartimenten op elkaar zijn afgestemd. Nadat u de bestandsnaam hebt gewijzigd, verkrijgt u rode fluorescentiebeelden met behulp van 561 nanometer excitatie en 625 nanometer emissiegolflengten. Zorg voor een volumeverschil tussen de soma- en axonale kamers door de aanwezigheid van een spanningsbel aan de somatische kant te controleren.

Verwijder vervolgens het beeldvormende medium uit beide putjes van de axonale zijde, behalve het medium in het kanaal. Om mitochondriale depolarisatie te induceren, voegt u 160 microliter 20 micromolair antimycine A verdund in het beeldvormingsmedium toe aan de bovenste axonale put. Laat het door het kanaal stromen totdat er een gelijk volume is in beide axonale putten.

Herhaal de beeldvorming en zorg ervoor dat dezelfde posities worden weergegeven als tijdens de basislijnacquisitie, door de microgrooves te identificeren. Met behulp van dit protocol werden primaire hippocampale neuronen gekweekt in microfluïdische apparaten, gevolgd door mitochondriale kleuring met een membraangevoelige kleurstof, TMRE. Homogene kleuring van mitochondriën werd waargenomen aan beide zijden van de microgrooves, maar niet in het midden.

Bij toevoeging van antimycine A aan de axonale kant behielden somale mitochondriën het TMRE-signaal, terwijl de fluorescentie verloren ging uit de axonale mitochondriën Zorg ervoor dat er geen vocht achterblijft in de put of op het apparaat voordat u het apparaat assembleert. Anders worden de kamers niet verzegeld. Met behulp van deze methode kunnen we de effecten van verlies van mitochondriale functie in het axon en lokale functies bestuderen, evenals de invloed ervan op retrograde signalering en wereldwijde celoverleving.

Van mitochondriale biogenese werd lang gedacht dat het uitsluitend in het cellichaam voorkwam. Deze methode stelde ons in staat om te onthullen dat axonale mitochondriale schade lokale vertaling van het korte eiwit PINK1 vereiste.