Evaluatie en manipulatie van neurale activiteit met behulp van holografische microscopie met twee fotonen

Dit protocol biedt nauwkeurige ruimtelijke temporele informatie over neuroactiviteit. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het vermogen om neuroactiviteit te manipuleren en te evalueren met een hoge ruimtelijke temporele resolutie. Het kan nuttig zijn voor het illustreren van de pathogenen van neuropsychiatrische stoornissen die leiden tot afwijkingen in neurale activiteit.

Deze methode kan worden toegepast op de studie van neuronen en de gezondheid in de andere organen. Zhongtian Guo, promovendus van ons laboratorium, demonstreert de procedure. Een dag na de implantatie van de hoofdplaat dient u een uur voor de operatie 1,32 milligram per kilogram dexamethasonnatriumfosfaat intraperitoneaal toe om hersenoedeem te voorkomen.

Voer onder een stereoscoop een cirkelvormige craniotomie uit met een diameter van ongeveer twee millimeter met behulp van een tandartsboor. Om hersenschade te verminderen, bedient u de tandartsboor zorgvuldig met constante lichte beweging en lichte neerwaartse druk. Verwijder de botfragmenten meerdere keren met behulp van een zuigsysteem.

Gebruik na het verwijderen van het botfragment een kunstmatige spinale vloeistof of ACSF-oplossing om vuil dat achterblijft op het oppervlak van de hersenen te verwijderen en te wassen. Herhaal deze reinigingsprocedure meerdere keren om ontstekingsreacties te onderdrukken. Stel met behulp van een drukinjectiesysteem de juiste druk in om gedurende 10 minuten 500 nanoliter AAV-oplossing door een glazen capillair met een tipdiameter van 10 tot 20 micrometer te injecteren.

Als het niveau van de AAV-oplossing in het glazen capillair geleidelijk afneemt, wordt de AAV-oplossing aan de hersenen toegediend. Laat het glazen capillair nog 10 minuten op zijn plaats zitten om terugstroming te voorkomen. Herhaal dit drie keer om in totaal 1,5 microliter AAV-oplossing in de hersenen toe te dienen.

Breng 2% laag smeltende agarose aan op het hersenoppervlak van S1 met behulp van een micropipet en plaats vervolgens een glazen venster over de craniotomie met twee afdekglazen. Druk het afdekglas tegen de agarose terwijl deze nog vloeibaar is. Dit voorkomt de vorming van luchtbellen in de agarose.

Sluit de randen van het schedelvenster af met tandlijmharscement. Om het holografische stimulatiesysteem te kalibreren, plaatst u het oppervlak van een rode fluorescerende dia op het monstervlak en stelt u de microscoop in de live beeldvormingsmodus in met een zwak excitatielicht. Voer de kalibratie-GUI uit.

mfile, controleer het parametersvenster en klik op de knop Opslaan. Klik op de knop Z-scan in het deelvenster Stap één als er automatisch drie willekeurige plekken worden gegenereerd in 21 verschillende axiale vlakken op twee micrometers van elk vlak. Verplaats de schuifbalk en controleer de live afbeelding.

Zoek het perfecte vlak waar de vlekken het kleinst en het helderst lijken en klik vervolgens op de knop Opslaan. Dit genereert automatisch een offset bolvormig golffront voor het digitale hologram. Klik op de knop Ga in het deelvenster Stap twee en klik vervolgens op zes plekken in het linkervierkant.

Bekijk het live beeld. Als er zes fluorescerende vlekken te onderscheiden zijn, typt u hun x- en Y-as in de bewerkingsvakken en klikt u op de knop Opslaan. Dit genereert automatisch een fijne transformatiecoëfficiënt om de kalibratie tussen het holografische stimulatie- en beeldvormingssysteem te coördineren.

Klik vervolgens op de knop Scannen in het deelvenster Stap drie. Het zal 441 digitale hologrammen genereren om in 21 bij 21 stappen één plek over het gezichtsveld te scannen. Controleer de afbeeldingen tijdens het wijzigen van patronen in de keuzelijst.

Pas het laservermogen aan om steunbeelden te verkrijgen binnen het dynamische bereik van het beeldvormingsapparaat. Zet het beeldapparaat in de opnamemodus en klik op de knop Afspelen. Nadat het afspelen is voltooid, klikt u op Gewichtstoewijzing genereren in het deelvenster stap vier en kiest u een gestapelde afbeelding.

Sluit vervolgens het venster van de kalibratie-GUI. Het genereert automatisch een gewichtskaart om de onevenwichtige intensiteit op elke plek te compenseren. Plaats de AAV-geïnjecteerde muis met een kopplaat onder de microscoop en voer beeldvorming van twee fotonen uit met behulp van een holografische microscoop en een modus vergrendelde titanium saffierlaser afgestemd op 920 nanometer met een 25x objectief.

Open de commerciële beeldbewerkingssoftware in de live beeldvormingsmodus. Pas de spanning van de beelddetector en de kracht van de beeldlaser aan om de helderheid van de neuronen die GCaMP8f tot expressie brengen te optimaliseren. Leg beelden vast van de neuronen die dit eiwit tot expressie brengen.

Om de specifieke neuronen te verlichten met holografische verlichting, voert u de SLMcontrol uit. m scriptbestand. Klik op de referentieafbeelding en kies de verkregen afbeelding.

Klik vervolgens op de knop Spot om specifieke pixels op de neuronen in de afbeelding te kiezen en druk op de knop Enter op het toetsenbord om het te voltooien. Als u neurale activiteit met een hoge temporele resolutie wilt detecteren met behulp van een beeldsensor, stelt u de belichtingstijd, het beeldgebied en de binning in en voert u vervolgens de beeldacquisitie uit. Nadat u de muis onder de microscoop hebt geplaatst en beeldvorming met twee fotonen hebt uitgevoerd, opent u de commerciële beeldvormingssoftware.

Pas in de live beeldvormingsmodus de spanning van de beelddetector en de kracht van de beeldlaser aan om de helderheid van de neuronen te optimaliseren die GCaMP-6m-p2A-ChRmine tot expressie brengen. Leg beelden vast van de neuronen die deze eiwitten tot expressie brengen en verlicht vervolgens de specifieke neuronen volgens de eerder getoonde procedure. Om de functionele connectiviteit binnen laag twee en drie neuronen te onderzoeken, gebruikt u een ruimtelijke lichtmodulator om holografische patronen van optogenetische stimulatie te genereren en deze te combineren met twee-foton calciumbeeldvorming.

Stel de intensiteit van de beeldlaser in op 920 nanometer op 10 tot 20 milliwatt en het gezichtsveld op 256 micrometer bij 256 micrometer gemeten op een diepte van 100 tot 150 micrometer van het corticale oppervlak. Stel de verblijftijd van de pixel in op 1,5 microseconden gedurende twee hertz of 100 nanoseconden gedurende 30 hertz. Gebruik zowel twee hertz als 30 hertz als beeldframesnelheid om te zien of een enkele holografische stimulus een calciumrespons in de neuronen veroorzaakte.

Stel de intensiteit van de holografische stimulatielaser die een enkel neuron stimuleert in op 10 milliwatt, wat voldoende is om neurale activiteit te induceren. Beeld tegelijkertijd de calciumijzerrespons op 920 nanometer met 10 holografische stimuli op 1040 nanometer en intervallen van acht seconden voor een duur van 50 milliseconden na een basislijnperiode van 10 seconden. Breng de muis daarna terug naar zijn thuiskooi.

Het representatieve beeld en de sporen van neuronen die GCaMP8f tot expressie brengen in 100 hertz-beeldvorming met holografische stimulatie en een beeldsensor worden hier getoond. Deze grafiek toont de neurale respons op holografische stimulatie bij elk laservermogen. De representatieve Calcium 2+sporen tijdens holografische stimulatie van 10 verschillende neuronen bij twee hertz en 30 hertz beeldvormende framerates worden hier gepresenteerd.

Dezelfde kleur duidt op hetzelfde neuron. Een schematisch diagram dat functionele verbindingen tussen neuronen evalueert, wordt hier weergegeven. Wanneer het oranje neuron wordt gestimuleerd, reageren de rode neuronen tegelijkertijd om aan te geven dat er functionele connectiviteit is tussen deze neuronen.

Een typisch beeld van de primaire somatosensorische cortexneuronen die GCaMP6m in wild tot expressie brengen, wordt hier getoond. Deze grafische beelden vertegenwoordigen de typische Calcium 2+ sporen tijdens holografische stimulatie bij twee hertz en 30 hertz imaging frame rates. Neuroresponsiviteit op holografische stimulatie kan worden gedetecteerd met zowel twee hertz- als 30 hertz-beeldsnelheden.

Deze stappen zijn belangrijk om de beweging van de hersenen te verminderen en twee, stabiele resultaten te verkrijgen. Wij geloven dat deze microscoop gedrag kan induceren in het schrijven van neuronen met specifieke patronen. Met deze techniek zijn we nu in staat om de activiteit van individuele neuronen te beoordelen en te manipuleren en neuropsychiatrie in detail te karakteriseren.