En Gezicht Endocardiale kussenvoorbereiding voor planaire morfogeneseanalyse bij muizenembryo's

Dit protocol maakt de analyse van primitief endocardium in een vlakke oriëntatie mogelijk. We kunnen de verdeling van endocardcellen analyseren, de anisotropie van andere injuncties, en de vorm van een enkele endocardiale cel beschrijven tijdens de ontwikkeling van de klep. Vergeleken met de klassieke weefselsecties maakt de enface-beeldvorming van het regeneratieve gebied van de binnenklep de analyse mogelijk van de polariteit van planaire cellen en de dynamiek van endocardcellen tijdens de ontwikkeling van kleppen in intacte embryo's.

Deze methode kan worden gebruikt om de kennis van planaire celpolariteit tijdens cardio-ontwikkeling te verdiepen. Begin met het plaatsen van de baarmoeder die is weggesneden van geëuthanaseerde zwangere muizen in een petrischaal met ijskoude PBT. Verwijder de individuele deciduye uit de baarmoeder onder een ontleedmicroscoop met behulp van een fijne tang.

Maak met een fijn pincet een incisie in het witte deel van de decidua, waar het embryo zich bevindt. Verwijder het voorzichtig, vermijd trekken en breng de embryo's over naar een nieuwe petrischaal met verse PBT met behulp van een P-1000 met de punt afgesneden, waardoor een diameter overblijft die groot genoeg is voor een embryo om door te gaan zonder te breken. Neem voor genotypering een klein stukje van de dooierzak van ongeveer 0,5 vierkante millimeter of een stuk van de staart vanaf het achterste uiteinde, tel vijf tot 10 somites naar de kop en verteer het in 100 milliliter van de juiste buffer.

Breng de embryo's onder de zuurkast over naar ijskoude 4% PFA in een microcentrifugebuis van twee milliliter bij vier graden Celsius. Bevestig de embryo's van twee uur tot een nacht op vier graden Celsius op een nutator. Verwijder onder de zuurkast het 4% PFA-fixatief uit de microcentrifugebuizen zonder de embryo's aan te raken.

Gooi de PFA weg in een geschikte container. Was de embryo's vijf keer in koude PBT gedurende 10 minuten op kamertemperatuur. Verwijder het hart met behulp van een fijne tang en breng het over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 milliliter met verse PBT.

Vervang PBT door PBS Triton en was de monsters driemaal, elk vijf minuten, bij kamertemperatuur op een orbitale schudder. Vervang PBS Triton door een blokkerende oplossing die PBS Triton bevat door 10% warmte-geïnactiveerd runderserum. Incubeer van twee uur tot 's nachts bij vier graden Celsius op een orbitale shaker.

Vervang de blokkerende oplossing door een blokkerende oplossing die primair antilichaam bevat in de gewenste concentratie. Incubeer 's nachts op een orbitale shaker bij vier graden Celsius. Na nachtelijke incubatie bij vier graden Celsius, incubeer de monsters gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur op een orbitale shaker.

Deze stap is cruciaal om de signaal-ruisverhouding te verhogen. Verwijder en bewaar de primaire antilichaamoplossing op vier graden Celsius, tot drie toekomstige experimenten. Voeg natriumazide toe aan een eindconcentratie van 0,02% voor de beste conservering.

Was vervolgens de embryo's driemaal met PBS Triton gedurende drie minuten elk. Was de embryo's driemaal met PBS Triton gedurende 30 minuten en bewaar ze op een orbitale shaker op vier graden Celsius. Voeg na de laatste wasbeurt één milliliter blokkerende oplossing toe die fluorescentie-geconjugeerd secundair antilichaam bevat tegen de primaire antilichaamgastheersoort.

Voeg vervolgens DAPI toe aan de oplossing en incubeer de embryo's een nacht op een orbitale shaker bij vier graden Celsius. Na de nachtelijke incubatie bij vier graden Celsius, incubeer de embryo's gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur op een orbitale shaker. Deze stap is essentieel om de signaal-ruisverhouding te verhogen.

Herhaal de PBS Triton-wasstappen zoals vermeld in het tekstmanuscript. Leg de hartjes op een petrischaaltje van 35 millimeter met PBS. Isoleer met behulp van een wolfraamdraad en een fijne tang het atrioventriculaire kanaal of het uitstroomkanaal en snijd ze in de lengterichting door.

Bereid afdekslips, dia's, tangen, een P-200-pipet met de juiste tips, een papieren handdoek en alle waterige op glycerol gebaseerde montagemedia voor fluorescentie zonder DAPI. Plak twee stroken tape op een dia gescheiden door 0,3 tot 0,6 centimeter om een 3D-ruimteruimte te creëren waarmee de monsters hun oorspronkelijke vorm kunnen behouden zonder ze te verpletteren. Laat vervolgens met behulp van ongeveer 20 microliter buffer de monsters voorzichtig op de dia tussen de tapestroken vallen met behulp van een gesneden P-200 pipetpunt.

Gebruik een ontleedmicroscoop om de nauwkeurigheid te verhogen. Plaats de monsters met behulp van een fijne tang met het endocardium naar boven en het myocardium naar beneden op de glijbaan. Verwijder overtollige PBS met een papieren handdoek en raak het monster niet aan.

Droog de monsters vervolgens één tot twee minuten bij kamertemperatuur om de monsters aan de dia te laten kleven. Voeg 40 microliter waterige montagemedia toe aan het weefsel. Plaats de hoes over de twee stukjes tape en laat deze langzaam op het weefsel zakken met een naald of tang.

Vermijd het creëren van luchtbellen. Sluit de afdekslip af met één druppel nagellak op elke hoekpunt van de afdekslip. Zodra de nagellak droog is, reinigt u de overtollige bevestigingsmedia van de zijkanten van de afdekslip met behulp van een absorberend keukenpapier.

Vermijd het verplaatsen van de afdeksel. Voeg nagellak toe langs de randen van de afdekslip om deze volledig af te dichten, waardoor verdamping van montagemedia wordt voorkomen. Maak met behulp van een rechtopstaande of een omgekeerde confocale microscoop foto's met een vergroting van 10x voor algemeen zicht en met 63x met 3x zoom voor gedetailleerde beelden.

De celvorm van het endocardium werd geanalyseerd tijdens de vorming van de kleppen met een cellulaire resolutie. Enkele cellen of klonen van enkele cellen brachten GFP tot expressie in het endocardium. De GFP-expressie en combinatie met VE-cadherine subcellulaire lokalisatie was een effectieve benadering om de relatie tussen AJ-dynamica en filopodiavorming en pre-EMT-cellen te bestuderen, omdat deze cellen membraanuitsteeksels ontwikkelden terwijl AJ's oplossen.

Verschillen in de intensiteit van VE-cadherinekleuring in het endocardium wezen op de aanwezigheid van anisotrope contractiliteit in het embryonale endocardium van het atrioventriculaire kanaal in pre-valvulaire stadia. Het hele hart was gekleurd met VE-cadherine antilichaam op E8,5 en E9,5. Bij E8.5 had het endocardium van het atrioventriculaire kanaal de neiging om een stabiele epitheliale organisatie te hebben en hoekpunten gevormd door meer dan vier cellen werden niet gedetecteerd.

Bij E9.5 werden hoekpunten van maximaal zes cellen waargenomen die rozetachtige structuren vormden, vergelijkbaar met de cellulaire organisatie die eerder werd beschreven in epitheliale onderging actieve celherschikkingen, wat suggereert dat het atrioventriculaire kanaal endocardium dynamische cellulaire herschikking onderging tijdens de ontwikkeling van de klep. Een leercurve is noodzakelijk om een expert te worden in deze techniek. Bovendien wordt het ten zeerste aanbevolen om soevereine tangen en wolfraamdraad te gebruiken.

Tegenwoordig was de visualisatie van pre-valvulair endocardium beperkt tot doorsneden. Onze aanpak biedt de mogelijkheid om embryonaal valvulair endocardiumgedrag te bestuderen vanuit een planair oogpunt.