Een "Plug-And-Display" nanodeeltjesvaccinplatform op basis van buitenmembraanblaasjes met SARS-CoV-2-receptorbindend domein

Nanowetenschap kan de antigeenspecifieke immuunrespons effectief verbeteren na het weergeven van antigenen op het oppervlak van Het belangrijkste voordeel in dit vaccinplatform kan de go off plaque en weergave bereiken. Met andere woorden, het platform is in staat om de verscheidenheid aan antigenen in weer te geven Deze methode kan ook worden toegepast op andere biologische nanodeeltjes om motor- tot nano-dragers weer te geven. Om cytolysine A spy katheter transformatie uit te voeren, begint u met het toevoegen van vijf microliter plasma-oplossing aan 50 microliter BL 21 competente stam.

Blaas zachtjes en laat 30 minuten afkoelen op ijs. Plaats de oplossing gedurende 90 seconden in het waterbad bij 42 graden Celsius en zet de gemengde oplossing vervolgens onmiddellijk drie minuten op ijs. Voeg 500 microliter luria bertani medium toe aan de bacteriële suspensie en na mengcultuur met 220 omwentelingen per minuut bij 37 graden Celsius gedurende één uur.

Leg vervolgens alle transformatie luria bertani agar plaat met ampicilline en cultuur 's nachts op 37 graden Celsius. Voor de productie van OMV spycatcher, begin met het isoleren van een enkele kolonie van de plaat tot 20 milliliter luria bertani medium en cultuur 's nachts met 220 rotaties per minuut bij 37 graden Celsius. Incubeer de bacteriële oplossing in een medium van twee liter en kweek met 220 rotaties per minuut bij 37 graden Celsius gedurende vijf uur totdat het logaritmische groeistadium is bereikt.

Voeg isopropyl bèta D-IPTG toe om de uiteindelijke concentratie van de bacteriële oplossing 0,5 millimolar te maken en kweek vervolgens 's nachts met 220 rotaties per minuut bij 25 graden Celsius. Voer vervolgens OMV spycatcher-zuivering uit. Begin met centri fuseren van de bacteriële oplossing.

Filter het supernatant met een membraanfilter van 0,22 micrometer en concentreer het vervolgens met behulp van een holle vezelkolom. Filter het concentraat door een membraanfilter van 0,22 micrometer, smelt het vervolgens op 150.000 keer G bij vier graden Celsius gedurende twee uur met behulp van een ultracentri-zekering en gooi het supernatant weg met een pipet. Suspensie de neerslag opnieuw op met PBS en bewaar deze bij min 80 graden Celsius.

Om RBD spytag transfectie uit te voeren, begint u met het selecteren van een geschikt eukaryote expressiesysteem en kweekt u de cellen 's nachts met 130 rotaties per minuut bij 37 graden Celsius na herstel. Voeg 20 microliter HEK 293F celoplossing toe aan de geautomatiseerde celteller. Noteer het aantal cellen, pas de concentratie aan op één keer 10 tot de zes cellen per milliliter.

En dan kweken de cellen met 130 rotaties per minuut bij 37 graden Celsius gedurende vier uur. Filter RBD spy tag plasmide door een membraanfilter van 0,22 micrometer en voeg 300 microgram plasmiden toe aan het celkweekmedium totdat het uiteindelijke volume 10 milliliter is. Schud gedurende 10 seconden.

Verwarm PEI tot 65 graden Celsius in het waterbad. Meng 0,7 milliliter PEI met 9,3 milliliter celkweekmedium en schud met tussenpozen gedurende 10 seconden. Voeg plasmide-oplossing toe aan de PEI-oplossing.

Schud het mengsel met tussenpozen gedurende 10 seconden en incubeer het gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius. Voeg het mengsel toe aan 280 milliliter celkweekmedium en kweek met 130 rotaties per minuut bij 37 graden Celsius gedurende vijf dagen. Voer vervolgens RBD spytag-zuivering uit.

Begin met centri fuseren van de cellen op 6.000 keer G bij 25 graden Celsius gedurende 20 minuten en gebruik een pipet om het supernatant te verzamelen. Vul de kolom met twee milliliter nikkel NTA agarose en was deze drie keer met PBS. Voeg imidazool toe aan het celsupernatant om de uiteindelijke concentratie van 20 millimolar te maken en laad het celsupernatant.

Voeg drie kolomvolumes PBS met 20 millimol imidazol toe voor het wassen en verzamel de wasfractie. Gradiënt-eluut met drie kolomvolumes PBS met lage tot hoge concentraties imidazole-eluut tweemaal voor elke concentratie. Om de eiwitconcentratie met de BCA-methode te bepalen, verdunt u de standaard BSA-eiwitoplossing serieel van twee tot 0,0625 milligram per milliliter, verdunt u de gezuiverde OMV-spycatcher en RBD-spiontag 10 keer.

Meng vervolgens BCA-werkoplossingen A en B in een verhouding van 50 op één. Voeg verdunde eiwitoplossing toe en meng met BCA-werkoplossing. Incubeer op 37 graden gedurende 30 minuten.

Meet de absorptie op 562 nanometer van elke put en bereken de eiwitconcentratie uit de standaardcurve. Om bioconjugatie van OMV spycatcher en RBD spy tag uit te voeren, mengt u OMV spycatcher en RBD spytag en PBS in een verhouding van 40 op één. Verticaal draaien om het mengsel een nacht te mengen met 15 rotaties per minuut bij vier graden Celsius.

Voer zuivering van OMV RBD uit met behulp van PBS-oplossing met behulp van een procedure die vergelijkbaar is met OMV spycatcher-zuivering. Het plasmaontwerpschema laat zien dat het spycatcher-gen via flexibele linker verbonden is met het cly A-gen, terwijl de spytag verbinding maakt met de vijf priemterminal van het RBD-gen met een hys tag-gen voor zuivering en verificatie. Na ultracentrifugatie bleven bijna alle niet-gereageerde RBD-spytags in het supernatant achter.

De tweede ultracentrifugatie leverde geen verder significant voordeel op ten opzichte van de eerste keer. De gemiddelde hydrodynamische diameter van OMV spycatcher was 133 nanometer terwijl het 152,6 nanometer was voor OMV-RBD. Deze verschillen kunnen zijn omdat RBD de OMV-deeltjesgrootte verhoogt na intensieve weergave.

De resultaten van TEM komen overeen met de deeltjesgrootteverdeling die wordt verkregen uit de DLS-resultaten. Rotatie voor het mengen van het mengsel is erg belangrijk. De efficiëntie van de reactie kan veel lager zijn zonder rotatie.