Name: Een Plug-And-Display nanodeeltjesvaccinplatform op basis van buitenmembraanblaasjes met SARS-CoV-2-receptorbindend domein (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Ontdek de bio-engineering van buitenmembraanblaasjes als "Plug-and-Display" vaccinplatform. Deze methode toont antigeenpresentatie met SARS-CoV-2 RBD voor verbeterde immuunrespons in vaccinontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het Sleutelprogramma van de Chongqing Natural Science Foundation (Nr. cstc2020jcyj-zdxmX0027) en het Chinese National Natural Science Foundation Project (nr. 31670936, 82041045).

1. Plasmide constructie
<ol><li>Plaats DNA-coderende SpyCatcher-sequentie (aanvullend bestand 1) in een ampicilline-resistent pThioHisA-ClyA-plasmide (zie Materiaaltabel) tussen de BamH I- en Sal I-locaties om het plasmide pThioHisA ClyA-SC te construeren naar aanleiding van een eerder gepubliceerd rapport20.</li>
	<li>Ligaat het gesynthetiseerde SpyTag-RBD-Histag fusiegen (Aanvullend Bestand 1) in een pcDNA3.1 plasmide (zie Tabel van Materialen) tussen de BamH I en EcoR I sites om het plasmide pcDNA3.1 RBD-ST te construeren naar aanleiding van een eerder gepubliceerd rapport19.</li>
</ol>2. OMV-SC voorbereiding
<ol><li>Voer ClyA-SC-transformatie uit volgens de onderstaande stappen.<ol><li>Voeg 5 μL pThioHisA ClyA-SC plasmide-oplossing (50 ng/μL) toe aan 50 μL BL21 competente stam, blaas voorzichtig en laat gedurende 30 minuten afkoelen op ijs.</li>
		<li>Plaats de oplossing gedurende 90 s in het waterbad bij 42 °C en zet de gemengde oplossing onmiddellijk op ijs gedurende 3 minuten.</li>
		<li>Voeg 500 μL LB-medium toe aan de bacteriële suspensie en kweek na menging bij 1 uur bij 220 tpm bij 37 °C.</li>
		<li>Breng de hele transformatie op een LB-agarplaat met ampicilline (100 μg/ml, zie Materiaaltabel) en kweek 's nachts bij 37 °C. OPMERKING: In latere experimenten werd de ampicilline in dezelfde concentratie in het medium gehouden. Zo niet, dan kan dit verlies van plasmiden in de bacteriën veroorzaken.</li>
	</ol></li>
	<li>Voer voor OMV-SC-productie de onderstaande stappen uit.<ol><li>Isoleer een enkele kolonie van de plaat (stap 2.1.4.) tot 20 ml LB (ampicilline-resistent) medium en kweek 's nachts bij 220 tpm bij 37 °C.</li>
		<li>Ent de bacteriële oplossing (vanaf stap 2.2.1.) in 2 L medium, kweek bij 220 rpm, 37 °C gedurende 5 uur tot de logaritmische groeifase (de OD600nm ligt tussen 0,6 en 0,8).</li>
		<li>Wanneer de OD bij 600 nm van de bacteriële oplossing 0,6-0,8 bereikt, voegt u isopropyl bèta-D-thiogalactopyranoside (IPTG, zie Materiaaltabel) toe om de uiteindelijke concentratie van de bacteriële oplossing op 0,5 mM te brengen en vervolgens 's nachts te kweken bij 220 tpm bij 25 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Voer OMV-SC-zuivering uit.<ol><li>Centrifugeer de bacteriële oplossing bij 7.000 x g bij 4 °C gedurende 30 minuten.</li>
		<li>Filter het supernatant met een membraanfilter van 0,22 μm en concentreer het vervolgens met behulp van een 100 kD ultrafiltratiemembraan of holle vezelkolom (zie Materiaaltabel).</li>
		<li>Filtreer het concentraat door een membraanfilter van 0,22 μm, centrifugeer het vervolgens bij 150.000 x g bij 4 °C gedurende 2 uur met behulp van een ultracentrifuge (zie materiaaltabel) en gooi het supernatant weg met een pipet.</li>
		<li>Resuspendeer de neerslag met PBS en bewaar deze bij −80 °C. De oplossing kan op lange termijn stabiliteit handhaven bij −80 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Voorbereiding van RBD-ST
<ol><li>Voer RBD-ST transfectie uit volgens de onderstaande stappen.<ol><li>Selecteer een geschikt eukaryote expressiesysteem (bijv. HEK293F) en kweek de cellen 's nachts bij 130 tpm bij 37 °C na herstel.</li>
		<li>Voeg 20 μL HEK293F-celoplossing toe aan de geautomatiseerde celteller (zie Materiaaltabel), noteer het aantal cellen, pas de concentratie aan op 1 x 106 cellen/ml en kweek de cellen vervolgens bij 130 rpm bij 37 °C gedurende 4 uur.</li>
		<li>Filtreer RBD-ST plasmide door een membraanfilter van 0,22 μm en voeg 300 μg plasmiden toe aan het celkweekmedium (zie Materiaaltabel) tot het uiteindelijke volume 10 ml is; schud gedurende 10 s.</li>
		<li>Verwarm PEI (1 mg/ml, zie materiaaltabel) tot 65 °C in het waterbad, meng 0,7 ml PEI met 9,3 ml celkweekmedium en schud met tussenpozen gedurende 10 s. OPMERKING: Schud de oplossing niet krachtig. Anders kunnen de resulterende bellen de transfectie-efficiëntie beïnvloeden.</li>
		<li>Voeg plasmide-oplossing toe aan de PEI-oplossing, schud het mengsel met tussenpozen gedurende 10 s en incubeer het bij 37 °C gedurende 15 minuten.</li>
		<li>Voeg het mengsel toe aan 280 ml celkweekmedium en kweek bij 130 tpm bij 37 °C gedurende 5 dagen.</li>
	</ol></li>
	<li>Voer RBD-ST-zuivering uit.<ol><li>Centrifugeer de cellen bij 6.000 x g bij 25 °C gedurende 20 minuten en gebruik een pipet om het supernatant te verzamelen.</li>
		<li>Vul de kolom met 2 ml Ni-NTA agarose (zie Materiaaltabel) en was deze 3x met 3x PBS.</li>
		<li>Voeg imidazool (zie tabel met materialen) toe aan het celsupernatant om de uiteindelijke concentratie van 20 mM te maken en laad het celsupernatant 2x.</li>
		<li>Voeg 3 kolomvolumes (CV) PBS met 20 mM imidazool toe voor het wassen en verzamel de wasfractie.</li>
		<li>Gradiënt-eluut met 3 CV pbs met lage tot hoge concentraties (bijv. 0,3 M, 0,4 M, 0,5 M) imidazol; elute 2x voor elke concentratie.</li>
		<li>Gebruik SDS-PAGE21 om de RBD-ST in verschillende concentratiegradiënten te identificeren.</li>
	</ol></li>
</ol>4. OMV-RBD bioconjugatie en zuivering
<ol><li>Bepaal de eiwitconcentratie met behulp van de BCA-methode (zie Materiaal tabel).<ol><li>Verdun de standaard BSA-eiwitoplossing serieel van 2 mg / ml tot 0,0625 mg / ml, verdun de gezuiverde OMV-SC en RBD-ST 10x en meng vervolgens BCA-werkoplossingen A en B (meegeleverd in de testkit) in een verhouding van 50: 1 (v / v).</li>
		<li>Voeg verdunde eiwitoplossing (25 μL/put) toe en meng met BCA-werkoplossing (200 μL/put); incubeer bij 37 °C gedurende 30 min.</li>
		<li>Meet de absorptie (OD) bij 562 nm van elke put en bereken de eiwitconcentratie uit de standaardcurve22.</li>
	</ol></li>
	<li>Voer bioconjugatie van OMV-SC en RBD-ST uit volgens de onderstaande stappen.<ol><li>Meng OMV-SC en RBD-ST in PBS in een verhouding van 40:1 (w/w).</li>
		<li>Verticaal draaien om het mengsel een nacht bij 15 tpm bij 4 °C te mengen. OPMERKING: Verschillende antigenen kunnen in verschillende verhoudingen reageren. Men zou verschillende reactieverhoudingen kunnen proberen op basis van de kenmerken van het antigeen.</li>
	</ol></li>
	<li>Controleer de reactie-efficiëntie.<ol><li>Bereid 10 μL OMV-SC, RBD-ST en het reactieproduct (stap 4.2.). Voeg 2,5 μL 5x de belastingsbuffer toe (zie materiaaltabel) en verwarm de monsters gedurende 5 minuten bij 100 °C. Laad de monsters in de gel (10 μL/putje). Voer elektroforese uit bij 60 V gedurende 20 minuten en verander de toestand in 120 V gedurende 1 uur.</li>
		<li>Breng het eiwit over van de gel naar PVDF western blotting membranen (zie Materiaaltabel) bij 100 V gedurende 70 min.</li>
		<li>Doe het membraan in 5% vetvrije melkpoeder/TBST en schud gedurende 1 uur. Was vervolgens 3x met TBST gedurende 5 minuten per wasbeurt met schudden.</li>
		<li>Doe het membraan in 0,1% His-Tag antilichaam/TBST (zie Tabel van Materialen) en schud gedurende 1 uur, was vervolgens 3x met TBST gedurende 5 minuten per wasbeurt met schudden.</li>
		<li>Doe het membraan in 0,02% anti-muis IgG1 antilichaam (HRP)/TBST (zie Materiaaltabel) en schud gedurende 40 minuten en was vervolgens 3x met TBST gedurende 5 minuten per wasbeurt met schudden.</li>
		<li>Voeg verbeterde chemiluminescentieoplossing toe (zie Tabel van materialen) en leg het membraan bloot.</li>
	</ol></li>
	<li>Voer zuivering van OMV-RBD uit.<ol><li>Verdun 1 ml gereageerde OMV-RBD-oplossing tot 10 ml en centrifugeer de verdunning bij 150.000 x g bij 4 °C gedurende 2 uur.</li>
		<li>Gebruik een pipet om het supernatant weg te gooien en het residu op te hangen met 10 ml PBS. Centrifugeer de suspensie bij 150.000 x g bij 4 °C gedurende 2 uur.</li>
		<li>Gooi het supernatant weg en suspensie het residu met 1 ml PBS. OPMERKING: Als de oplosbaarheid van het antigeen veel lager is, kan hetzelfde scheidingseffect worden bereikt door grootte-uitsluitingschromatografie19.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Karakterisering
<ol><li>Voer dynamische lichtverstrooiing (DLS) uit.<ol><li>Verdun de monsters tot een concentratie van 100 μg/ml en voeg 1 ml monster toe aan de monstercel.</li>
		<li>Kies "Grootte" voor "Meettype", "Eiwit" voor "Monstermateriaal", "Water" voor "Dispergeermiddel", "25 °C" voor "Temperatuur", en laad vervolgens monsters en meet automatisch23.</li>
	</ol></li>
	<li>Leg beelden vast met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM).<ol><li>Verdun de monsters tot 100 μg/ml. Neem een koperen rooster van 200 mazen, voeg er 20 μL monster aan toe en laat het gedurende 10 minuten absorberen.</li>
		<li>Gebruik filterpapier om de oplossing af te voeren, voeg 20 μL 3% uranylacetaat toe aan de steunfolie en bevlek gedurende 30 s.</li>
		<li>Spoel het uranylacetaat af en droog de film op natuurlijke wijze bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.</li>
		<li>Laad de monsters op het TEM-systeem (zie Materiaaltabel) en maak beelden met 80 kV.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+outer+membrane+vesicles+as+a+platform+for+biomedical+applications%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Bacterial outer membrane vesicles as a platform for biomedical applications: An update.</a> Journal of Controlled Release. 323, 253-268 (2020).</li>
<li>Micoli, F., MacLennan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+vesicle+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Outer membrane vesicle vaccines.</a> Seminars in Immunology. 50, 101433(2020).</li>
<li>Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Types+and+origins+of+bacterial+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Types and origins of bacterial membrane vesicles.</a> Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).</li>
<li>Sartorio, M. G., Pardue, E. J., Feldman, M. F., Haurat, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+outer+membrane+vesicles%3A+From+discovery+to+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial outer membrane vesicles: From discovery to applications.</a> Annual Review of Microbiology. 75, 609-630 (2021).</li>
<li>Kaparakis-Liaskos, M., Ferrero, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+modulation+by+bacterial+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immune modulation by bacterial outer membrane vesicles.</a> Nature Reviews Immunology. 15 (6), 375-387 (2015).</li>
<li>Petousis-Harris, H., Radcliff, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploitation+of+Neisseria+meningitidis+group+B+OMV+vaccines+against+N-gonorrhoeae+to+inform+the+development+and+deployment+of+effective+gonorrhea+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Exploitation of Neisseria meningitidis group B OMV vaccines against N-gonorrhoeae to inform the development and deployment of effective gonorrhea vaccines.</a> Frontiers in Immunology. 10, 683(2019).</li>
<li>Gnopo, Y. M. D., Watkins, H. C., Stevenson, T. C., DeLisa, M. P., Putnam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+outer+membrane+vesicles+as+immunomodulatory+systems+-+Reprogramming+bacteria+for+vaccine+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Designer outer membrane vesicles as immunomodulatory systems - Reprogramming bacteria for vaccine delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 114, 132-142 (2017).</li>
<li>Zhang, Y. X., Fang, Z. Y., Li, R. Z., Huang, X. T., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+outer+membrane+vesicles+as+cancer+vaccines%3A+A+new+toolkit+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Design of outer membrane vesicles as cancer vaccines: A new toolkit for cancer therapy.</a> Cancers. 11 (9), 1314(2019).</li>
<li>Berleman, J., Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+bacterial+outer+membrane+vesicles+for+intra-+and+interspecies+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery.</a> Environmental Microbiology. 15 (2), 347-354 (2013).</li>
<li>Huang, W. L., Meng, L. X., Chen, Y., Dong, Z. Q., Peng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+outer+membrane+vesicles+as+potential+biological+nanomaterials+for+antibacterial+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Bacterial outer membrane vesicles as potential biological nanomaterials for antibacterial therapy.</a> Acta Biomaterialia. 140, 102-115 (2022).</li>
<li>Hoffmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+cell+entry+depends+on+ACE2+and+TMPRSS2+and+is+blocked+by+a+clinically+proven+protease+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor.</a> Cell. 181 (2), 271-280 (2020).</li>
<li>Robbiani, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergent+antibody+responses+to+SARS-CoV-2+in+convalescent+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Convergent antibody responses to SARS-CoV-2 in convalescent individuals.</a> Nature. 584 (7821), 437-442 (2020).</li>
<li>Wang, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2%3A+Structure%2C+Biology%2C+and+Structure-Based+Therapeutics+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2: Structure, Biology, and Structure-Based Therapeutics Development.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269(2020).</li>
<li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+immunogenicity+of+a+recombinant+tandem-repeat+dimeric+RBD-based+protein+subunit+vaccine+%28ZF2001%29+against+COVID-19+in+adults%3A+Two+randomised%2C+double-blind%2C+placebo-controlled%2C+phase+1+and+2+trials%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">Safety and immunogenicity of a recombinant tandem-repeat dimeric RBD-based protein subunit vaccine (ZF2001) against COVID-19 in adults: Two randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1 and 2 trials.</a> The Lancet Infectious Disease. 21 (8), 1107-1119 (2021).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+vaccine-elicited+antibodies+to+SARS-CoV-2+and+circulating+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">mRNA vaccine-elicited antibodies to SARS-CoV-2 and circulating variants.</a> Nature. 592 (7855), 616-622 (2021).</li>
<li>Amanat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+mRNA+vaccination+induces+functionally+diverse+antibodies+to+NTD%2C+RBD%2C+and+S2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 mRNA vaccination induces functionally diverse antibodies to NTD, RBD, and S2.</a> Cell. 184 (15), 3936-3948 (2021).</li>
<li>Tan, H. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+prime-boost+protein+subunit+vaccine+strategies+against+SARS-CoV-2+in+mice+and+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of prime-boost protein subunit vaccine strategies against SARS-CoV-2 in mice and macaques.</a> Nature Communication. 12 (1), 1403(2021).</li>
<li>Thapa, H. B., Mueller, A. M., Camilli, A., Schild, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intranasal+vaccine+based+on+outer+membrane+vesicles+against+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">An intranasal vaccine based on outer membrane vesicles against SARS-CoV-2.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 752739(2021).</li>
<li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+vaccines+based+on+the+receptor+binding+domain+%28RBD%29+and+heptad+repeat+%28HR%29+of+SARS-CoV-2+elicit+robust+protective+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle vaccines based on the receptor binding domain (RBD) and heptad repeat (HR) of SARS-CoV-2 elicit robust protective immune responses.</a> Immunity. 53 (6), 1315-1330 (2020).</li>
<li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RBD-modified+bacterial+vesicles+elicited+potential+protective+immunity+against+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">RBD-modified bacterial vesicles elicited potential protective immunity against SARS-CoV-2.</a> Nano Letters. 21 (14), 5920-5930 (2021).</li>
<li>Rhinesmith, T., Killinger, B. A., Sharma, A., Moszczynska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimer-PAGE%3A+A+method+for+capturing+and+resolving+protein+complexes+in+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Multimer-PAGE: A method for capturing and resolving protein complexes in biological samples.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55341(2017).</li>
<li>Arslan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+total+protein+and+bioactive+protein+concentrations+in+bovine+colostrum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Determining total protein and bioactive protein concentrations in bovine colostrum.</a> Journal of Visualized Experiments. (178), e63001(2021).</li>
<li>Alves, N. J., Turner, K. B., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+protein+packaging+within+outer+membrane+vesicles+from+Escherichia+coli%3A+Design%2C+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Directed protein packaging within outer membrane vesicles from Escherichia coli: Design, production and purification.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54458(2016).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+transcriptomic+landscape+of+Escherichia+coli+BL21%28DE3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Genomic and transcriptomic landscape of Escherichia coli BL21(DE3).</a> Nucleic Acids Research. 45 (9), 5285-5293 (2017).</li>
<li>Daleke-Schermerhorn, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoration+of+outer+membrane+vesicles+with+multiple+antigens+by+using+an+autotransporter+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Decoration of outer membrane vesicles with multiple antigens by using an autotransporter approach.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (18), 5854-5865 (2014).</li>
<li>Kuipers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+outer+membrane+vesicles+displaying+high+densities+of+pneumococcal+antigen+at+the+surface+offer+protection+against+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Salmonella outer membrane vesicles displaying high densities of pneumococcal antigen at the surface offer protection against colonization.</a> Vaccine. 33 (17), 2022-2029 (2015).</li>
<li>Veggiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+polyproteams+built+using+twin+peptide+superglues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Programmable polyproteams built using twin peptide superglues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (5), 1202-1207 (2016).</li>
<li>Saunders, K. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutralizing+antibody+vaccine+for+pandemic+and+pre-emergent+coronaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neutralizing antibody vaccine for pandemic and pre-emergent coronaviruses.</a> Nature. 594, 553-559 (2021).</li>
<li>van Saparoea, H. B. V., Houben, D., Kuijl, C., Luirink, J., Jong, W. S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+protein+ligation+systems+to+expand+the+functionality+of+semi-synthetic+outer+membrane+vesicle+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Combining protein ligation systems to expand the functionality of semi-synthetic outer membrane vesicle nanoparticles.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 890(2020).</li>
<li>Needham, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+the+innate+immune+response+by+combinatorial+engineering+of+endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Modulating the innate immune response by combinatorial engineering of endotoxin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1464-1469 (2013).</li>
<li>Zanella, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-minimized+outer+membrane+vesicles+from+Escherichia+coli+as+a+generalized+vaccine+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Proteome-minimized outer membrane vesicles from Escherichia coli as a generalized vaccine platform.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (4), 12066(2021).</li>
<li>Wang, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Truncating+the+structure+of+lipopolysaccharide+in+Escherichia+coli+can+effectively+improve+poly-3-hydroxybutyrate+production%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Truncating the structure of lipopolysaccharide in Escherichia coli can effectively improve poly-3-hydroxybutyrate production.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1201-1215 (2020).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+vesicles+from+flagellin-deficient+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+induce+cross-reactive+immunity+and+provide+cross-protection+against+heterologous+Salmonella+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Outer membrane vesicles from flagellin-deficient Salmonella enterica serovar Typhimurium induce cross-reactive immunity and provide cross-protection against heterologous Salmonella challenge.</a> Scientific Reports. 6, 34776(2016).</li>
<li>Balhuizen, M. D., Veldhuizen, E. J. A., Haagsman, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+vesicle+induction+and+isolation+for+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Outer membrane vesicle induction and isolation for vaccine development.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 629090(2021).</li>
<li>Hua, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+immunomodulator+delivery+platform+based+on+bacterial+biomimetic+vesicles+for+enhanced+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">A novel immunomodulator delivery platform based on bacterial biomimetic vesicles for enhanced antitumor immunity.</a> Advanced Materials. 33 (43), 2103923(2021).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Om een "Plug-and-Display" nanodeeltjesvaccinplatform te creëren, werd SC-gefuseerde ClyA uitgedrukt in BL21 (DE3) -stammen, een van de meest gebruikte modellen voor recombinante eiwitproductie vanwege de voordelen in eiwitexpressie24, zodat er voldoende SC-fragment op het oppervlak van de OMV's zou worden weergegeven tijdens het proces van bacterieproliferatie. Tegelijkertijd werd een ST-gesmolten doelantigeen voorbereid voor de chemische koppeling tussen de antigenen en OMV's. De voordelen van di...

Als potentieel vaccinplatform hebben buitenmembraanblaasjes (OMV's) de afgelopen jaren steeds meer aandacht getrokken 1,2. OMV's, voornamelijk van nature uitgescheiden door gramnegatieve bacteriën3, zijn bolvormige deeltjes op nanoschaal die bestaan uit een lipide bilayer, meestal in de grootte van 20-300 nm4. OMV's bevatten verschillende ouderlijke bacteriële componenten, waaronder bacteriële antigenen en pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs), die dienen als solide immuunpotentiators5. Profiterend van hun unieke componenten, natuurlijke blaasjesstructuur en geweldige genetische manipulatiemodificatielocaties, zijn OMV's ontwikkeld voor gebruik op vele biomedische gebieden, waaronder bacteriële vaccins6, adjuvantia7, kankerimmunotherapiegeneesmiddelen8, medicijnafgiftevectoren9 en antibacteriële kleefstoffen10.
De SARS-CoV-2-pandemie, die zich sinds 2020 wereldwijd heeft verspreid, heeft een zware tol geëist van de wereldwijde samenleving. Het receptorbindende domein (RBD) in spike-eiwit (S-eiwit) kan binden met humaan angiotensine-converterend enzym 2 (ACE2), dat vervolgens de binnenkomst van het virus in de cel bemiddelt 11,12,13. RBD lijkt dus een belangrijk doelwit te zijn voor vaccinontdekking 14,15,16. Monomere RBD is echter slecht immunogeen en het kleine molecuulgewicht maakt het moeilijk voor het immuunsysteem om te herkennen, dus adjuvantia zijn vaak nodig17.
Om de immunogeniciteit van RBD te verhogen, werden OMV's met polyvalente RBD's geconstrueerd. Bestaande studies die OMV gebruiken om RBD weer te geven, fuseren RBD meestal met OMV om tot expressie te komen in bacteriën18. RBD is echter een van het virus afgeleid eiwit en prokaryote expressie heeft waarschijnlijk invloed op de activiteit ervan. Om dit probleem op te lossen, werd het SpyTag (ST)/SpyCatcher (SC) systeem, afgeleid van Streptococcus pyogenes, gebruikt om een covalent isopeptide met OMV en RBD te vormen in een conventioneel buffersysteem19. Het SC-domein werd uitgedrukt met Cytolysine A (ClyA) als een fusie-eiwit door bio-engineered Escherichia coli, en ST werd uitgedrukt met RBD via het HEK293F cellulaire expressiesysteem. OMV-SC en RBD-ST werden 's nachts gemengd en geïncubeerd. Na zuivering door ultracentrifugatie of grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) werd OMV-RBD verkregen.

<table><tbody><tr><td>Ampicillin natrium</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610028</td><td></td></tr><tr><td>Geautomatiseerde celteller</td><td>Countstar</td><td>BioTech</td><td></td></tr><tr><td>BCA-kit voor eiwitkwantificering</td><td>cwbio</td><td>cw0014s</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc Touch Imaging System</td><td>Bio-rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynamische lichtverstrooiing</td><td>Malvern</td><td>Zetasizer Nano S90</td><td></td></tr><tr><td>Elekforese-apparaat</td><td>Cavoy</td><td>Power BV</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Buffers H 10X TBST-buffer</td><td>Sangon Biotech</td><td>C520009</td><td></td></tr><tr><td>Geit pAb naar muis IgG1</td><td>Abcam</td><td>ab97240</td><td></td></tr><tr><td>Hogesnelheidsvriescentrifuge</td><td>Bioridge</td><td>H2500R</td><td></td></tr><tr><td>His-Tag muis mAb</td><td>Cell signaling technology</td><td>2366s</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600277</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl beta-D-thiogalactopyranosid</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600118</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA His-Bind Superflow</td><td>Qiagen</td><td>70691</td><td></td></tr><tr><td>Melkvrij poeder</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600669</td><td></td></tr><tr><td>OPM-293 celkweekmedium</td><td>Opm biosciences</td><td>81075-001</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1 RBD-ST-plasmide</td><td>Wuhan genecreat biologische technologie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfaatbufferoplossing</td><td>ZSGB-bio</td><td>ZLI-9061</td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleenimien Lineair</td><td>Polysciences</td><td>23966-1</td><td></td></tr><tr><td>Voorgekleurde eiwitladder</td><td>Thermo</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>pThioHisA ClyA-SC-plasmide</td><td>Wuhan genecreat biologische technologie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PVDF Western Blotting Membranes</td><td>Roche</td><td>03010040001</td><td></td></tr><tr><td>Quixstand tafelsystemen (100 kD holle vezelkolom)</td><td>GE healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE-laadbuffer (5x)</td><td>Beyotime</td><td>P0015</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100241</td><td></td></tr><tr><td>Supersignal west pico PLUS (verbeterde chemiluminescentieoplossing)</td><td>Thermo</td><td>34577</td><td></td></tr><tr><td>Suspensie-instrument</td><td>Life Technology</td><td>Hula Mixer</td><td></td></tr><tr><td>Transmissie-elektronenmicroscoop</td><td>Hitachi</td><td>HT7800</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Oxoid</td><td>LP0042B</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman coulter</td><td>XPN-100</td><td></td></tr><tr><td>Ultraviolet spectrofotometer</td><td>Hitachi</td><td>U-3900</td><td></td></tr><tr><td>Gistextract</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610961</td><td></td></tr></tbody></table>

een "plug-and-display" nanodeeltjesvaccinplatform op basis van buitenmembraanblaasjes met sars-cov-2-receptorbindend domein

A "Plug-And-Display" Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain

Biomimetische nanodeeltjes verkregen uit bacteriën of virussen hebben aanzienlijke belangstelling getrokken voor vaccinonderzoek en -ontwikkeling. Buitenmembraanblaasjes (OMV's) worden voornamelijk uitgescheiden door gramnegatieve bacteriën tijdens de gemiddelde groei, met een nanodiameter en zelfadjuvante activiteit, wat ideaal kan zijn voor de levering van vaccins. OMV's hebben gefunctioneerd als een veelzijdig afgiftesysteem voor eiwitten, nucleïnezuren en kleine moleculen. Om ten volle te profiteren van de biologische kenmerken van OMV's, werden bio-technische Escherichia coli-afgeleide OMV's gebruikt als drager en SARS-CoV-2 receptorbindingsdomein (RBD) als een antigeen om een "Plug-and-Display" vaccinplatform te bouwen. De SpyCatcher (SC) en SpyTag (ST) domeinen in Streptococcus pyogenes werden toegepast om OMV's en RBD te conjugeren. Het Cytolysine A (ClyA) gen werd vertaald met het SC gen als een fusie-eiwit na plasmide transfectie, waardoor een reactieve plaats op het oppervlak van de OMV's achterbleef. Na het 's nachts mengen van RBD-ST in een conventioneel buffersysteem werd een covalente binding gevormd tussen de OMV's en RBD. Zo werd een multivalent omv-vaccin bereikt. Door te vervangen door diverse antigenen, kan het OMV-vaccinplatform efficiënt een verscheidenheid aan heterogene antigenen weergeven, waardoor epidemieën van infectieziekten mogelijk snel worden voorkomen. Dit protocol beschrijft een nauwkeurige methode voor het bouwen van het OMV-vaccinplatform, inclusief productie, zuivering, bioconjugatie en karakterisering.

Het stroomdiagram voor dit protocol is weergegeven in figuur 1. Dit protocol zou een algemene benadering kunnen zijn voor het gebruik van OMV's als vaccinplatform; men hoeft alleen de juiste expressiesystemen te kiezen op basis van het type antigenen.
Figuur 2 geeft een haalbaar plasmide-ontwerpschema. Het SC-gen is verbonden met het ClyA-gen via een flexibele linker, terwijl ST verbinding maakt met de 5'-terminal van het RBD-gen met ...

Het huidige protocol beschrijft de bio-engineering van buitenmembraanblaasjes als een "Plug-and-Display" vaccinplatform, inclusief productie, zuivering, bioconjugatie en karakterisering.

Een "Plug-And-Display" nanodeeltjesvaccinplatform op basis van buitenmembraanblaasjes met SARS-CoV-2-receptorbindend domein

Biomimetic nanoparticles obtained from bacteria or viruses have attracted substantial interest in vaccine research and development. Outer membrane ...

Nanowetenschap kan de antigeenspecifieke immuunrespons effectief verbeteren na het weergeven van antigenen op het oppervlak van Het belangrijkste voordeel in dit vaccinplatform kan de go off plaque en weergave bereiken. Met andere woorden, het platform is in staat om de verscheidenheid aan antigenen in weer te geven Deze methode kan ook worden toegepast op andere biologische nanodeeltjes om motor- tot nano-dragers weer te geven. Om cytolysine A spy katheter transformatie uit te voeren, begint u met het toevoegen van vijf microliter plasma-oplossing aan 50 microliter BL 21 competente stam.Blaas zachtjes en laat 30 minuten afkoelen op ijs. Plaats de oplossing gedurende 90 seconden in het waterbad bij 42 graden Celsius en zet de gemengde oplossing vervolgens onmiddellijk drie minuten op ijs. Voeg 500 microliter luria bertani medium toe aan de bacteriële suspensie en na mengcultuur met 220 omwentelingen per minuut bij 37 graden Celsius gedurende één uur.Leg vervolgens alle transformatie luria bertani agar plaat met ampicilline en cultuur 's nachts op 37 graden Celsius. Voor de productie van OMV spycatcher, begin met het isoleren van een enkele kolonie van de plaat tot 20 milliliter luria bertani medium en cultuur 's nachts met 220 rotaties per minuut bij 37 graden Celsius. Incubeer de bacteriële oplossing in een medium van twee liter en kweek met 220 rotaties per minuut bij 37 graden Celsius gedurende vijf uur totdat het logaritmische groeistadium is bereikt.Voeg isopropyl bèta D-IPTG toe om de uiteindelijke concentratie van de bacteriële oplossing 0,5 millimolar te maken en kweek vervolgens 's nachts met 220 rotaties per minuut bij 25 graden Celsius. Voer vervolgens OMV spycatcher-zuivering uit. Begin met centri fuseren van de bacteriële oplossing.Filter het supernatant met een membraanfilter van 0,22 micrometer en concentreer het vervolgens met behulp van een holle vezelkolom. Filter het concentraat door een membraanfilter van 0,22 micrometer, smelt het vervolgens op 150.000 keer G bij vier graden Celsius gedurende twee uur met behulp van een ultracentri-zekering en gooi het supernatant weg met een pipet. Suspensie de neerslag opnieuw op met PBS en bewaar deze bij min 80 graden Celsius.Om RBD spytag transfectie uit te voeren, begint u met het selecteren van een geschikt eukaryote expressiesysteem en kweekt u de cellen 's nachts met 130 rotaties per minuut bij 37 graden Celsius na herstel. Voeg 20 microliter HEK 293F celoplossing toe aan de geautomatiseerde celteller. Noteer het aantal cellen, pas de concentratie aan op één keer 10 tot de zes cellen per milliliter.En dan kweken de cellen met 130 rotaties per minuut bij 37 graden Celsius gedurende vier uur. Filter RBD spy tag plasmide door een membraanfilter van 0,22 micrometer en voeg 300 microgram plasmiden toe aan het celkweekmedium totdat het uiteindelijke volume 10 milliliter is. Schud gedurende 10 seconden.Verwarm PEI tot 65 graden Celsius in het waterbad. Meng 0,7 milliliter PEI met 9,3 milliliter celkweekmedium en schud met tussenpozen gedurende 10 seconden. Voeg plasmide-oplossing toe aan de PEI-oplossing.Schud het mengsel met tussenpozen gedurende 10 seconden en incubeer het gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius. Voeg het mengsel toe aan 280 milliliter celkweekmedium en kweek met 130 rotaties per minuut bij 37 graden Celsius gedurende vijf dagen. Voer vervolgens RBD spytag-zuivering uit.Begin met centri fuseren van de cellen op 6.000 keer G bij 25 graden Celsius gedurende 20 minuten en gebruik een pipet om het supernatant te verzamelen. Vul de kolom met twee milliliter nikkel NTA agarose en was deze drie keer met PBS. Voeg imidazool toe aan het celsupernatant om de uiteindelijke concentratie van 20 millimolar te maken en laad het celsupernatant.Voeg drie kolomvolumes PBS met 20 millimol imidazol toe voor het wassen en verzamel de wasfractie. Gradiënt-eluut met drie kolomvolumes PBS met lage tot hoge concentraties imidazole-eluut tweemaal voor elke concentratie. Om de eiwitconcentratie met de BCA-methode te bepalen, verdunt u de standaard BSA-eiwitoplossing serieel van twee tot 0,0625 milligram per milliliter, verdunt u de gezuiverde OMV-spycatcher en RBD-spiontag 10 keer.Meng vervolgens BCA-werkoplossingen A en B in een verhouding van 50 op één. Voeg verdunde eiwitoplossing toe en meng met BCA-werkoplossing. Incubeer op 37 graden gedurende 30 minuten.Meet de absorptie op 562 nanometer van elke put en bereken de eiwitconcentratie uit de standaardcurve. Om bioconjugatie van OMV spycatcher en RBD spy tag uit te voeren, mengt u OMV spycatcher en RBD spytag en PBS in een verhouding van 40 op één. Verticaal draaien om het mengsel een nacht te mengen met 15 rotaties per minuut bij vier graden Celsius.Voer zuivering van OMV RBD uit met behulp van PBS-oplossing met behulp van een procedure die vergelijkbaar is met OMV spycatcher-zuivering. Het plasmaontwerpschema laat zien dat het spycatcher-gen via flexibele linker verbonden is met het cly A-gen, terwijl de spytag verbinding maakt met de vijf priemterminal van het RBD-gen met een hys tag-gen voor zuivering en verificatie. Na ultracentrifugatie bleven bijna alle niet-gereageerde RBD-spytags in het supernatant achter.De tweede ultracentrifugatie leverde geen verder significant voordeel op ten opzichte van de eerste keer. De gemiddelde hydrodynamische diameter van OMV spycatcher was 133 nanometer terwijl het 152,6 nanometer was voor OMV-RBD. Deze verschillen kunnen zijn omdat RBD de OMV-deeltjesgrootte verhoogt na intensieve weergave.De resultaten van TEM komen overeen met de deeltjesgrootteverdeling die wordt verkregen uit de DLS-resultaten. Rotatie voor het mengen van het mengsel is erg belangrijk. De efficiëntie van de reactie kan veel lager zijn zonder rotatie.

a-plug-display-nanoparticle-vaccine-platform-based-on-outer-membrane

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Dit protocol beschrijft een algemene procedure voor het bestuderen van recombinante receptor-bindend domein (RBD)-gebaseerde subunit vaccins tegen SARS. Het bevat methoden voor transfectie en expressie van de RBD eiwit in 293T-cellen, immunisatie van muizen met RBD en detectie van de neutralisatie activiteit van muis-sera met behulp van een gevestigde SARS pseudovirus neutralisatie assay.

Protocol voor Recombinant RBD-based SARS Vaccins: Eiwit Voorbereiding, vaccinatie van dieren en het onschadelijk maken Detectie

This video demonstrates a method to generate multivalent-displaying outer membrane vesicle (OMV) vaccines. Mammalian cells are transfected to express and secrete viral antigens fused to a SpyTag and a polyhistidine tag. These antigens are then purified using a nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) affinity column. The purified antigen is mixed with outer membrane vesicles expressing surface-bound SpyCatcher (SC) protein. Multiple antigens covalently attach to SpyCatchers via their SpyTags (ST),...

Generating a Multivalent-Displaying Outer Membrane Vesicle Vaccine

We hebben de Eiwitmantel proteïne van hepatitis E virus ontworpen als een theranostic nanoparticle (HEVNP). HEVNP assembleert zelf in een stabiele icosahedrale kooi in mucosale levering. Hier beschrijven we de wijziging van de HEVNPs voor tumor gericht op door muteert residuen oppervlak-blootgesteld aan cysteines, die conjugaat van synthetische liganden die specifiek tumorcellen binden.

Oppervlakte Functionalization van Hepatitis E Virus nanodeeltjes met behulp van methoden voor chemische Woordherkomst en-opbouw

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van pseudotyped deeltjes in een BSL-2 omgeving waarin de proteïne van de piek van de hoogpathogene virussen Midden-Oosten respiratoir syndroom en het ernstig acuut respiratoir syndroom coronaviruses. Deze pseudotyped deeltjes bevatten een luciferase verslaggever gen waardoor kwantificering van virus host doelcellen indienststelling.

Productie van Pseudotyped deeltjes te bestuderen van hoogpathogene Coronaviruses in een omgeving van bioveiligheid niveau 2

Hier wordt een gedetailleerde methode beschreven die de zuivering, refolding en karakterisering van zelf-assembleren eiwit nanodeeltjes (Sapn's) beschrijft voor gebruik bij de ontwikkeling van vaccins.

Productie van E. coli-uitgedrukt zelf-assembleren eiwit nanodeeltjes voor vaccins die een Trimere epitope presentatie vereisen

Hier presenteren we een protocol om neutralisatie-epitopen te detecteren op antigeen-displaying virusachtige deeltjes (VLP's). Immunoprecipitatie van het van het humaan immunodeficiëntievirus (HIV) afgeleide VLP's wordt uitgevoerd met behulp van envelop glycoproteïnen-specifieke monoklonale antilichamen gekoppeld aan eiwit G-geconjugeerde magnetische kralen. Gevangen VLP's worden vervolgens onderworpen aan SDS-PAGE en Western blot-analyse met behulp van virale kerneiwit Gag-specifieke...

Detectie van neutralisatiegevoelige epitopen in antigenen die worden weergegeven op op virusachtige deeltjes (VLP) gebaseerde vaccins met behulp van een capture-assay

In dit protocol stellen quantum dots geconjugeerd aan recombinant SARS-CoV-2 spike celgebaseerde assays in staat om spikebinding aan hACE2 aan het plasmamembraan en daaropvolgende endocytose van de gebonden eiwitten in het cytoplasma te controleren.

Confocale beeldvorming met hoge doorvoer van Quantum Dot-geconjugeerde SARS-CoV-2 Spike Trimers om binding en endocytose in HEK293T-cellen te volgen

Het huidige protocol beschrijft nieuwe hulpmiddelen voor SPR-bindingstests om CV-N-binding aan HA, S-glycoproteïne, gerelateerde hybride-type glycanen en oligosacchariden met een hoog mannosegehalte te onderzoeken. SPR wordt gebruikt om de KD te bepalen voor het binden van dimerische of monomere CV-N aan deze glycanen.

Engineering antivirale middelen via Surface Plasmon Resonance

Hier beschrijven we een nieuw ontwikkelde multiplex fluorescerende immunoassay die gebruikmaakt van een dual-reporter flowcytometrisch systeem om tegelijkertijd twee unieke spike-eiwitepitopen te detecteren op intacte virale deeltjes van het severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) die waren opgevangen door angiotensine-converterend enzym-2-gekoppelde magnetische microsferen.

Profilering van oppervlakte-eiwitepitopen op virale deeltjes door multiplex dual-reporter-strategie

We presenteren een geoptimaliseerd in vitro protocol voor het produceren van SARS-CoV-2-virusachtige deeltjes die het authentieke virus nauwkeurig nabootsen. Deze aanpak maakt het mogelijk om virale infectie-, assemblage- en uitgangsmechanismen te onderzoeken zonder de beperkingen van het vereisen van een laboratorium van bioveiligheidsniveau 3.

Productie van een SARS-CoV-2-virusachtig deeltjessysteem om virale levenscycli in vitro te onderzoeken

Dit artikel beschrijft de methodologie voor het genereren van SARS-CoV-2 pseudotype-deeltjes met behulp van een luciferase-reportersysteem en het gebruik ervan om intreeremmers te identificeren. Deze protocollen worden aangetoond met behulp van twee verschillende entry-inhibitors: een recombinant humaan ACE2-Fc fusie-eiwit en de kleinmolecuulverbinding arbidool.

Procedures voor de identificatie van SARS-CoV-2 ingangsremmers als potentiële antivirale middelen met MLV-gebaseerde pseudovirussen

Ontdek de bio-engineering van buitenmembraanblaasjes als "Plug-and-Display" vaccinplatform. Deze methode toont antigeenpresentatie met SARS-CoV-2 RBD voor verbeterde immuunrespons in vaccinontwikkeling.

Een "Plug-And-Display" nanodeeltjesvaccinplatform op basis van buitenmembraanblaasjes met SARS-CoV-2-receptorbindend domein

Meer video's verkennen