Name: Kwantitatieve bepaling van de novo vetzuursynthese in bruin vetweefsel met behulp van deuteriumoxide (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Leer een kwantitatieve methode voor het meten van de novo vetzuursynthese in bruin vetweefsel met behulp van deuteriumoxide en GCMS-analyse. Deze niet-invasieve techniek biedt inzicht in metabole processen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken de lableden van Sanchez-Gurmaches en Wallace voor waardevolle discussies. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de American Heart Association (18CDA34080527 aan JSG en 19POST34380545 aan RM), de NIH (R21OD031907 aan JSG), een CCHMC Trustee Award, een CCHMC Center for Pediatric Genomics Award en een CCHMC Center for Mendelian Genomics & Therapeutics Award. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door NIH P30 DK078392 van het Digestive Diseases Research Core Center in Cincinnati. De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health. RT en MW werden ondersteund door een UCD Ad Astra Fellowship.

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het begrijpen van de balans en interactie tussen complexe metabole routes is een onmisbare stap in de richting van het begrijpen van de biologische basis van metabole gerelateerde ziekten. Hier tonen we een niet-invasieve en goedkope methodologie om veranderingen in de novo vetzuursynthese te bepalen. Deze methode is gebaseerd op eerder gepubliceerde methoden die berekeningen ontwikkelden voor het schatten van de novo syntheseflux uit vetzuurdeuteriumverrijking31 en voor het gebr...

Obesitas en bijbehorende stofwisselingsziekten zijn een pandemie die huidige en toekomstige generaties in gevaar brengt 1,2. Algemeen vereenvoudigd als gevolg van de onbalans tussen energie-inname en -verbruik, beïnvloedt de metabole ontregeling die gepaard gaat met obesitas een groot aantal metabole routes die worden gecontroleerd door omgevings- en endogenefactoren3. Er zijn echter maar een paar routes die routinematig worden getest in diermodellen van metabole ontregeling.
De verwijdering van glucose wordt bijvoorbeeld routinematig gemeten door middel van glucose- en insulinetolerantietests, waarschijnlijk vanwege de eenvoud van het gebruik van draagbare glucosemeters4. De relatieve snelheid van glucose en lipide-oxidatie in het hele lichaam wordt ook routinematig geschat op basis van de respiratoire uitwisselingsratio van indirecte calorimetrietests 5,6. De meeste andere aspecten van het metabolisme worden echter niet routinematig functioneel beoordeeld. Dit leidt tot onvolledige interpretaties van de metabole status en gemiste therapeutische opties. Een van de belangrijkste dergelijke routes is de novo lipogenese.
De novo lipogenese (DNL) is het proces waarbij nieuwe vetzuren worden gegenereerd uit voorlopers. Glucose wordt beschouwd als de belangrijkste precursor die bijdraagt aan DNL7 voor het hele lichaam, maar van andere precursoren, zoals acetaat, fructose, lactaat en aminozuren met vertakte ketens, is aangetoond dat ze relevante koolstofbronnen zijn op een ruimtelijke en conditieafhankelijke manier 8,9,10,11,12. DNL levert een belangrijke bijdrage aan de metabole homeostase en is essentieel voor een normale ontwikkeling13. Bovendien zijn veranderingen in DNL in verband gebracht met kanker 14,15 en metabole 16,17,18 en hart- en vaatziekten 19,20.
De DNL-route bestaat uit de belangrijkste enzymatische componenten ATP-citraatlyase (ACLY), acetyl-CoA-carboxylase (ACC1/2) en vetzuursynthase (FAS) die voornamelijk palmitaat produceren, een verzadigd vetzuur met 16 koolstofatomen. Oneven ketens en vetzuren met vertakte ketens kunnen echter ook met lagere snelheden wordengeproduceerd9. Elongases en desaturasen modificeren deze vetzuren verder, waardoor een breed scala aan vetzuren ontstaat die nuttig zijn voor een verscheidenheid aan functies (bijv. energieopslag op lange termijn en manipulatie van de membraanvloeibaarheid).
De expressie van de DNL-enzymatische machinerie wordt gecontroleerd door een klein aantal transcriptiefactoren. De meest beschreven tot nu toe zijn de familie van sterolregulerende elementbindende eiwitten (SREBP), koolhydraatresponselementbindende eiwitten (ChREBP) en lever-X-receptoren (LXR)21,22,23,24,25,26. Ondanks een schijnbare overlapping in hun functies, zijn individuele regulaties op basis van celtypedominantie en fysiologische of pathologische aandoeningen gerapporteerd21,22,27,28.
Opmerkelijk is dat een aantal remmers voor geselecteerde stappen van de DNL-route zijn goedgekeurd voor klinisch gebruik of zich in de preklinische of klinische ontwikkelingsstadia bevinden voor een aantal ziekten, waaronder obesitas, niet-alcoholische leververvetting/niet-alcoholische steatohepatitis (NAFLD/NASH) en hart- envaatziekten. Deze inspanningen onderstrepen de relevantie van DNL voor gezondheid en ziekte.
In de afgelopen jaren is het gebruik van methoden om de novo vetzuursynthese kwantitatief te beoordelen toegenomen30. De meest gebruikelijke methode om dit te beoordelen is het gebruik van zwaar gelabeld water (D2O), waarbij de zwaar gelabelde waterstof tijdens de synthese zowel direct als indirect wordt opgenomen in acylketens, via deuteriumuitwisseling met de waterstofatomen van de DNL-substraten NAPDH, acetyl-CoA en malonyl-CoA. Hoewel deze aanpak aan populariteit wint, is er een gebrek aan openbaar beschikbare gedetailleerde protocollen die geschikt zijn voor nieuwkomers in het veld. Hier schetsen we een methode voor het kwantitatief beoordelen van de de novo synthese van FAS-producten met behulp van D2O en gaschromatografie massaspectrometrie (GCMS), met berekeningen die eerder zijn ontwikkeld door Lee et al.31. Deze methode meet de novo vetzuursynthese onafhankelijk van een koolstofbron, en is potentieel bruikbaar voor vrijwel elk weefsel, in elk muismodel en onder elke externe verstoring. Hier richten we ons op de analyse van bruin vetweefsel (BAT) vanwege de hoge niveaus van DNL en de cruciale rol bij het handhaven van metabole homeostase.

<table><tbody><tr><td>4 mL glazen injectieflacons</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-334</td><td></td></tr><tr><td>0,2 µm filter</td><td>Olympus Plastic</td><td>25-244</td><td></td></tr><tr><td>26G naaldsyringes</td><td>BD</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Merck</td><td>34850</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Merck</td><td>900667</td><td></td></tr><tr><td>Blauwe GC-schroefdop met septum</td><td>Agilent</td><td>5190-1599</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>366927</td><td></td></tr><tr><td>Deuteriumoxide</td><td>Sigma</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>Di-tert-butyl-4-methylfenol (BHT) Select FAME-kolom</td><td>Merck</td><td>B1378</td><td></td></tr><tr><td>Di-tert-butyl-4-methylfenol (BHT) Select FAME-kolom</td><td>Agilent</td><td>CP7419</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-buis</td><td>Sarstedt</td><td>411395105</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>51976</td><td></td></tr><tr><td>Hexadecenoic-d31-zuur</td><td>Larodan</td><td>71-1631</td><td></td></tr><tr><td>Hexaan</td><td>Merck</td><td>34859</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Merck</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugebuis</td><td>Olympus Plastic</td><td>24-282</td><td></td></tr><tr><td>Omgevingskamer voor muizen</td><td>Caron</td><td>Caron 7001-33</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat</td><td>MP Biomedicals</td><td>194727</td><td></td></tr><tr><td>SafeLock microcentrifugebuizen</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>GC-fles met schroefdop van barnsteen</td><td>Agilent</td><td>5182-0716</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Merck</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfosfaat, dibasisch</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumsulfaat</td><td>Merck</td><td>239313</td><td></td></tr><tr><td>Zwavelzuur</td><td>Merck</td><td>258105</td><td></td></tr><tr><td>Flesinzet</td><td>Agilent</td><td>5183-2088</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantitatieve bepaling van de novo vetzuursynthese in bruin vetweefsel met behulp van deuteriumoxide

Quantitative Determination of De Novo Fatty Acid Synthesis in Brown Adipose Tissue Using Deuterium Oxide

Vetzuursynthese is een complexe en zeer energieverslindende metabole route met een belangrijke functionele rol bij de controle van de metabole homeostase van het hele lichaam en andere fysiologische en pathologische processen. In tegenstelling tot andere belangrijke metabole routes, zoals glucoseverwijdering, wordt de vetzuursynthese niet routinematig functioneel beoordeeld, wat leidt tot onvolledige interpretaties van de metabole status. Bovendien is er een gebrek aan openbaar beschikbare gedetailleerde protocollen die geschikt zijn voor nieuwkomers in het veld. Hier beschrijven we een goedkope kwantitatieve methode die gebruik maakt van deuteriumoxide en gaschromatografie massaspectrometrie (GCMS) voor de analyse van de novo synthese van totale vetzuren in bruin vetweefsel in vivo. Deze methode meet de synthese van de producten van vetzuursynthase onafhankelijk van een koolstofbron, en is potentieel nuttig voor vrijwel elk weefsel, in elk muismodel en onder elke externe verstoring. Details over de monstervoorbereiding voor GCMS en stroomafwaartse berekeningen worden verstrekt. We richten ons op de analyse van bruin vet vanwege de hoge niveaus van de novo vetzuursynthese en de cruciale rol bij het handhaven van metabole homeostase.

Op basis van de D 2 O-dosering beschreven in stap 1, vinden we doorgaans dat lichaamswater wordt verrijkt in het bereik van2,5% tot 6%, en dat een basisniveau van deuteriumverrijking in lichaamswater snel wordt bereikt in 1 uur en gedurende de duur van het onderzoek wordt gehandhaafd via 8% verrijkt drinkwater (Figuur 1). Continue steady-state lichaamswaterverrijking is een aanname van de berekeningen die in stap 6 zijn gebruikt, en daarom raden we aan om de kinetiek van ...

Hier presenteren we een goedkope kwantitatieve methode die gebruik maakt van deuteriumoxide en gaschromatografie massaspectrometrie (GCMS) voor de analyse van totaal vetzuur de novo lipogenese in bruin vetweefsel in vivo.

Kwantitatieve bepaling van de novo vetzuursynthese in bruin vetweefsel met behulp van deuteriumoxide

Fatty acid synthesis is a complex and highly energy demanding metabolic pathway with important functional roles in the control of whole-body metabolic ...

In tegenstelling tot andere metabole routes zoals glucoseverwijdering, wordt de vetzuursynthese niet routinematig beoordeeld, wat leidt tot onvolledige interpretaties van de metabole status. De belangrijkste voordelen van deze methode zijn dat het relatief niet-invasief is en waarschijnlijk een betere weerspiegeling is van de vetzuursyntheseflux dan het gebruik van isotoop-gelabelde glucose, waarbij veranderingen in de stroomopwaartse glucoseverwerking de resultaten kunnen beïnvloeden. Hier richten we ons op bruin vetweefsel, maar deze methode is potentieel nuttig om elk weefsel in elk muismodel te bestuderen.Plaats om te beginnen de monsters op droogijs. Neem een vooraf geëtiketteerd microcentrifugebuisje, plaats het op een analytische balans en tarreer de balans. Plaats vervolgens een pincet en een scalpel of stalen scheermesje 10 tot 20 seconden op droogijs om af te koelen.Gebruik het pincet om het bevroren weefselmonster uit de buis te halen en plaats het op een plastic gewichtsboot, die op een plat blok droogijs of een ander voorgekoeld oppervlak kan worden geplaatst. Gebruik het scalpel of het stalen scheermesje om een klein deel van het weefsel te ontleden dat overeenkomt met een gewicht van 5 tot 15 milligram en plaats het in de microcentrifugebuis. Noteer het exacte gewicht en herhaal dit voor elk monster.Voeg één microliter per milligram 10 millimolair hexadecaanzuur D31 toe, gevolgd door drie roestvrijstalen korrels van vijf millimeter aan elk monster. Voeg vervolgens 250 microliter methanol, 250 microliter water en 500 microliter chloroform toe aan elk monster met kralen. Plaats de buisjes in een voorgekoeld blok van een maalmolen en meng de monsters gedurende vijf minuten met een trillingsfrequentie van 25 hertz.Verwijder de korrels met behulp van een magneet en centrifugeer de monsters bij 12.000 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Neem met behulp van een micropipet een vast volume van de onderste fase van elk monster in overeenkomstig gelabelde microcentrifugebuisjes. Voeg 500 microliter chloroform toe aan het resterende monster en herhaal deze stappen.Plaats de buizen met de gecombineerde onderste fase onder stikstofgas of in een chloroform-bestendig gekoeld centrifugaalvacuüm bij vier graden Celsius totdat ze volledig droog zijn. Pipetteer 98 milliliter watervrije methanol in een glazen mediafles. En voeg langzaam twee milliliter watervrij zwavelzuur toe in de zuurkast om 2% zwavelzuur in methanol te maken.Meng door de gesloten fles rond te draaien. Voeg 500 microliter van dit 2% zwavelzuur in methanoloplossing toe aan elk monster en draai kort. Incubeer de monsters op het warmteblok bij 50 graden Celsius gedurende twee uur en voeg 100 microliter verzadigde natriumchloride-oplossing en 500 microliter hexaan toe aan elk monster.Draai de monsters krachtig bij kamertemperatuur gedurende een minuut en laat de monsters een minuut staan. Hierna zouden de twee fasen duidelijk moeten zijn. Vang de bovenste fase op in een verse microcentrifugebuis.Herhaal vervolgens de toevoeging van hexaan. En verzamel na fasescheiding de monsters van de tweede bovenste fase in dezelfde gelabelde buizen. Droog de monsters bij kamertemperatuur onder stikstofgas en resuspendeer de monsters in 20 microliter hexaan per milligram oorspronkelijk weefselgewicht.Breng de monsters onmiddellijk over in een glazen gaschromatografieflacon met een glazen inzetstuk. Injecteer de monsters in een enkele viervoudige gaschromatografie-massaspectrometer om de abundantie van methylesters van vetzuren of FAME-isotopologen te bepalen. Injecteer een microliter monster in een gesplitste of splitloze inlaat bij een inlaattemperatuur van 270 graden Celsius met helium als draaggas.Combineer in gelabelde safe-lock microcentrifugebuisjes 10 microliter van elk plasmamonster of standaard vier microliter 10 molair natriumhydroxide en vier microliter 5% aceton in acetonitril. Voer dit in drievoud uit voor elk monster. Nadat u de monsters een nacht bij kamertemperatuur hebt geïncubeerd, voegt u 450 tot 550 milligram natriumsulfaat toe aan elk monster, voegt u 600 microliter chloroform toe aan elke buis in de zuurkast en draait u gedurende 15 seconden krachtig vortex.Centrifugeer de monsters gedurende twee minuten bij 300 G. Neem gelabelde glazen GCMS-injectieflacons met glazen inzetstukken en breng het drievoud en vervolgens 80 microliter aliquots van het supernatans van elk monster over naar de injectieflacons. Sluit de injectieflacons goed af voor de GCMS-analyse.Het percentage D2O-verrijking in het plasma van muizen over meerdere tijdstippen wordt hier weergegeven. Het bleek dat lichaamswater wordt verrijkt in het bereik van 2,5 tot 6%dat een basisniveau van deuteriumverrijking in lichaamswater snel in één uur wordt bereikt en gedurende de duur van het onderzoek wordt gehandhaafd. De massa-isotopologe verdeling van palmitaat in bruin vetweefsel na drie dagen D2O-toediening bij kamertemperatuur en thermoneutraliteit wordt hier weergegeven.Dit resultaat toont een hogere M1- en M2-deuteriumverrijking bij kamertemperatuur. Molaire verrijking van bruin vetweefsel en verrijking van een reeks vetzuren in plasma na drie dagen toediening van D2O bij kamertemperatuur en thermoneutraliteit worden in deze figuur weergegeven. De verrijking bij koudere temperatuur werd gevonden in een breed scala aan vetzuren in bruin vetweefsel.Met name de totale vetzuurverrijking in plasma volgt niet dezelfde trend als bruin vetweefsel, maar in plaats daarvan wordt de vetzuurverrijking verhoogd met thermoneutraliteit. Deze beelden vertegenwoordigen de totale abundantie en het de novo gesynthetiseerde palmitaat in bruin vetweefsel na drie dagen D2O-toediening. Het resultaat toont een toename van de totale palmitaatsynthese bij kamertemperatuur.Wees voorzichtig bij het uitvoeren van vetzuren op het GCMS. Zorg ervoor dat palmitaat niet overbelast is, want dat kan kunstmatig hoge isotopenverrijkingswaarden geven. Zorg er bovendien bij het analyseren van aceton op het GCMS voor dat er geen acetonpiek op de achtergrond is voordat u de monsters uitvoert, dus voer blanco's uit om aceton in het systeem te verwijderen.Deze methode kijkt naar het totale aantal vetzuren in meerdere lipidenklassen, maar als u wilt begrijpen hoe vetzuursynthese specifieke lipidenklassen beïnvloedt, kunt u deze lipidenklassen eerst scheiden met behulp van chromatografie en vervolgens vetzuren uit deze fracties extraheren. Omdat lipogenese een belangrijke bijdrage levert aan de normale ontwikkeling, maar ook aan veel ziekten, kan dit protocol op veel gebieden nuttig zijn.

quantitative-determination-de-novo-fatty-acid-synthesis-brown-adipose

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De novo lipogenese en β-vetzuuroxidatie vormen belangrijke metabole routes in hepatocyte, trajecten die zijn verstoord in verschillende metabole stoornissen, met inbegrip van vette lever ziekte. Hier laten we de isolatie van muizen primaire hepatocyten en beschrijven kwantificering van β-vetzuuroxidatie en lipogenese.

Bepaling van vetzuuroxidatie en Lipogenese in Mouse primaire hepatocyten

Het vetzuur trofische marker aanpak, dat wil zeggen, de assimilatie van vetzuren als hele molecuul en transfer in consument weefsel met geen of een kleine wijziging, wordt gehinderd door lacunes in de kennis in de vetzuurstofwisseling van kleine bodem-ongewervelde dieren. Isotopologue profilering wordt geleverd als een waardevol instrument te ontwarren trofische interacties.

Profilering van vetzuur 13C Isotopologue geeft inzicht in de trofische Carbon overdracht en lipide metabolisme van ongewervelde consumenten

Met behulp van gratis, open-source software, hebben we een analytische aanpak om te kwantificeren van totale en regionale bruin vetweefsel (BAT) volume en metabole activiteit van BBT met 18F-FDG PET/CT.

Hele lichaam en regionale kwantificering van actieve mens bruin vetweefsel met 18F-FDG PET/CT

Deze studie beschrijft een nieuwe methode voor het isoleren van muizenbruine adipocyten voor gen- en eiwitexpressieanalyse.

Het isoleren van bruine adipocyten uit murine interscapulair bruin vetweefsel voor gen- en eiwitexpressieanalyse

Functionele beeldvorming en kwantificering van thermogene vetdepots bij muizen met behulp van een micro-PET / MR-beeldvormingsgebaseerde benadering.

Visualisatie en kwantificering van bruine en beige vetweefsels bij muizen met behulp van [18F] FDG Micro-PET / MR Imaging

Hier presenteren we een protocol om de fysiologische betekenis van de impact van bruin vetweefsel (BAT) activiteit op het menselijk metabolisme te kwantificeren. Dit wordt bereikt door koolhydraatbelasting en indirecte calorimetrie te combineren met metingen van supraclaviculaire temperatuurveranderingen. Deze nieuwe aanpak kan helpen bij het ontwikkelen van een farmacologisch doelwit voor BBT-thermogenese bij mensen.

Met behulp van een combinatie van indirecte calorimetrie, infraroodthermografie en bloedglucosespiegels om de thermogenese van bruin vetweefsel bij mensen te meten

Preadipocyten worden geïsoleerd uit de stromale vasculaire fractie van interscapulier bruin vetweefsel van pasgeboren muizen en gedifferentieerd tot cellen die lipidedruppeltjes accumuleren, moleculaire markers tot expressie brengen en de mitochondriale morfologie van volwassen bruine vetcellen vertonen. Deze cellen worden verder geanalyseerd door middel van immunofluorescentie en transmissie-elektronenmicroscopie.

Differentiatie en beeldvorming van bruine vetcellen uit de stromale vasculaire fractie van interscapulier vetweefsel van pasgeboren muizen

We presenteren een protocol voor assay voor transposase-toegankelijk chromatine met high-throughput sequencing (ATAC-seq) specifiek op adipocyten met behulp van kernsortering met vetweefsels geïsoleerd uit transgene reportermuizen met nucleaire fluorescentielabeling.

Adipocyt-specifieke ATAC-Seq met vetweefsels met behulp van fluorescentie-geactiveerde kernsortering

In dit protocol worden methoden geschetst die relevant zijn voor BAT-geoptimaliseerde arterioveneuze metabolomics met behulp van GC-MS in een muismodel. Deze methoden maken het mogelijk om waardevolle inzichten te verwerven in de uitwisseling van BBT-gemedieerde metabolieten op organismaal niveau.

Arterioveneuze metabolomics om in vivo metabolietuitwisseling in bruin vetweefsel te meten

Beschrijving van een kwantitatieve fosforylering procedure met behulp van cryolysis, ureum solubilziation, HILIC fractionering en IMAC verrijking van gefosforyleerde peptiden.

Kwantitatieve Phosphoproteomics in Fatty Acid Gestimuleerd Saccharomyces cerevisiae</em

Leer een kwantitatieve methode voor het meten van de novo vetzuursynthese in bruin vetweefsel met behulp van deuteriumoxide en GCMS-analyse. Deze niet-invasieve techniek biedt inzicht in metabole processen.

Kwantitatieve bepaling van de novo vetzuursynthese in bruin vetweefsel met behulp van deuteriumoxide

Meer video's verkennen