Meting van de samendrukbaarheid van cel en kern op basis van Acoustofluidic Microdevice

Celmechanica speelt een belangrijke rol bij tumormetastase, kwaadaardige transformatie van cellen en radiosensitiviteit. Acoustofluidische methode kan snelle en niet-destructieve metingen realiseren in zwevende toestanden. Deze techniek kan worden gebruikt voor het spiegelen van de verandering van zelfdrukbaarheid tijdens epitheliale naar mesenchymale overgang en het scheiden van circulerende tumorcellen, wat de toepassingsvooruitzichten in kankerdiagnostiek laat zien.

Bind om te beginnen het PDMS-blok aan de chip door gaten in het PDMS-blok te ponsen voor inlaat- en uitlaatpoorten met een holle naald met een diameter van één millimeter. Plaats vervolgens de PDMS-blokken en chip met de achterkant omhoog gedurende één minuut in een plasmareiniger. Nadat u de gaten op de PDMS-blokken hebt uitgelijnd met de chipinlaat en -uitlaat, drukt u de PDMS-blokken gedurende 15 seconden voorzichtig op de chip, wat resulteert in binding tussen de PDMS-blokken en het oppervlak van de chip.

Om de PTFE-katheter op de chip aan te sluiten, snijdt u twee stukken katheter met een binnendiameter van 0,8 millimeter en een lengte van 10 centimeter. Buig een roestvrijstalen naald met een binnendiameter van 0,7 millimeter en een lengte van 1,5 centimeter bij 90 graden in een L-vorm en verbind deze met het ene uiteinde van de katheter. Steek de roestvrijstalen naalden in de gaten van de PDMS-blokken.

Sluit voor de inlaat een doseernaald van 19 gauge aan op het andere uiteinde van de katheter als connector voor een spuit. Injecteer daarna gedeïoniseerd water om de dichtheid van het totale kanaal te testen. Voor een piëzo-elektrische keramische assemblage selecteert u voorgesneden piëzo-elektrische keramische platen met een breedte van vijf millimeter.

Las vervolgens draden aan beide zijden van het piëzo-elektrische keramiek aan het ene uiteinde. Lijm het piëzo-elektrische keramiek op het midden van de achterkant van de chip door een druppel cyanoacrylaatlijm op het piëzo-elektrische keramiek te plaatsen. Strijk de lijm glad met de tandenstoker en verwijder de overtollige lijm.

Druk het vervolgens snel op de chip en blijf ongeveer een minuut drukken. Om het micro-apparaat te monteren, snijdt u een stuk PDMS als basis van het microapparaat en plakt u één kant van de basis op de PDMS-blokken in- en uitlaatt u de andere kant op een transparante glasplaat met dubbelzijdige tape. Bevestig het hele microdevice aan de microscoopfase om de chip in één brandpuntsvlak te houden.

Om de polystyreen standaard deeltjesoplossingen te bereiden, voegt u 0,05 milliliter polystyreendeeltjesoplossing toe aan 10 milliliter PBS en mengt u goed. Bereid vervolgens de celsuspensies voor door de aanhangende cellen te wassen op 90% samenvloeiing met PBS. Voeg 500 microliter 0,25 Trypsin toe gedurende één tot twee minuten bij kamertemperatuur.

Voeg na het verwijderen van de Trypsin één milliliter compleet medium toe en vorm een celsuspensie door te pipetteren. Centrifugeer vervolgens de celsuspensie bij 100 G gedurende vijf minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer in 0,5 tot één milliliter PBS om een celsuspensie te verkrijgen.

Vervolgens werden cellen geteld met een hemocytometer en de concentratie was ongeveer 300 tot 500.000 cellen per milliliter. Na het voorbereiden van de celkernsuspensie zoals eerder gedemonstreerd, verwijdert u het supernatant en voegt u 200 microliter cytoplasmatisch eiwitextractiereagens A per 20 microliter celpalet toe en mengt u goed. Vortex vervolgens het bovenstaande mengsel op 220 G gedurende vijf seconden en plaats het gedurende 10 minuten op het ijsbad.

Voeg vervolgens 10 microliter cytoplasmatisch eiwitextractiereagenS B toe aan de oplossing na incubatie. Na vortexing, plaats op ijsbad gedurende één minuut en vortex opnieuw op 220 G gedurende vijf seconden. Centrifugeer vervolgens op 1000 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.

Verwijder het supernatant en resuspenseer het palet in één milliliter PBS. Centrifugeer vervolgens vier minuten bij 1000 G bij vier graden Celsius. Na het verwijderen van het supernatant, resuspensie in 100 microliter PBS als celkernsuspensie.

Voeg trypan blue toe aan de bovenstaande celkernsuspensie en bevlek gedurende vier minuten bij kamertemperatuur. Tel vervolgens het aantal kernen onder de omgekeerde microscoop met een 10x objectief. Verdun de bovenstaande celkernsuspensie met PBS-buffer tot een concentratie van 200 tot 300.000 kern per milliliter.

Filter vervolgens de celkernsuspensie door een zeef van 70 micrometer. Om het meetsysteem in te stellen, schakelt u de lichtbron van de microscoop in en opent u de camerasoftware. Gebruik het 4x-objectief om de middelste positie van het microkanaal te vinden, dat wil zeggen de positie van het piëzo-elektrische keramiek.

Na het aansluiten van de draden, last u ze aan de positieve en negatieve aansluitingen van de signaalgeneratoruitgang van respectievelijk het piëzo-elektrische keramiek. Plaats de spuit vervolgens op de micro-injectiepomp en sluit deze aan op de inlaatkatheter. Om de vloeistof uit het microkanaal te verzamelen, plaatst u een kleine container aan het einde van de uitlaatkatheter.

Om de meetparameters te bepalen, aspirateert u de oplossing van het polystyreendeeltje met de spuit. Injecteer vervolgens de oplossing in het chipmicrokanaal terwijl luchtbellen en in chipmicrokanaal worden vermeden om een nauwkeurige meting te garanderen. Stel de uitgang van de signaalgenerator in op een tekensignaal met een frequentie van één megahertz en piek-tot-piekspanning van 10 volt totdat wordt waargenomen dat de deeltjes naar de middellijn van het microkanaal bewegen en in voorwaartse beweging blijven langs de middellijn na het bereiken van de middellijn.

Na het mengen van een milliliter cel of nucleus suspensie met de standaard deeltjesoplossing in de verhouding van één op één, injecteert u deze in het microkanaal met een spuit om cellen en kernen te meten. Begin met opnemen met ccd-camera wanneer de cellen of kernen het gezichtsveld betreden en schakel de signaalgenerator in. Spoel vervolgens het microkanaal af met gedeïoniseerd water, 75% alcohol en gedeïoniseerd water in volgorde voor later gebruik.

De beweging van de cellen en deeltjes werd waargenomen onder invloed van de akoestische veldkracht naar de middellijn van het microkanaal met verschillende tijdsintervallen. De berekening van energie, dichtheid en celdrukbaarheid werden uitgevoerd en akoestische energiedichtheid en het gemeten bewegingstraject voor het deeltje werd verkregen uit het best passende resultaat. De hoge zuiverheid en intacte kernen werden geïsoleerd uit cellen en kerndrukbaarheidsmeting werd bereikt door het bewegingstraject van de kern te verkrijgen.

De samendrukbaarheid van verschillende soorten kankercellen en cellen na geneesmiddel-geïnduceerde EMT of röntgenbestraling met verschillende doses werd gemeten en vergeleken. De gemeten cellen werden verzameld en er werd gevonden dat er geen significant verschil was in celproliferatie en levensvatbaarheid in vergelijking met de onbehandelde groep na 48 uur cultuur. Dit geeft aan dat de samendrukbaarheidsmeting geen effect heeft op de celproliferatie en overleving.

Het belangrijkste is om de frequentie van het signaal te verfijnen totdat wordt waargenomen dat deeltjes naar de middellijn van het microkanaal bewegen.