Reconstitueren en karakteriseren van Actin-Microtubule Composieten met instelbare motoraangedreven dynamica en mechanica

Ons werk brengt cytoskeletreconstitutie-inspanningen een belangrijke stap dichter bij het nabootsen van cellulaire omstandigheden door composieten van actine en microtubuli te ontwikkelen, aangedreven door kinesine- en myosinemotoren om actief af te stemmen, te herstructureren en te bewegen. De dynamiek en structuur van onze composieten kunnen nauwkeurig worden geprogrammeerd door de verschillende componenten onafhankelijk toe te voegen, te verwijderen en af te stemmen om een rijke fasebasis van contractie, infectie, demising, verruwing en breuk te vertonen. Onze aanpak is breed toepasbaar op het ontwerpen, creëren en karakteriseren van actieve materieplatforms die meerdere krachtgenererende componenten bevatten die op verschillende substraten in één systeem werken.

De procedure wordt gedemonstreerd door Daisy Achiriloaie en Maya Hendija. Niet-gegradueerde onderzoekers van ons laboratorium. Voeg om te beginnen de reagentia toe aan een steriele zwarte microcentrifugebuis van 1,5 milliliter met behulp van een micropipet en steriele pipetpunten om Kinesine-motorclusters te vormen die binden en krachten uitoefenen tussen paren microtubuli.

Meng voorzichtig door de oplossing op en neer te pipetteren. Incubeer vervolgens de oplossing gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius, bescherm deze tegen licht. Om een verstrengeld composietnetwerk van actonfilamenten en microtubuli voor te bereiden, stelt u het warmteblok in op 37 graden Celsius.

Voeg de reagentia toe aan een steriele microcentrifugebuis van 0,6 milliliter. Zorg ervoor dat het totale volume 25 microliter is. Pipetteer de oplossing voorzichtig op en neer om deze te mengen en plaats deze op het hitteblok van 37 graden Celsius dat gedurende een uur tegen licht is beschermd.

Verwijder daarna de buis uit het warmteblok en gebruik een micropipet om voorzichtig 0,84 microliter 100 micromolair Phalloidine te mengen. Incubeer gedurende vijf tot 10 minuten bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. Om actieve composieten voor te bereiden voor conf focale beeldvorming, voegt u de reagentia toe aan de oplossing en mengt u voorzichtig door op en neer te pipetteren.

Verdeel de oplossing in drie aliquots van 10 microliter en label ze als K, K plus M en negatieve controle. Voeg 2,54 microliter myosine toe aan de K plus M aliquot en 2,54 microliter PEM aan K en negatieve controle aliquots. Voeg vervolgens 2,5 microliter Kinesineclusters toe aan K en K plus M aliquots en pipetteer op en neer om te mengen.

Voeg vervolgens 2,5 microliter PEM toe aan de negatieve controle met dezelfde techniek. Gebruik een micropipette om elke oplossing langzaam via capillaire werking in het overeenkomstige kanaal van de monsterkamers te laten stromen. Druk heel langzaam en voorzichtig op de pipet om geen luchtbellen in het kanaal te brengen.

Sluit de twee open uiteinden van elk kanaal af met sneldrogende epoxy of UV-uithardende lijm. Wanneer de lijm volledig droog is, plaatst u het kanaal op de microscoop om het composiet zo dicht mogelijk bij de initiële inactieve toestand in beeld te brengen. Stel eerst het K-kanaal en K plus M-kanalen voor, gevolgd door het besturingskanaal.

Let op de tijd die is verstreken tussen de toevoeging van de Kinesineclusters aan K en K plus M aliquots en het begin van data-acquisitie. Om actine te bereiden voor actine of AA crosslinkers, voeg Biotine-Actine, NeutrAvidin, Biotine en PEM toe aan een microcentrifugebuis en meng ze voorzichtig door op en neer te pipetteren. Evenzo, voor microtubuli aan microtubuli of MM-crosslinkers, voeg Biotine-tubuline, NeutrAvidin, Biotine en PEM toe aan een microcentrifugebuis en meng ze voorzichtig door op en neer te pipetteren.

Wikkel de buis in een thermoplastische plafondfolie om een waterdichte afdichting te creëren en plaats ze in een drijfvlot in een temperatuurgeregeld sonicaterbad, ingesteld op vier graden Celsius gedurende 90 minuten. Om A-A crosslinkercomplexen in monsters op te nemen voor beeldvorming, voegt u de reagentia toe aan een microcentrifugebuis. Zorg ervoor dat het totale volume 25 microliter is.

Evenzo, voor M-M crosslinker complexen, voeg de reagentia op het scherm toe aan een microcentrifuge buis. Meng de oplossing door op en neer te pipetteren en plaats deze een uur lang op het hitteblok van 37 graden Celsius dat tegen licht is beschermd. Verwijder daarna de buis uit het warmteblok en gebruik een micropipet om 0,84 microliter 100 micromolair Phalloidine in te mengen.

Incubeer gedurende vijf tot 10 minuten bij kamertemperatuur beschermd tegen licht en herhaal de eerder getoonde procedure om actieve composieten te bereiden voor confocale beeldvorming. Actine monovezels en tubuline dimeren worden gecopolymeriseerd om verstrengelde netwerken van actinefilamenten en microtubuli te vormen. Myosine twee minifilamenten en Kinesineclusters duwen en trekken aan de filamenten om de composieten uit steady state te verdrijven.

Passieve cross-linking wordt bereikt met behulp van NeutrAvidin om een gebiotinyleerde actinefilamenten of microtubuli te koppelen. Myosine twee minifilamenten, Kinesineclusters, of beide motoren zijn opgenomen in composieten zonder passieve crosslinks, actine-actine crosslinks en microtubule-microtubule crosslinks. Twee kleuren confocale beeldvorming van myosine gedreven cytoskeletcomposieten met variërende myosineconcentraties en molaire actinefracties wordt hier getoond.

Deeltjesbeeld velocimetrie toont aan dat actine myosine activiteit gecoördineerde contractiele dynamiek van actine en microtubuli in verstrengelde composieten veroorzaakt. Hier komen verschillende pijlkleuren overeen met verschillende snelheden zoals aangegeven in de kleurenschaal rechts van de vectorvelden. Tijd opgelost differentiële dynamische microscopie wordt uitgevoerd op microtubule en actine kanalen van tijdreeksen om kenmerken van vervaltijden versus golfgetal voor zowel actine als microtubules te bepalen.

Contractiesnelheden worden bepaald via fits-to-decay-tijdcurven, gemiddeld over alle vertragingstijden voor de gehele duur van elke tijdreeks van 45 minuten. Time resolved differential dynamic microscopy kwantificeert hoe de dynamiek in de loop van de tijd varieert door vervaltijden te evalueren gedurende opeenvolgende intervallen van zes minuten tijdens de activeringstijd van 45 minuten voor actine en microtubuli. Tijd opgeloste contractiesnelheden voor actinefilamenten en microtubuli worden bepaald uit aanvallen op overeenkomstige vervaltijdcurven.

Ruimtelijke beeldautocorrelatieanalyse kwantificeert de motorgestuurde herstructurering van actieve cytoskeletcomponenten door autocorrelatiecurven voor de verschillende netwerken aan het begin van het experiment te vergelijken met het einde. Tijd opgeloste correlatielengtes bepaald via exponentiële aanvallen van autocorrelatiecurven tonen composieten die niet herstructureren in vergelijking met degenen die substantieel herstructureren. Twee kleuren confocale beelden van Kinesine gedreven actine microtubule composieten tonen formuleringsafhankelijke herstructurering in de loop van de tijd zonder crosslinkers composieten herstructureren in losjes verbonden microtubule rijke clusters.

Actine-actine cross-linking ondersteunt actine microtubule co-lokalisatie, terwijl microtubule-microtubule cross-linking verbetert D mengen. Differentiële dynamische microscopie en ruimtelijke beeldautocorrelatieanalyse tonen het effect van cross-linking en concurrerende mycine- en kinesinemotoren op de tijdsafhankelijke dynamiek en structuur van de composieten. Om cellulaire omstandigheden beter na te bootsen, kunnen onderzoekers intermediaire filamenten, andere motoren en bindende eiwitten opnemen die filamentlengtes en stijfheid regelen.

Metrologiemetingen van optische pincetten kunnen ook worden uitgevoerd om de composietmechanica te karakteriseren. Met behulp van onze aanpak kunnen onderzoekers de dynamiek en structuur van cytoskelet-geïnspireerde samengestelde actieve materie in een ongekende faseruimte nauwkeurig afstemmen om diverse cellulaire processen na te bootsen en herconfigureerbare programmeerbare materialen te engineeren.