Name: Celvrije eiwitsynthese uit exonuclease-deficiënte cellulaire extracten met behulp van lineaire DNA-sjablonen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Leer celvrije eiwitsynthese met lineaire DNA-sjablonen uit exonuclease-deficiënte E. coli-extracten. Deze methode versnelt biologisch onderzoek door klonen te vermijden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ACB en JLF erkennen financieringssteun door de ANR SINAPUV-subsidie (ANR-17-CE07-0046). JLF en JB erkennen financieringssteun door de ANR SynBioDiag-subsidie (ANR-18-CE33-0015). MSA en JLF erkennen financieringssteun door de ANR iCFree-subsidie (ANR-20-BiopNSE). JB erkent de steun van de ERC die "COMPUCELL" (subsidienummer 657579) start. Het Centre de Biochimie Structurale erkent de steun van de Franse Infrastructuur voor Geïntegreerde Structurele Biologie (FRISBI) (ANR-10-INSB-05-01). MK erkent de financiële steun van inrae's MICA-afdeling, Université Paris-Saclay, Ile-de-France (IdF) regio DIM-RFSI, en ANR DREAMY (ANR-21-CE48-003). Dit werk werd ondersteund door financiering via de European Research Council Consolidator Award (865973 aan het CLB).

<ol><li>Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+gene+expression%3A+an+expanded+repertoire+of+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (3), 151-170 (2020).</li>
<li>McSweeney, M. A., Styczynski, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+use+of+linear+DNA+in+cell-free+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Effective use of linear DNA in cell-free expression systems.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 715328(2021).</li>
<li>Schinn, S. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis+directly+from+PCR%3A+progress+and+applications+of+cell-free+protein+synthesis+with+linear+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22New+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis directly from PCR: progress and applications of cell-free protein synthesis with linear DNA.</a> New Biotechnology. 33 (4), 8(2016).</li>
<li>Prell, A., Wackernagel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+linear+and+circular+DNA+with+gaps+by+the+recBC+enzyme+of+Escherichia+coli.+Effects+of+gap+length+and+the+presence+of+cell-free+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Degradation of linear and circular DNA with gaps by the recBC enzyme of Escherichia coli. Effects of gap length and the presence of cell-free extracts.</a> European Journal of Biochemistry. 105 (1), 109-116 (1980).</li>
<li>Sitaraman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+cell-free+protein+synthesis+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A novel cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).</li>
<li>Marshall, R., Maxwell, C. S., Collins, S. P., Beisel, C. L., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+DNA+containing+%CF%87+sites+enhances+DNA+stability+and+gene+expression+in+E.+coli+cell-free+transcription-translation+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Short DNA containing χ sites enhances DNA stability and gene expression in E. coli cell-free transcription-translation systems.</a> Biotechnology and Bioengineering. 114 (9), 2137-2141 (2017).</li>
<li>Yim, S. S., Johns, N. I., Noireaux, V., Wang, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protecting+linear+DNA+templates+in+cell-free+expression+systems+from+diverse+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Protecting linear DNA templates in cell-free expression systems from diverse bacteria.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2851-2855 (2020).</li>
<li>Norouzi, M., Panfilov, S., Pardee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+protection+of+linear+DNA+in+cell-free+extracts+from+Escherichia+coli+and+Vibrio+natriegens%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">High-efficiency protection of linear DNA in cell-free extracts from Escherichia coli and Vibrio natriegens.</a> ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1615-1624 (2021).</li>
<li>Zhu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+cell-free+gene+expression+yields+from+linear+templates+in+Escherichia+coli+and+Vibrio+natriegens+extracts+by+using+DNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Increasing cell-free gene expression yields from linear templates in Escherichia coli and Vibrio natriegens extracts by using DNA-binding proteins.</a> Biotechnology and Bioengineering. 117 (12), 3849-3857 (2020).</li>
<li>Batista, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentially+optimized+cell-free+buffer+enables+robust+expression+from+unprotected+linear+DNA+in+exonuclease-deficient+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentially optimized cell-free buffer enables robust expression from unprotected linear DNA in exonuclease-deficient extracts.</a> ACS Synthetic Biology. 11 (2), 732-746 (2022).</li>
<li>Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis%3A+protocols+for+a+robust%2C+flexible%2C+and+accessible+platform+technology%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology.</a> JoVE. (144), e58882(2019).</li>
<li>Kwon, Y. -C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+preparation+methods+of+crude+extract+for+robust+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis.</a> Scientific Reports. 5 (1), 8663(2015).</li>
<li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762(2013).</li>
<li>Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+reduce+variability+in+E.+Coli-based+cell-free+protein+expression+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Synthetic+and+Systems+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Methods to reduce variability in E. Coli-based cell-free protein expression experiments.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).</li>
<li>Cole, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+interlaboratory+cell-free+protein+synthesis+variability%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).</li>
</ol>

Hier laten we zien dat cellysaat bereid uit E. coli BL21 Rosetta2 met een genomische knock-out voor recB - of recBCD-operon een hoge eiwitexpressie ondersteunt van lineaire DNA-sjablonen. Dit protocol werkt een stapsgewijze lysaatkalibratieprocedure uit die specifiek is voor lineaire DNA-sjablonen (figuur 2), wat een kritieke stap is die leidt tot de hoge expressie van σ70-promotors in lineair DNA, die bijna-plasmideniveaus bereiken voor equimolaire DNA-concentrati...

Celvrije eiwitsynthese (CFPS) -systemen worden steeds vaker gebruikt als een snelle, eenvoudige en efficiënte methode voor biosensortechnologie, gedecentraliseerde productie en prototyping van genetische circuits1. Vanwege hun grote potentieel worden CFPS-systemen regelmatig gebruikt op het gebied van synthetische biologie. Tot nu toe vertrouwen CFPS-systemen echter op circulaire plasmiden die kunnen voorkomen dat de technologie zijn volledige potentieel bereikt. Het voorbereiden van plasmide-DNA is afhankelijk van vele tijdrovende stappen tijdens het klonen en grote hoeveelheden DNA-isolatie. Aan de andere kant kan PCR-amplificatie van een plasmide, of een gesynthetiseerd DNA-sjabloon, worden gebruikt om eenvoudig CFPS-sjablonen binnen een paar uur voor te bereiden 2,3. Daarom biedt toepassing van lineair DNA een veelbelovende oplossing voor CFPS. Lineair DNA wordt echter snel afgebroken door exonucleasen die van nature aanwezig zijn in cellulaire extracten4. Er zijn oplossingen die dit probleem aanpakken, zoals het gebruik van het λ-faag GamS-eiwit5 of DNA met Chi-sites6 als beschermende middelen, of het direct beschermen van het lineaire DNA door chemische modificatie van de uiteinden 2,7,8,9. Al deze methoden vereisen suppleties aan het celextract, die kostbaar en tijdrovend zijn. Het is al lang bekend dat het exonuclease V-complex (RecBCD) lineair DNA in cellysaten afbreekt4. Onlangs toonden we aan dat lineair DNA veel beter kan worden beschermd in lysaten van cellen die zijn uitgeschakeld voor exonucleasegenen (recBCD)10.
In dit protocol worden stappen voor de bereiding van celvrije lysaten van de E. coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD-stam door ultrasoonapparaatlyse in detail beschreven. Sonicatielysis is een veel voorkomende en betaalbare techniek die door verschillende laboratoria wordt gebruikt11,12. De extracten die uit deze stam worden geproduceerd, hebben geen extra component of DNA-sjabloonmodificatie nodig om expressie van lineaire DNA-sjablonen te ondersteunen. De methode is gebaseerd op de essentiële stap van bufferoptimalisatie voor celextracten specifiek voor lineaire DNA-expressie van inheemse E. coli-promotors. Het is aangetoond dat deze specifieke bufferoptimalisatie voor lineaire DNA-expressie de sleutel is voor inheemse σ70-promotors om een hoge eiwitproductie te produceren zonder GamS-eiwit of Chi DNA-suppletie, zelfs het vermijden van zuivering van de PCR-producten10. De optimale concentratie mg-glu voor lineaire DNA-expressie bleek vergelijkbaar te zijn met die voor plasmide-DNA. De optimale concentratie van K-glu toonde echter een aanzienlijk verschil tussen lineair en plasmide-DNA, waarschijnlijk als gevolg van een transcriptiegerelateerd mechanisme10. De functionaliteit van eiwitten die met deze methode tot expressie komen, is aangetoond voor verschillende toepassingen, zoals snelle screening van grijpschakelaars en activiteitsbeoordeling van enzymvarianten10.
Dit protocol biedt een eenvoudige, efficiënte en kosteneffectieve oplossing voor het gebruik van lineaire DNA-sjablonen in E. coli-celvrije systemen door simpelweg mutante ΔrecBCD-celextracten en specifieke kalibratie voor lineair DNA als sjabloon te gebruiken.

<table><tbody><tr><td>2-YT Broth</td><td>Invitrogen</td><td>22712020</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Safe-Lock tubes</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>1.5 mL microtube</td></tr><tr><td>384-well square-bottom microplate</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>142761</td><td></td></tr><tr><td>3PGA (D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8877</td><td></td></tr><tr><td>adhesive plate seal</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>232701</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Invitrogen</td><td>30391023</td><td></td></tr><tr><td>ATP (Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta2</td><td>Merck Millipore</td><td>71402</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta2 &Delta;recB</td><td>Addgene</td><td>176582</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta2 &Delta;recBCD</td><td>Addgene</td><td>176583</td><td></td></tr><tr><td>cAMP (Adenosine 3' 5'-cyclic monophosphate)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A9501</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>CoA (Coenzyme A hydrate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4282</td><td></td></tr><tr><td>Corning 15 mL PP Centrifuge Tubes, Rack Packed with CentriStar Cap, Sterile</td><td>Corning</td><td>430790</td><td>15 mL tube</td></tr><tr><td>Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes, Conical Bottom with CentriStar Cap, Sterile</td><td>Corning</td><td>430828</td><td>50 mL tube</td></tr><tr><td>CTP (Cytidine 5'-triphosphate, disodium salt hydrate)</td><td>Alfa Aesar</td><td>&nbsp;J62238</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-Dithiothreitol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Folinic acid (solid folinic acid calcium salt)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7878</td><td></td></tr><tr><td>GTP (Guanosine 5?-Triphosphate,&nbsp; Disodium Salt)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>371701</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp;H3375</td><td></td></tr><tr><td>K phosphate dibasic (K2HPO4)</td><td>Carl Roth</td><td>231-834-5</td><td></td></tr><tr><td>K phosphate monobasic (H2KO4P)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>K-glutamate</td><td>Alfa Aesar</td><td>A17232</td><td></td></tr><tr><td>Mg-glutamate&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 &micro;m, polyethersulfone</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>membrane filter 0.22 &micro;m</td></tr><tr><td>Monarch PCR &amp; DNA Cleanup Kit</td><td>NEB</td><td>T1030S</td><td>PCR &amp; DNA cleanup Kit</td></tr><tr><td>Monarch Plasmid Miniprep Kit</td><td>NEB</td><td>T1010S</td><td>Plasmid Miniprep Kit</td></tr><tr><td>NAD (B-nicotinamide adenine dinucleotide hydrate)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>N6522</td><td></td></tr><tr><td>NIST-traceable FITC standard</td><td>Invitrogen</td><td>F36915</td><td>NIST-FITC</td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740414.1</td><td>Plasmid Maxiprep Kit</td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89510</td><td></td></tr><tr><td>plate reader</td><td>Biotek&nbsp;</td><td>Synergy HTX</td><td></td></tr><tr><td>Purified Recombinant EGFP Protein</td><td>Chromotek</td><td>egfp-250</td><td>recombinant eGFP</td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity 2X Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0492S</td><td>DNA polymerase</td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity 2X Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0492L</td><td>DNA polymerase</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td><td>Thermo</td><td>Q32850</td><td>fluorometric assay with DNA-binding dye</td></tr><tr><td>RTS Amino Acid Sampler</td><td>biotechrabbit</td><td>BR1401801</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>Sterile water</td><td></td><td></td><td>Gezuiverd water van het Millipore RiOs 8-systeem, gesteriliseerd door autoclaving.</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Life Science products Cytiva</td><td>17-1321-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Roche</td><td>10109550001</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonic processor Vibra cell VC-505</td><td>SONICS</td><td>VC505</td><td>sonicator</td></tr><tr><td>UTP Na3 (Uridine 5'- triphosphate, trisodium salt hydrate)</td><td>Acros Organics&nbsp;</td><td>226310010</td><td></td></tr><tr><td>Water, nuclease-free</td><td>Thermo</td><td>R0581</td><td>nuclease-free water</td></tr></tbody></table>

celvrije eiwitsynthese uit exonuclease-deficiënte cellulaire extracten met behulp van lineaire dna-sjablonen

Cell-Free Protein Synthesis from Exonuclease-Deficient Cellular Extracts Utilizing Linear DNA Templates

Celvrije eiwitsynthese (CFPS) is onlangs erg populair geworden op het gebied van synthetische biologie vanwege de vele voordelen. Het gebruik van lineaire DNA-sjablonen voor CFPS zal de technologie verder in staat stellen zijn volledige potentieel te bereiken, waardoor de experimentele tijd wordt verkort door de stappen van klonen, transformatie en plasmide-extractie te elimineren. Lineair DNA kan snel en gemakkelijk worden versterkt door PCR om hoge concentraties van de sjabloon te verkrijgen, waardoor potentiële in vivo expressietoxiciteit wordt vermeden. Lineaire DNA-sjablonen worden echter snel afgebroken door exonucleasen die van nature aanwezig zijn in de celextracten. Er zijn verschillende strategieën voorgesteld om dit probleem aan te pakken, zoals het toevoegen van nucleaseremmers of chemische modificatie van lineaire DNA-uiteinden voor bescherming. Al deze strategieën kosten extra tijd en middelen en moeten nog bijna-plasmide niveaus van eiwitexpressie verkrijgen. Een gedetailleerd protocol voor een alternatieve strategie wordt hier gepresenteerd voor het gebruik van lineaire DNA-sjablonen voor CFPS. Door celextracten uit exonuclease-deficiënte knock-outcellen te gebruiken, blijven lineaire DNA-sjablonen intact zonder dat er eindaanpassingen nodig zijn. We presenteren de bereidingsstappen van cellysaat uit Escherichia coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD-stam door ultrasoonapparaatlyse en bufferkalibratie voor Mg-glutamaat (Mg-glu) en K-glutamaat (K-glu) specifiek voor lineair DNA. Deze methode is in staat om eiwitexpressieniveaus te bereiken die vergelijkbaar zijn met die van plasmide-DNA in E. coli CFPS.

Representatieve resultaten worden hier getoond na kalibratie van het lysaat voor optimale Mg-glutamaat- en K-glutamaatspiegels afzonderlijk voor lineair en plasmide-DNA (figuur 1). De mg-glutamaat optimale concentratie is vergelijkbaar voor ΔrecB en ΔrecBCD extracten bij 8 mM (figuur 1B). De optimale K-glutamaatconcentratie voor plasmide-DNA is echter 140 mM, terwijl de optimale K-glutamaatconcentratie voor lineair DNA voor hetzelfde extract 20...

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de bereiding en bufferkalibratie van celextracten uit exonuclease V knock-out stammen van Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD en ΔrecB). Dit is een snelle, eenvoudige en directe benadering voor expressie in celvrije eiwitsynthesesystemen met behulp van lineaire DNA-sjablonen.

Celvrije eiwitsynthese uit exonuclease-deficiënte cellulaire extracten met behulp van lineaire DNA-sjablonen

Cell-free protein synthesis (CFPS) has recently become very popular in the field of synthetic biology due to its numerous advantages. Using linear DNA ...

Het protocol is zeer belangrijk omdat het snel, eenvoudig en direct gebruik van lineaire DNA-sjablonen in celvrije eiwitsynthesesystemen mogelijk maakt, zelfs van inheemse E.coli-parameters. De belangrijkste voordelen zijn de tijdshoeveelheid die wordt bespaard door het vermijden van klonen, chemische modificaties van lineaire DNA-uiteinden en beschermende supplementen zoals gamma- of chi-DNA. Aangezien zelfrapportagesynthese-extracten worden ontwikkeld voor verschillende organismen van belang, presenteert onze methode een manier om prototyping in die extracten te versnellen door lineair DNA te gebruiken.Om te beginnen, streak stam BL21 Rosetta-2 delta recBCD van minus 80 graden Celsius glycerol voorraad op een 2x YTP agar plaat die 10 microgram per milliliter chlooramfenicol bevat en 's nachts incuberen bij 37 graden Celsius. Ent vervolgens een enkele kolonie van de agarplaat in iets meer dan 40 milliliter 2x YTP aangevuld met 10 microgram per milliliter chlooramfenicol en incubeer 's nachts bij 37 graden Celsius met 200 RPM schudden. Maak vervolgens een subcultuur door de nachtcultuur 100 keer te verdunnen tot vier liter verse 2x YTP-media met 10 microgram per milliliter chlooramfenicol.Verdeel de vier liter van het medium in vier afzonderlijke kolven. Incubeer bij 37 graden Celsius, 200 RPM, gedurende ongeveer drie tot vier uur groei om een optische dichtheid van 1,5 tot 2,0 te bereiken. Zet de cultuur op ijs, draai de cellen op 5.000 G gedurende 12 minuten bij vier graden Celsius en gooi het supernatant vervolgens weg door te decanteren.Resuspendeer vervolgens de celpellets in 800 milliliter gekoelde S30A met DTT. Nogmaals, draai de cellen op 5.000 G gedurende 12 minuten bij vier graden Celsius zoals eerder aangetoond en gooi het supernatant weg door te decanteren. Breng na het resuspenderen van celpellets in 160 milliliter gekoeldE S30A met DTT de cellen over naar gekoelde en vooraf gewogen buizen van 50 milliliter.Draai de cellen op 2000 G gedurende acht minuten op vier graden Celsius en gooi het supernatant vervolgens weg door te decanteren. Nogmaals, draai de cellen op 2000 G gedurende vier minuten bij vier graden Celsius en verwijder vervolgens het resterende supernatant voorzichtig met behulp van een pipet. Meet vervolgens het gewicht van de buis opnieuw om het gewicht van de celpellet te berekenen en houd de celpellets op min 80 graden Celsius.Nadat u de celpellets van min 80 graden Celsius hebt ingenomen, ontdooit u ze één tot twee uur op ijs en resuspenseert u de celpellets in 0,9 milliliter S30A met DTT-buffer per gram van het gewicht van de celpellet. Pipetteer vervolgens langzaam om de cellen te resuspenderen en vermijd zoveel mogelijk schuim van de bovenkant. Plaats aliquots van één milliliter van de geresuspendeerde cellen in microbuisjes van 1,5 milliliter en bewaar ze op ijs of een voorgekoeld koud blok op vier graden Celsius.Soniceer vervolgens elke buis in een sonicator met een opstelling van 20% amplitude gedurende drie cycli en draai het lysaat op 12.000 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Nadat u het supernatant met een pipet hebt verzameld, brengt u over naar een buis van 50 milliliter. Incubeer de cel lysaat bij 37 graden Celsius bij 200 RPM agitatie gedurende 80 minuten.Na het afdraaien van het lysaat en het verzamelen van het supernatant in voorgekoelde microbuisjes van 1,5 milliliter, aliquot 30 microliter in voorgekoelde PCR 8-stripbuizen, terwijl alle buizen op ijs worden gehouden. Flash bevries de lysaat aliquots op droogijs en bewaar bij min 80 graden Celsius. Bereid een hoofdmix voor volgens het tabblad buffervoorbereiding zoals beschreven in het manuscript.Voeg voor een reactievolume van 10,5 microliter 1,05 microliter verschillende Mg-glutamaatbouillonconcentraties en 9,45 microliter van de mastermix toe en meng voorzichtig. Pipetteer 10 microliter van de bovenstaande reacties in een 384-well vierkante bodemmicroplaat en bedek deze met een zelfklevende plaatafdichting. Meet genexpressie als fluorescentie-output door fluorescentiegegevens met regelmatige tussenpozen met een plaatlezer te registreren gedurende acht uur incubatie bij 30 graden Celsius met continu orbitaal schudden met 307 cycli per minuut.Na het identificeren van de Mg-glutamaatconcentratie die resulteert in de hoogste fluorescentiewaarde op het eindpunt, gaat u verder met K-glutamaatkalibratie. Voer het experiment uit en identificeer de hoogste fluorescentiewaarde uit de geteste K-glutamaatconcentraties, waardoor de optimale buffersamenstelling voor Mg-glutamaat en K-glutamaat voor dit lysaat wordt geïdentificeerd. Zodra de Mg-glutamaat- en K-glutamaatwaarden zijn vastgesteld, bereidt u voorraadbuizen van de geoptimaliseerde buffersamenstelling voor op basis van het verkregen batchvolume.Na het berekenen van het aantal benodigde bufferbuizen, aliquot 38 microliter per buis en bewaar bij min 80 graden Celsius. Label eerst een microbuisje van 1,5 milliliter voor de optimale bereiding van de mastermix. Voeg de juiste volumes van de buffer toe en lyseer en meng ze voorzichtig.Pipetteer vervolgens eerst de DNA-monsters, gevolgd door nucleasevrij water en ten slotte de optimale mastermix. Meng de celvrije reactie voorzichtig met een pipet vlak voordat u deze aan de plaatlezer toevoegt en vermijd bubbels. Na het instellen van de reacties in de plaatlezer, registreerden kinetische runs fluorescentiegegevens met regelmatige tussenpozen gedurende acht uur incubatie bij 30 graden Celsius met continu orbitaal schudden bij 307 cycli per minuut.Na kalibratie van het lysaat was de optimale concentratie mg-glutamaat vergelijkbaar met acht millimol over extracten voor zowel lineair als plasmide-DNA. De optimale K-glutamaatconcentratie voor plasmide-DNA is echter 140 millimolar, terwijl de optimale K-glutamaatconcentratie voor lineair DNA 20 millimolar is. Na kalibratiestappen werden niveaus van GFP-expressies vergeleken tussen lineair en plasmide-DNA in de wild-type, delta recB en delta recBCD-extracten.De GFP-expressie van lineair DNA bereikte 102% en 138% van de expressie van plasmide-DNA in extracten van respectievelijk delta recB- en delta recBCD-stammen. De belangrijkste dingen in het protocol zijn sonicatielyse van de cel en de bufferkalibratiestappen afzonderlijk voor lineair en plasmide-DNA, vooral bij gebruik van de native parameters. Deze techniek zou helpen bij het versnellen van het testen van biologische ontwerpen in celvrije systemen, bijvoorbeeld de screening van biosensoren, enzymen en routes, of prototyping van synthetische genetische circuits.

cell-free-protein-synthesis-from-exonuclease-deficient-cellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Een belangrijke belemmering voor de biochemische analyses van de ribosomen met ontluikende peptidyl-tRNA's is de aanwezigheid van andere ribosomen zijn in dezelfde monsters, ribosomen niet betrokken bij de vertaling van de specifieke mRNA-sequentie worden geanalyseerd. We ontwikkelden een eenvoudige methode om uitsluitend te zuiveren,, de ribosomen met de ontluikende peptidyl-tRNA van belang.

Isolatie van vertalen Ribosomen bevattende peptidyl-tRNA&#39;s voor functionele en structurele analyses

Source: Wiegand, D. J., et al. Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens. J. Vis. Exp. (2019).This video demonstrates the use of a bacterial cell-free protein expression system based on Vibrio natriegens crude lysate to perform coupled in vitro transcription and translation. It highlights the preparation of a master mix with essential components and the step-by-step synthesis of functional proteins from a DNA template.

Cell-Free Protein Expression Using a Bacterial Crude Cell Extract

Dit artikel presenteert een gevoelige methode genaamd Circle-Seq voor het zuiveren van extrachromosomale circulaire DNA (eccDNA). De methode omvat zuivering in een kolom, verwijdering van resterend lineair chromosomaal DNA, rolling-circle-amplificatie en high-throughput sequencing. Circle-Seq is toepasbaar voor het screenen op genoomschaal van eukaryotische eccDNA en het bestuderen van genoomonstabiliteit en copy-numbervariaties.

Genoom-brede Zuivering van extrachromosomale circulaire DNA van eukaryote cellen

Op een ondergrond, die kan worden gebruikt voor het uitvoeren van cel-vrije gen expressie experimenten op biochips beschrijven we een eenvoudige lithografische procedure voor de immobilisatie van gen-lengte DNA moleculen.

Functionele oppervlak-immobilisatie van genen met behulp van meerstaps Strand Displacement lithografie

Cel-vrije expressiesystemen zijn krachtige en kosten-efficiënte hulpmiddelen voor de synthese van hoog-productie en de screening van belangrijke eiwitten. Hier beschrijven we de voorbereiding van cel-vrije eiwit expressie systeem met behulp van Vibrio natriegens voor de productie van de snelle eiwitten met behulp van de plasmide DNA, lineaire DNA en mRNA sjabloon.

Cel-vrije eiwit expressie met behulp van de snel groeiende bacterie Vibrio natriegens

We klonen en analyseren reporter genen die circulaire RNA's genereren. Deze reporter genen zijn groter dan constructies om lineaire splicing te analyseren en Alu-elementen bevatten. Om de cirkelvormige RNAs te onderzoeken, worden de constructies omgezet in cellen en wordt resulterend RNA geanalyseerd met behulp van RT-PCR na verwijdering van lineair RNA.

Gebruik van Alu Element met minigenen om circulaire RNA's te analyseren

De studie beschrijft een protocol voor het maken van grote (μg-mg) hoeveelheden DNA voor eiwitscreeningcampagnes uit synthetische genfragmenten zonder klonen of het gebruik van levende cellen. De minimale sjabloon wordt enzymatisch verteerd en gecicirkeld en vervolgens versterkt met behulp van isothermische rollende cirkelversterking. Celvrije expressiereacties konden worden uitgevoerd met het ongezuiverde product.

Snelle, enzymatische methoden voor versterking van minimale, lineaire sjablonen voor eiwitprototypering met behulp van celvrije systemen

Dit protocol beschrijft een snelle en eenvoudige methode om bacterieel lysaat te produceren voor celvrije genexpressie, met behulp van een gemanipuleerde stam van Escherichia coli en waarvoor alleen standaard laboratoriumapparatuur nodig is.

Snelle, betaalbare en ongecompliceerde productie van bacteriële celvrije lysaat

Goed gekarakteriseerde genetische delen zijn noodzakelijk voor het ontwerp van nieuwe genetische circuits. Hier beschrijven we een kosteneffectieve, high-throughput methode voor het snel karakteriseren van genetische delen. Onze methode vermindert kosten en tijd door celvrije lysaten, lineair DNA om klonen te voorkomen en akoestische vloeistofverwerking te combineren om de doorvoer te verhogen en reactievolumes te verminderen.

Snelle karakterisering van genetische delen met celvrije systemen

Dit werk beschrijft de bereiding van celextract van Escherichia coli (E. coli) gevolgd door celvrije eiwitsynthese (CFPS) reacties in minder dan 24 uur. Uitleg van het celvrije auto-inductie (CFAI) protocol beschrijft verbeteringen die zijn aangebracht om het toezicht van onderzoekers te verminderen en de verkregen hoeveelheden celextract te verhogen.

Van cellen naar celvrije eiwitsynthese binnen 24 uur met behulp van celvrije auto-inductieworkflow

Dit protocol beschrijft het Cell-Free Protein Synthesis (CFPS)-systeem dat wordt gebruikt bij het bouwen van synthetische cellen. Het schetst de belangrijkste fasen met representatieve resultaten in verschillende microcompartimenten. Het protocol heeft tot doel best practices vast te stellen voor diverse laboratoria in de synthetische celgemeenschap, waardoor de vooruitgang in de ontwikkeling van synthetische cellen wordt bevorderd.

Celvrij eiwitsynthesesysteem voor het bouwen van synthetische cellen

Leer celvrije eiwitsynthese met lineaire DNA-sjablonen uit exonuclease-deficiënte E. coli-extracten. Deze methode versnelt biologisch onderzoek door klonen te vermijden.

Celvrije eiwitsynthese uit exonuclease-deficiënte cellulaire extracten met behulp van lineaire DNA-sjablonen

Meer video's verkennen