Single-Molecule Diffusie en assemblage op polymeer-crowded lipide membranen

Celmembranen zijn zeer druk vanwege de aanwezigheid van ingebedde eiwitten en suikers. We demonstreren beeldvorming van één molecuul op synthetische overvolle ondersteunde lipide bilayers. Dit platform is nuttig voor het onderzoeken van het effect van verdringing op membraanbiomoleculaire reacties, op moleculair niveau.

Het protocol verklaart de analyse van binding, diffusie en assemblage van membraanbiomoleculen. Succes in het experiment hangt af van een rigoureuze reiniging van het substraat, het voorkomen van schade aan de dubbellaag en het handhaven van een hoge signaal-ruisverhouding in beeldvorming met één molecuul. De procedure met mij demonstreren Aditya Upasani en Vishwesh Haricharan Rai, afgestudeerde studenten van het lab.

Begin met het plaatsen van de plasma behandelde acrylplaat op schoon tissuepapier. Pel de dubbelzijdige lasergesneden tape en plak deze op de glijbaan. Gebruik een pipetpunt om de tape plat te maken om lekkage van het ene kanaal naar het andere te voorkomen.

Sluit de kamer door de plasmabehandelde afdekselslip op de afgeplakte dia te plaatsen. Druk met behulp van een pipetpunt voorzichtig op de afdekslip op de getapete gebieden om het kanaal waterdicht te maken. Bij gebruik van glasplaten sluiten de randen af met epoxyhars.

Bewaar de voorbereide microfluïdische beeldvormingskamers gedurende één tot twee weken onder uitgedroogde omstandigheden. Neem een glazen injectieflacon die vooraf is gereinigd met Piranha-oplossing en voeg chloroformoplossing van POPC en DOPE-PEG(2000) toe aan de gewenste molfractie van PEG 2000-lipiden om de uiteindelijke lipideconcentratie van drie millimol te krijgen, na toevoeging van de buffer. Evenzo kunnen andere membraansamenstellingen van lipiden worden bereid.

Droog vervolgens de chloroform uit de injectieflacon met behulp van een zachte stroom stikstof met een kleine werveling, zodat de gewenste lipiden gelijkmatig op het oppervlak van de injectieflacon worden gecoat. Verwijder rest chloroform door de injectieflacon gedurende één uur in een vacuümdesiccator te bewaren. Voeg vervolgens een milliliter PBS toe aan de injectieflacon en incubeer een nacht bij 37 graden Celsius.

Na een nachtincubatie, vortex de injectieflacon voorzichtig gedurende één tot twee minuten totdat de oplossing troebel en melkachtig wordt. Breng nu 100 microliter van deze oplossing over in een kleine centrifugebuis van 500 microliter. Om kleine unilamellaire blaasjes met een diameter van 50 tot 100 nanometer te genereren, soniceert u de oplossing gedurende ongeveer een uur in een badsonicator.

Aan het einde van de ultrasoonapparaat wordt de oplossing duidelijk, als de oplossing nog steeds troebel is, soniceer dan nog eens 30 minuten. Voeg vervolgens calciumchloride toe aan de gesonificeerde blaasjes tot een uiteindelijke concentratie van 30 millimol in de lipideoplossing. Snijd een micropipetpunt om de monsteroplossing te injecteren, zodat deze goed in het gat past.

Meng de lipideoplossing en injecteer deze door een van de gaten in de beeldkamer. Veeg de overtollige oplossing die uit de kamer uit de uitlaat komt met schoon weefsel om de verontreiniging van aangrenzende kanalen te voorkomen. Bereid een bevochtigingskamer voor door nat weefsel aan het einde van een centrifugebuis van 50 milliliter te plaatsen.

Plaats de schuif in de buis en sluit de buisdop. Leg de buis zijwaarts en laat deze assemblage gedurende 90 minuten in een bevochtigde kamer liggen, bij voorkeur in een couveuse bij 37 graden Celsius. Was de kamer grondig met een overvloedige hoeveelheid PBS-buffer, waardoor luchtbellen tijdens het wassen de kamer niet binnendringen, omdat dit defecten in het membraan kan veroorzaken.

Voordat u een experiment op het gebied van mobiliteit en assemblage uitvoert, moet u de TIRF-microscoop uitlijnen door een fluorescerend kraalmonster te bereiden en deze in lage concentraties aan het microfluïdische kanaal toe te voegen, zodat fluorescerende vlekken van afzonderlijke kralen elkaar niet overlappen in de beelden. Visualiseer eerst de kralen in de epifluorescentiemodus. Terwijl de verlichting in de epifluorescentiemodus staat, beweegt u de M5-spiegel op een translatiefase zodanig dat de straal die uit het objectief komt, buigt totdat de totale interne reflectieconfiguratie is bereikt.

Om na te gaan of de TIR-verlichting is bereikt, controleert u of alleen de kralen op het oppervlak zichtbaar zijn wanneer het TIR-evanescentveld het kraalmonster verlicht en vrij zwevende kralen weg van het oppervlak niet worden waargenomen. Stel aan het begin van het experiment het laservermogen op het focusvlak van het doel terug in op vijf tot 10 milliwatt om fotovernietiging van de fluoroforen te voorkomen. Houd de dia op het microscoopstadium en concentreer je eerst op het kale membraan, kleine sporen van onzuiverheden in lipidemembranen zijn voldoende om het membraan te visualiseren.

Injecteer het monster met behulp van een micropipet in de PEG SLB-gecoate beeldkamer. Gebruik voor het meten van de bindingskinetiek van één molecuul een spuitpomp om de gelabelde biomoleculen door de inlaatgaten naar de microfluïdische kamer te laten stromen met een stroomsnelheid van 50 tot 500 microliter per minuut. Als u 5.000 frames wilt opnemen met 25 tot 50 frames per seconde, stelt u de vereiste parameters voor filmacquisitie in.

Start de filmacquisitie en verkrijg meer dan 5.000 frames onder continue stroom van de spuitpomp totdat er geen verdere toename is in het verschijnen van nieuwe vlekken op het membraanoppervlak en analyseer de bindingskinetiek zoals beschreven in het manuscript. Voor het volgen van enkele deeltjes voegt u de gelabelde biomoleculen in lage concentraties toe aan het kanaal met behulp van een micropipet. Om de hoge betrouwbaarheid van sporen die uit de datasets worden hersteld te garanderen, optimaliseert u de concentratie tot een dichtheid van minder dan 0,1 deeltjes per vierkante micrometer, zodat individuele deeltjes zelden paden kruisen.

Incubeer indien nodig de kamer in een bevochtigingsomgeving en was met de buffer voordat u de afbeelding maakt. Voor analyse van het traject van één deeltje verwerft u 200 tot 500 frames met 10 tot 100 frames per seconde en houdt u de objectieve lens gericht op het tweelaagse vlak met minimale podiumdrift tijdens de beeldacquisitie. Voeg voor het meten van subeenheden de relevante concentratie van gelabelde biomoleculen toe aan de microfluïdische beeldvormingskamer en incubeer de dia in een bevochtigingskamer bij de gewenste temperatuur gedurende de vereiste tijd.

Was voor de beeldvorming de beeldkamer met een buffer. Plaats de dia op een microscoop en pas de focus aan om de gelabelde moleculen te visualiseren. Stel het laservermogen in op een niveau waarop het bleken van de fluorofoor geleidelijk plaatsvindt.

Idealiter voor elk geassembleerd complex bestuur je het laservermogen om de stapsnelheid van het bleken van foto's tussen 10 en 20 frames uit elkaar te houden, zoals beschreven in het manuscript, en de afbeeldingen te verkrijgen totdat alle moleculen volledig fotobleekbaar zijn. Voer een tijdsafhankelijke assemblagemeting uit door filmacquisitie te starten zodra het monster in de kamer wordt geïntroduceerd en nieuwe fotobleekfilms te verkrijgen met vaste tijdsintervallen na membraanbinding van verschillende segmenten van de PEG SLB. Binding van Cytolysine A aan lipidemembranen met vijf mol procent DOPE-PEG(2000) vertoonde een verhoogde deeltjesdichtheid en bereikte verzadiging.

Een exponentiële vervalfunctie die past bij de gebonden deeltjes geeft de tijdconstante voor Cytolysine A-membraanbinding. Zonder PEG-polymeer in het membraan vertoonden de meeste tracers beperkte diffusie op SLB's. Kleine niveaus van PEG 2000 in de membraanbilaag werden weggetrokken van het onderliggende oppervlak, waardoor de tracermoleculen zonder oppervlaktebeperkingen konden diffunderen.

Extreme opsluiting wordt echter waargenomen bij een hoge concentratie PEG in het dubbellaagse membraan. ISD2-distributie voor de diffusie van lipofiele DNA-tracer in twee verschillende PEG 2000 lipidemembranen vertoonde verminderde mobiliteit bij hoge concentraties PEG. Na het broeden op het overvolle lipide bilayer membraan vertoonde Cytolysin A veel verschillende fotobleekstappen, wat de vorming van verschillende assemblage-tussenproducten suggereert.

Na correctie voor de etiketteringsefficiëntie toonde de uiteindelijke verdeling van oligomeren de dodecamerische Cytolysine A-soort als de dominante structuur. Membraaneiwitbindingsassemblage en andere reacties moeten worden uitgevoerd in geschikte membraanverdringingsomgevingen. Er moet aandacht worden besteed aan het reinigen van de beeldkamer, het vermijden van het verstoren van de bilayer en het instellen van de TIRF-microscoop.