Name: Single-Molecule Diffusie en assemblage op polymeer-crowded lipide membranen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Leer single-molecule imaging op polymeer-crowded lipide membranen voor membraanbiologie met behulp van smTIRF-microscopie. Dit protocol analyseert binding, diffusie en assemblage van biomoleculen in drukke omgevingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs erkennen prof. Benjamin Schuler voor het delen van de uitdrukking plasmide voor ClyA-eiwit. Dit werk werd ondersteund door human frontier science program (RGP0047-2020).

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier demonstreren we experimenten met één molecuul op ondersteunde lipide bilayers (SLB's) die een drukke omgeving manifesteren voor membraan-ingebedde biomoleculen. De drukke omgeving genereert een uitgesloten volume-effect, wat leidt tot de versterking van biomoleculaire reacties 1,2,39,40. Voor het PEG-lipidensysteem, waarbij het polymeer voornamelijk het volume buiten de dubbellaag inneemt,...

Celmembranen zijn zeer drukke en complexe systemen1. Moleculaire verdringing kan een aanzienlijke impact hebben op de diffusie van membraangebonden entiteiten zoals eiwitten en lipiden 2,3,4. Evenzo worden bimoleculaire reacties op lipidembranen zoals receptordimerisatie of de oligomerisatie van membraancomplexen beïnvloed door verdringing 5,6,7. De aard, configuratie en concentratie van crowders kunnen de membraanbinding, diffusiviteit en eiwit-eiwitinteractie op verschillende manieren regelen 8,9. Omdat het beheersen van membraanverdringing op cellulaire membranen en het interpreteren van de invloed ervan op ingebedde biomoleculen een uitdaging is, hebben onderzoekers geprobeerd alternatieve in vitro systemen op te zetten10.
Een populaire benadering voor kunstmatige overvolle membranen is het dopen van de dubbellaagse membranen met polymeer (zoals polyethyleenglycol, PEG)-getransplanteerde lipiden11,12. Tijdens de visualisatie van eiwit- en lipidedynamiek op ondersteunde lipide bilayers (SLB's), beschermen deze polymeren bovendien de in het membraan ingebedde componenten van het onderliggende negatief geladen substraat (zoals glas) door de bilayer effectief weg te tillen van de onderliggende ondersteuning. Door de grootte en concentratie van het polymeer te variëren, kan men de mate van moleculaire verdringing regelen, evenals de scheiding van de onderliggende vaste steun13,14. Dit is duidelijk een voordeel ten opzichte van lipide bilayers ondersteund op vaste substraten zonder polymeerkussens 15,16, waar transmembraanbiomoleculen hun activiteit kunnen verliezen 17,18,19. Wat nog belangrijker is, het stelt ons in staat om de drukke omgeving van het celmembraan in vitro samen te vatten, wat van cruciaal belang is voor veel membraanprocessen.
Oppervlakte-geënte polymeren op membranen ondergaan ook veranderingen in hun configuratie, afhankelijk van hun entdichtheid12. Bij lage concentraties blijven ze in een entropisch opgerolde configuratie, bekend als een paddenstoel, boven het membraanoppervlak. Met toenemende concentratie beginnen ze te interageren en hebben ze de neiging om zich los te maken en uit te breiden, wat uiteindelijk een dichte borstelachtige formatie op het membraan oplevert21. Omdat de overgang van de paddenstoel naar het borstelregime zeer heterogeen is en zich manifesteert in slecht gekarakteriseerde omstandigheden van het polymeer, is het belangrijk om goed gekarakteriseerde omstandigheden te gebruiken voor verdringing op polymeergeënte membranen. Vergeleken met een recente studie20, identificeren en rapporteren we drukke membraansamenstellingen die het diffusieve transport en de activiteit van transmembraanbiomoleculen handhaven.
In dit protocol bespreken we hoe we PEGylated lipidemembranen kunnen genereren en geven we aanbevelingen voor PEG-dichtheden die verdringing nabootsen in twee verschillende regimes van polymeerconfiguratie (namelijk paddenstoel en borstel). Het protocol beschrijft ook single-molecule binding, particle tracking en photobleaching data-acquisitie en -analyse voor moleculen ingebed in deze overvolle membranen. Eerst beschrijven we de grondige reinigingsstappen, de assemblage van de beeldkamer en de generatie PEG-SB's. Ten tweede geven we details voor de single-molecule binding, deeltjes tracking en fotobleaching experimenten. Ten derde bespreken we i) het extraheren van de relatieve bindingsaffiniteiten, ii) het karakteriseren van moleculaire diffusie en iii) het tellen van subeenheden in een eiwitassemblage uit films van afzonderlijke moleculen op het membraan.
Hoewel we dit systeem hebben gekarakteriseerd met beeldvorming met één molecuul, is het protocol nuttig voor alle membraanbiofysici die geïnteresseerd zijn in het begrijpen van het effect van drukte op biomoleculaire reacties op lipidembranen. Over het algemeen presenteren we een robuuste pijplijn voor het maken van drukke en ondersteunde lipide bilayers, samen met verschillende single-molecule assays die op hen zijn uitgevoerd en de bijbehorende analyseroutines.

<table><tbody><tr><td>2.5 ml Syringes</td><td>HMD Healthcare</td><td>Dispo Van, 2.5 ml Tuberculin</td><td>Kunststof injectiespuit</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Finar Chemicals</td><td>10020LL025</td><td></td></tr><tr><td>Acrylplaat</td><td></td><td></td><td>2 mm dik</td></tr><tr><td>Acrylplaat</td><td>BigiMall</td><td></td><td>2 mm, helder</td></tr><tr><td>Bath Sonicator</td><td>Branson</td><td>CPX-1800</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>528730</td><td>&nbsp;HPLC-kwaliteit</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Avanti</td><td>700100</td><td></td></tr><tr><td>Coplinpot</td><td>Duran Wheaton Kimble</td><td>S6016</td><td>8-schuifpot met glazen deksel</td></tr><tr><td>Dekglasjes</td><td>VWR</td><td>631-1574</td><td>24 mm X 50 mm</td></tr><tr><td>Cy3-DNA-streng</td><td>IDT</td><td></td><td>GCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT GGTGTGGTTGG-Cy3</td></tr><tr><td>Cyanine kleurstof (Cy3)</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>PA23001</td><td></td></tr><tr><td>DiI</td><td>Invitrogen</td><td>D3911</td><td>Dil-kleuring (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanineperchloraat ('DiI'; DiIC18(3)))</td></tr><tr><td>DNA-connectorstreng 1</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC T</td></tr><tr><td>DNA-connectorstreng 2</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>CGGACGCAATAGCAGCTCACAG TCGGTCACAT</td></tr><tr><td>DNA-tocoferolsteng</td><td>Biomers</td><td></td><td>Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA</td></tr><tr><td>DOPE-PEG2000</td><td>Avanti</td><td>880130</td><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-[methoxy(polyethyleenglycol)-2000] (ammoniumzout)</td></tr><tr><td>Dubbelzijdige tape</td><td>3M</td><td>LF93010LE</td><td></td></tr><tr><td>Boorbits (met diamantcoating)</td><td></td><td></td><td>0,5 - 1 mm</td></tr><tr><td>Boormachine</td><td>Dremel</td><td>220</td><td>Werkstation</td></tr><tr><td>EMCCD</td><td>Andor</td><td>DU-897U-CS0-#BV</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentiekralen</td><td>Invitrogen</td><td>F10720</td><td></td></tr><tr><td>Glasplaatjes</td><td>Blue Star</td><td></td><td>Micro Slides, PIC-1</td></tr><tr><td>Glazen flesjes</td><td>Sigma</td><td>854190</td><td></td></tr><tr><td>Waterstofperoxide</td><td>Lobachemie</td><td>00182</td><td>30%-oplossing, AR-kwaliteit</td></tr><tr><td>Labolene</td><td>Thermo-Fischer Scientific</td><td></td><td>&nbsp;Detergent</td></tr><tr><td>Laser 532 nm</td><td>Coherent</td><td>Sapphire</td><td></td></tr><tr><td>Lasersnijder</td><td>Universal Laser Systems</td><td>ILS12.75</td><td></td></tr><tr><td>Lissamine Rhodamine DOPE</td><td>Avanti</td><td>810150</td><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammoniumzout)</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Finar Chemicals</td><td>30932LL025</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaatbufferoplossing (PBS)</td><td></td><td></td><td>1X</td></tr><tr><td>Plasmareiniger</td><td>Harrick Plasma Inc</td><td>PDC-002</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti</td><td>850457</td><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfocholine</td></tr><tr><td>Programmeerbare injectiepomp</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE1010</td><td>Hogedrukinjectiepomp</td></tr><tr><td>PTFE-doppen</td><td>Sigma</td><td>27141</td><td></td></tr><tr><td>PTFE-slangen</td><td>Cole-Parmer</td><td>WW-06417-21</td><td>Masterflex, 0,022" ID x 0,042" OD</td></tr><tr><td>Zwavelzuur</td><td>SD Fine Chemicals</td><td></td><td>98%, AR-kwaliteit</td></tr><tr><td>TIRF-objectief</td><td>Olympus</td><td>UPLAPO100XOHR</td><td></td></tr><tr><td>Vacuumdroger</td><td>Tarsons</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortexmixer</td><td>Tarsons</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

single-molecule diffusie en assemblage op polymeer-crowded lipide membranen

Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes

Cellulaire membranen zijn zeer drukke omgevingen voor biomoleculaire reacties en signalering. Toch gebruiken de meeste in vitro experimenten die de eiwitinteractie met lipiden onderzoeken naakte dubbellaagse membranen. Dergelijke systemen missen de complexiteit van verdringing door membraan-ingebedde eiwitten en glycanen en sluiten de bijbehorende volume-effecten uit die worden aangetroffen op cellulaire membraanoppervlakken. Ook voorkomt het negatief geladen glasoppervlak waarop de lipide bilayers worden gevormd de vrije diffusie van transmembraanbiomoleculen. Hier presenteren we een goed gekarakteriseerd polymeer-lipidemembraan als een nabootsing voor drukke lipidemembranen. Dit protocol maakt gebruik van polyethyleenglycol (PEG) -geconjugeerde lipiden als een gegeneraliseerde benadering voor het opnemen van crowders in de ondersteunde lipide bilayer (SLB). Eerst wordt een reinigingsprocedure van de microscopische dia's en coverslips gepresenteerd voor het uitvoeren van experimenten met één molecuul. Vervolgens worden methoden besproken voor het karakteriseren van de PEG-SLBs en het uitvoeren van experimenten met één molecuul van de binding, diffusie en assemblage van biomoleculen met behulp van single-molecule tracking en fotobleaching. Ten slotte laat dit protocol zien hoe de nanoporiënassemblage van bacterieel porievormend toxine Cytolysine A (ClyA) op overvolle lipidemembranen kan worden gevolgd met fotobleachingsanalyse met één molecuul. MATLAB-codes met voorbeeldgegevenssets zijn ook opgenomen om enkele van de gemeenschappelijke analyses uit te voeren, zoals het volgen van deeltjes, het extraheren van diffusief gedrag en het tellen van subeenheden.

Monitoring van de binding van ClyA-eiwit op PEGylated membranen Na stap 4.5 wordt de bindingskinetiek geschat door het aantal deeltjes dat in de loop van de tijd aan het membraanoppervlak bindt uit te zetten (video 1). Naarmate ClyA-eiwit zich bindt aan een membraan met 5 mol% PEG2000-lipiden, neemt de deeltjesdichtheid toe en bereikt verzadiging (figuur 5). Een exponentieel verval dat past bij de gebonden deeltjes (cyaancirkels) geeft de tijdconstante (τ...

Hier wordt een protocol gepresenteerd om de binding, mobiliteit en assemblage van afzonderlijke moleculen op kunstmatige overvolle lipidemembranen uit te voeren en te analyseren met behulp van single-molecule total internal reflection fluorescence (smTIRF) microscopie.

Single-Molecule Diffusie en assemblage op polymeer-crowded lipide membranen

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction ...

Celmembranen zijn zeer druk vanwege de aanwezigheid van ingebedde eiwitten en suikers. We demonstreren beeldvorming van één molecuul op synthetische overvolle ondersteunde lipide bilayers. Dit platform is nuttig voor het onderzoeken van het effect van verdringing op membraanbiomoleculaire reacties, op moleculair niveau.Het protocol verklaart de analyse van binding, diffusie en assemblage van membraanbiomoleculen. Succes in het experiment hangt af van een rigoureuze reiniging van het substraat, het voorkomen van schade aan de dubbellaag en het handhaven van een hoge signaal-ruisverhouding in beeldvorming met één molecuul. De procedure met mij demonstreren Aditya Upasani en Vishwesh Haricharan Rai, afgestudeerde studenten van het lab.Begin met het plaatsen van de plasma behandelde acrylplaat op schoon tissuepapier. Pel de dubbelzijdige lasergesneden tape en plak deze op de glijbaan. Gebruik een pipetpunt om de tape plat te maken om lekkage van het ene kanaal naar het andere te voorkomen.Sluit de kamer door de plasmabehandelde afdekselslip op de afgeplakte dia te plaatsen. Druk met behulp van een pipetpunt voorzichtig op de afdekslip op de getapete gebieden om het kanaal waterdicht te

single-molecule-diffusion-assembly-on-polymer-crowded-lipid

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

We tonen een opgeslagen of vervoerd lipidedubbellaag formatie systeem. Een lipide dubbellaag membraan kan worden gevormd binnen 1 uur meer dan 80% succes als een bevroren membraan precursor tot omgevingstemperatuur wordt gebracht. Dit systeem tijdrovend proces en deskundigheid geassocieerd met ionkanalen verminderen.

Geautomatiseerde lipidebilaagmembraan Vorming Met behulp van een Polydimethylsiloxane Thin Film

Een protocol voor de synthese en karakterisering van diffuse beweging van cyclische polymeren op de single molecule-niveau wordt gepresenteerd.

Synthese van cyclische polymeren en karakterisering van hun Diffusive Motion in de Smelt staat bij de Single Molecule niveau

Wij presenteren een protocol glas functionaliseren met nanometrische eiwit pleisters omgeven door een vloeibare lipide dubbellaag. Deze substraten zijn compatibel met geavanceerde optische microscopie en zullen naar verwachting om te dienen als platform voor celadhesie en migratie studies.

Ligand Nano-cluster Arrays in een ondersteunde lipide dubbellaag

Op het snijvlak van organische en waterige oplosmiddelen assembleren op maat gemaakte amfifiele elastine-achtige eiwitten zich in complexe supramoleculaire structuren zoals blaasjes, vezels en coacervaten die worden geactiveerd door omgevingsparameters. De beschreven assemblageprotocollen leveren Op eiwitmembraan gebaseerde compartimenten (PMBC's) met tunable eigenschappen, waardoor de inkapseling van verschillende lading.

Geleid Assemblage van Elastin-achtige eiwitten in gedefinieerde supramoleculaire structuren en cargo-encapsulation in vitro

Mitochondriale fusie is een belangrijke homeostatische reactie die ten grondslag ligt aan mitochondriale dynamiek. Hier beschreven is een in vitro reconstitution systeem om mitochondriale binnenmembraan fusie die membraan tethering, docking, hemifusion, en porie opening kan oplossen. De veelzijdigheid van deze aanpak bij het verkennen van celmembraansystemen wordt besproken.

Een modelmembraanplatform voor het reconstrueren van mitochondriale membraandynamica

Dit protocol beschrijft de vorming van cel nabootsende uni-lipide en multi-lipide blaasjes, ondersteunde lipide bilayers en gesuspendeerde lipide bilayers. Deze in vitro modellen kunnen worden aangepast om een verscheidenheid aan lipidetypen op te nemen en kunnen worden gebruikt om verschillende molecuul- en macromolecuulinteracties te onderzoeken.

Assemblage van cellimitiek ondersteunde en gesuspendeerde lipide bilayer modellen voor de studie van moleculaire interacties

Dit protocol beschrijft de vorming van ondersteunde lipide bilayers en de toevoeging van cytoskeletale filamenten en motoreiwitten om de dynamiek van gereconstitueerde, membraangebonden cytoskeletale netwerken te bestuderen met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Reconstitutie van membraangebonden minimale actinecorticosterces op ondersteunde lipidebilagen

Celvrije reconstitutie is een belangrijk hulpmiddel geweest om de cytoskeletassemblage te begrijpen, en het werk in het afgelopen decennium heeft benaderingen vastgesteld om septinedynamica in minimale systemen te bestuderen. Hier worden drie complementaire methoden gepresenteerd om septineassemblage in verschillende membraancontexten te observeren: vlakke bilayers, sferische steunen en staafsteunen.

Reconstitutie van septineassemblage bij membranen om biofysische eigenschappen en functies te bestuderen

Dit protocol beschrijft hoe TIRF-microscopie kan worden gebruikt om individuele ionkanalen te volgen en hun activiteit in ondersteunde lipidemembranen te bepalen, waardoor het samenspel tussen laterale membraanbeweging en kanaalfunctie wordt gedefinieerd. Het beschrijft hoe de membranen moeten worden voorbereid, de gegevens moeten worden vastgelegd en de resultaten moeten worden geanalyseerd.

Single-Molecule Imaging van Laterale Mobiliteit en Ion Channel Activity in Lipid Bilayers met behulp van Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopie

Het huidige protocol beschrijft octanol-assisted liposome assembly (OLA), een microfluïdische techniek om biocompatibele liposomen te genereren. OLA produceert monodisperse, micron-sized liposomen met efficiënte inkapseling, waardoor onmiddellijke experimenten op de chip mogelijk zijn. Dit protocol is naar verwachting bijzonder geschikt voor synthetische biologie en synthetisch celonderzoek.

On-chip octanol-geassisteerde liposoomassemblage voor bio-engineering

Dit protocol demonstreert detergent-gemedieerde reconstitutie van een membraaneiwit, cytochroom bo3 ubiquinol oxidase, tot grote unilamellaire blaasjes gemaakt van PDMS-g-PEO en hun omzetting in gigantische blaasjes via fusie-elektroformatie. De resulterende functionele polymeercompartimenten zijn geschikt voor geavanceerde biochemische en biofysische studies.

Bereiding van membraaneiwit-gefunctionaliseerde polymeer en polymeer/lipide hybride grote en gigantische unilamellaire blaasjes

Leer single-molecule imaging op polymeer-crowded lipide membranen voor membraanbiologie met behulp van smTIRF-microscopie. Dit protocol analyseert binding, diffusie en assemblage van biomoleculen in drukke omgevingen.

Single-Molecule Diffusie en assemblage op polymeer-crowded lipide membranen

Meer video's verkennen