Het bepalen van de thermodynamische en kinetische associatie van een DNA-aptamer en tetracycline met behulp van isothermische titratiecalorimetrie

Dit protocol stelt onderzoekers in staat om de bindingsaffiniteiten van aptameren te bepalen tegen doelen die vrij zijn in oplossing, terwijl ze inzicht geven in het mechanisme van binding. Omdat ITC veranderingen in warmte als gevolg van binding meet, hoeft aptamer noch ligand te worden gelabeld of gefunctionaliseerd, zoals het geval zou zijn voor technieken zoals SPR. Nieuwe gebruikers moeten goed letten op het matchen van buffers voor alle bindingscomponenten.

Houd er bovendien rekening mee dat de techniek hoge monstervereisten heeft waaraan moeilijk te voldoen kan zijn voor grotere liganden zoals eiwitten. Activeer om te beginnen het membraan van de dialysekolom, vul met PBS-buffer, balanceer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en centrifugeer op 5.000 keer G gedurende 15 minuten. Verwijder de buffer en laad 500 microliter aptamermonsters in de kolom.

Centrifugeer op 5.000 keer G en herhaal dit vier keer om de oorspronkelijke buffer te vervangen door PBS. Verzamel de gedialyseerde DNA-aptamer met behulp van een pipet en breng deze over naar de nieuwe buis van 1,5 milliliter. Verzamel de laatste doorstroombuffer om tetracycline op te lossen.

Zorg ervoor dat de buffer voor het experiment in de spuit overeenkomt met de buffer in de referentiecel. Bepaal de aptamerconcentratie opnieuw met behulp van een UV-zichtbare spectrometer. Gebruik de laatste uitwisselingsbuffer om de concentratie aan te passen aan 40-micromolair tetracycline en twee-micromolaire aptamer.

Vouw de DNA-aptamer door gedurende 10 minuten op 90 graden Celsius te verwarmen, gedurende 10 minuten op vier graden Celsius af te koelen en vervolgens gedurende 20 minuten terug te keren naar kamertemperatuur. Ontgas het gevouwen aptamer en het gedialyseerde tetracycline met behulp van een ontgassingsstation of vacuümpomp gedurende 25 minuten om opgeloste gassen te elimineren. Na het opruimen en bevestigen van de reinheid van de machine, test u de nauwkeurigheid van de machine met een standaardkit met EDTA en calciumchloride met behulp van het standaardprogramma en volgens de instructies van de fabrikant.

Stel de actieve parameters in. Controleer de vereiste volumes met behulp van een actieve programmacalculator. Voer met deze lopende parameter ITC-metingen uit met 230 microliter 40-micromolair tetracycline in de ITC-spuit en 485 microliter aptamer van twee micromolaire in de ITC-monstercel met behulp van de ITC.

Laad de gedialyseerde tetracycline spuitplaten en het gevouwen aptamer in de monstercel en vermijd bubbels met behulp van een pipet. Begin met het uitvoeren van het ITC-instrument door op de knop Start in de software te klikken. Open de data-analysesoftware door te dubbelklikken om te beginnen met het analyseren van de gegevens.

Open het pad van de opgeslagen onbewerkte gegevens om de neiging tot binding te kennen. Open het tabblad Modellering en gebruik verschillende bindingsmodellen om de beste pasvorm voor de gegevenscurve te vinden. Vervolgens berekent de software automatisch het ITC-thermogram en verschillende thermodynamische parameters, waaronder enthalpie, entropie, vrije energie, evenwichtsbindingsconstante en stoichiometrie.

Verzamel de thermodynamische parameters die worden bepaald op basis van de gegevens en de informatie over het montagemodel. Maak een rapport met foto's van het ITC thermogram en verschillende thermodynamische parameters. De aptamer geselecteerd door Kim, et al bindt aan tetracycline met bindingsaffiniteiten van disassociatieconstante één is gelijk aan 13 micromolair en disassociatieconstante twee is gelijk aan 53 nanomolair.

Het aanpassingsmodel en de stoichiometrie van ITC weerspiegelen dat het aptamer bindt aan tetracycline door een bindingsverhouding van 2:1 met het sequentiële bindingsmodel. De thermodynamische parameters bepaald door ITC-meting voor plaats twee gaven aan dat enthalpie die relatief significant entropisch verlies overwint, de sterke binding aandrijft. De enthalpie-gedreven binding met entropieverlies heeft betrekking op nucleïnezuur conformatieveranderingen, die zijn gerapporteerd als bindingsgedrag tussen RNA en een klein molecuul.

Het aptamer en ligand moeten zich in dezelfde buffer bevinden. Het aptamer moet opnieuw worden gevouwen als het wordt ontwikkeld met hervouwen en monsters moeten worden ontgast. Het aanpakken van deze overwegingen zal ervoor zorgen dat alleen aptamer-ligand interacties bijdragen aan het gemeten signaal.

Vanwege de grootte van het aptamerdoel zou een geschikte follow-upmethode thermoforese op microschaal kunnen zijn om de gemeten bindingsaffiniteit vrij in oplossing te bevestigen.