Flowcytometrie-analyse van hematopoëtische stam- en voorlopercellen van muizenbeenmerg en stromale nichecellen

Het beschreven protocol maakt de fenotypische analyse van beenmerg-hematopoëtische stam- en voorlopercellen en beenmergstromale cellen mogelijk. Het kan worden gebruikt om verstoringen van deze populaties in verschillende omgevingen te bestuderen. In vergelijking met andere eerder beschreven methoden, maakt deze techniek de fenotypische analyse van hematopoëtische cellen mogelijk, met name in de twee functionele merggebieden, endosteal en centraal beenmerg, evenals beenmergstromale cellen.

Plaats om te beginnen het geëuthanaseerde dier met de buik omhoog op een petrischaaltje en spuit met 70% ethanol. Maak een snee boven de buik met een schaar en trek de huid helemaal weg tot aan de enkels. Pak een van de poten en knip aan de onderkant om het met een schaar van het dier te scheiden.

Verwijder vervolgens de voet van het been door bij de enkel te snijden en plaats het been in ijskoude PBS 2% FBS. Pak vervolgens het heupbot met een pincet en knip erachter om het met een schaar van het dier te scheiden. Plaats het heupbeen in ijskoude PBS 2%FBS.

Nadat u het been- en heupbot in een petrischaaltje hebt geplaatst, reinigt u de botten met een steriel scalpel. Scheid vervolgens het scheenbeen en het dijbeen door met het scalpel bij de knie te snijden en plaats de schone botten in ijskoud PBS 2%FBS. Plaats het dijbeen of scheenbeen in een vijzel met ijskoude PBS 2% FBS en plet het bot door het voorzichtig tegen de wand van de vijzel te drukken met behulp van de stamper.

Vervolgens pipetteer de resulterende celophanging op en neer met behulp van een pipet van 10 milliliter om deze te homogeniseren en over te brengen in een buis van 50 milliliter via een celzeef van 40 micrometer die bovenop de buis is geplaatst. Spoel de mortel af met wat meer PBS 2% FBS en breng de oplossing over in dezelfde buis van 50 milliliter door dezelfde 40 micrometer celzeef. Centrifugeer de buis van 50 milliliter op 500 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.

Na het weggooien van het supernatant, resuspendeert u de celpellet in vijf milliliter RBC-lysisbuffer bij kamertemperatuur door meerdere keren op en neer te pipetteren. Voeg na een incubatie van twee minuten bij kamertemperatuur 15 milliliter PBS 2% FBS toe en centrifugeer de buis van 50 milliliter. Als de celpellet er niet roodachtig uitziet, gooit u het supernatant weg, resuspenseert u de pellet in 200 microliter PBS 2% FBS en brengt u de celsuspensie over in een put van een 96-well V-bodemplaat voor kleuring.

Nadat u het bot hebt verpletterd zoals eerder is aangetoond, knipt u de punt van een P1000-pipet met een schaar en gebruikt u deze om alle inhoud van de mortel over te brengen in een buis van 50 milliliter. Centrifugeer vervolgens de buis van 50 milliliter op 500 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Na het weggooien van het supernatant, resuspendien de pellet in drie milliliter collagenase IV en deze dispase-II oplossing.

Incubeer de buis op 37 graden Celsius gedurende 40 minuten. Vul de buis aan tot 25 milliliter met PBS 2% FBS en vortex om te mengen. Breng vervolgens de inhoud over naar een nieuwe buis van 50 milliliter door een celzeef van 100 micrometer.

Voeg vervolgens 15 milliliter PBS 2% FBS toe aan de oude buis van 50 milliliter en breng de oplossing over in de nieuwe buis van 50 milliliter door de 100 micrometer celzeef. Na het centrifugeren en weggooien van het supernatant, resuspensie de celpellet in vijf milliliter RBC-lysisbuffer door meerdere keren op en neer te pipetteren met een pipet. Voeg na de incubatie van twee minuten bij kamertemperatuur 15 milliliter PBS 2% FBS toe.

Nogmaals, centrifugeer de buis en als de celpellet er niet roodachtig uitziet na het weggooien van het supernatant, resuspensie de pellet in 200 microliter PBS 2% FBS en breng de celsuspensie over in een put van een 96-well V-bodemplaat voor kleuring. Centrifugeer de plaat vervolgens gedurende drie minuten op 500 G bij vier graden Celsius. Plaats het dijbeen op een petrischaaltje en snijd de uiteinden van het bot af met een steriel scalpel.

Spoel vervolgens het centrale deel van het bot door 100 microliter PBS 2% FBS eenmaal van elke kant door de binnenkant van het bot te laten gaan met behulp van een insulinespuit zonder dood volume 0,5 milliliter en de oplossing te verzamelen in een microcentrifugebuis met één milliliter PBS 2% FBS. Breng vervolgens de celsuspensie over in een buis van 50 milliliter gelabeld als gespoeld beenmerg met vier milliliter PBS 2% FBS. Plet de uiteinden van het bot in een vijzel met ijskoude PBS 2% FBS door ze voorzichtig tegen de wand van de mortel te drukken met behulp van de stamper.

Zodra de celsuspensie is gehomogeniseerd, brengt u deze over in een buis van 50 milliliter met het label gemalen beenmerg door een celzeef van 40 micrometer. Spoel ten slotte de mortel af met wat meer PBS 2% FBS en breng de oplossing over in dezelfde buis. Flowcytometrie-analyse van hematopoëtische stamcellen en multipotente voorlopercellen werd uitgevoerd in totaal beenmerg bij een gezonde jongvolwassen C57BL6J-muis.

Bij de analyse van stromale cellen, endotheelcellen en mesenchymale stamcellen in totaal beenmerg kunnen mesenchymale stamcellen gemakkelijk worden geïdentificeerd op basis van leptinereceptorexpressie en endotheelcellen kunnen worden geïdentificeerd op basis van de expressie van CD31 en SCA-1. Flowcytometrie-analyse van endotheelcellen in totaal beenmerg die de discriminatie tussen arteriolar en sinusoïdale endotheelcellen op basis van ICAM1 aantonen. De kwantificering van arteriële en sinusoïdale beenmerg endotheelcellen in centraal en endosteaal beenmergweefsel toont aan dat arteriële beenmerg endotheelcellen overvloediger voorkomen in endosteale regio's, terwijl sinusoïden vaker voorkomen in centrale beenmerggebieden.

Bij het verkrijgen van gespoeld beenmerg mag het volume of het aantal keren dat is aangegeven om PBS 2% FBS door de binnenkant van het centrale deel van het bot te passeren, niet worden overschreden. Het combineren van de beschreven methode met functionele assays van de fenotypisch geanalyseerde celpopulaties zou verdere waardevolle informatie opleveren over de mogelijke verstoringen van deze populaties die zich voordoen in de bestudeerde omstandigheden. Het beschreven protocol maakt de fenotypische analyse van hematopoietische cellen differentieel in endosteaal en centraal beenmerg mogelijk, waardoor onderzoekers verstoringen van hematopiese kunnen onderzoeken die mogelijk specifiek in deze beenmerglocaties voorkomen.