Isolatie en karakterisering van de natuurlijke microbiota van het modelnematode Caenorhabditis elegans

Dit protocol maakt nieuwe inzichten mogelijk in de natuurlijke microbiota van C.elegans. Tegelijkertijd kunnen de geïsoleerde microben worden gebruikt in gecontroleerde laboratoriumexperimenten om microbiota-gastheerinteracties en C.elegans-biologie te karakteriseren. Dit protocol richt zich op het isoleren van microben geassocieerd met C.elegans in de natuur, die daarom essentieel zijn voor het begrijpen van de biologie van deze belangrijke modelgastheer in een meer natuurlijke context.

Het zal nuttig zijn om bekend te zijn met het uiterlijk van Caenorhabditis in vergelijking met andere nematoden. Pipetteren onder de ontleedbare scope kan in eerste instantie een uitdaging zijn, maar oefening zal nuttig zijn. Begin met het verzamelen van de milieumonsters zoals compost of rotte vruchten in afzonderlijke plastic zakken, buizen of schone containers.

Verdeel de stukjes van de verzamelde milieumonsters gelijkmatig in een steriele lege petrischaal van negen centimeter en voeg ongeveer 20 milliliter steriel viskeus medium toe om het monster met het medium te bedekken. Zoek onder de ontleedmicroscoop naar Caenorhabditis-nematoden volgens de richtlijnen voor het isoleren van Caenorhabditis elegans en gerelateerde nematoden. Verzamel met een pipet van 20 tot 100 microliter de kleinst mogelijke hoeveelheid vloeistof met de Caenorhabditis-nematoden van de plaat en breng deze over naar de petrischaal van drie centimeter met één tot drie milliliter sterielE M9T.

Om een wormenpopulatie vast te stellen, kunnen de individuele wormen worden overgebracht op een plaat met een nematodengroeimedium of NGM. Om de nematoden te wassen en de microben buiten de nematoden te verwijderen, incubeer je ze in M9T gedurende 10 tot 15 minuten. Pipetteer de kleinst mogelijke hoeveelheid vloeistof die de nematoden bevat en breng deze over naar een nieuwe steriele petrischaal van drie centimeter met één tot drie milliliter vers M9T.

Voor onbevooroordeelde identificatie van nematoden-geassocieerde microben, bereidt u een 96 putplaat met ongeveer drie steriele kralen met een diameter van één millimeter en voegt u een mengsel van 19,5 microliter PCR-buffer en 0,5 microliter proteïnase K per put toe. Breng een enkel gewassen nematode over op elke put met zo min mogelijk vloeistof. Breek de overgebrachte nematoden op met behulp van een kraalhomogenisator gedurende drie minuten bij 30 hertz en centrifugeer de platen of buizen op 8.000 G gedurende 10 seconden bij kamertemperatuur om de vloeistof naar de bodem te krijgen.

Om C.elegans te identificeren, verwarmt u de monsters in een PCR-cycler gedurende een uur bij 50 graden Celsius en 15 minuten bij 95 graden Celsius om DNA van individuele nematoden te isoleren, of gebruikt u commerciële kits om DNA van wormpopulaties te isoleren. Vries het geïsoleerde DNA in bij min 20 graden Celsius voor langdurige opslag. Gebruik het DNA en het primerpaar NLP 30 voorwaarts en NLP 30 achteruit en produceer een 154 basenpaar PCR product.

Om de bacteriën te isoleren, bereidt u een plaat met 96 putten met ongeveer drie steriele kralen van één millimeter, 20 microliter M9-buffer per put en pipetteert u een enkele gewassen nematode naar elke put met zo min mogelijk vloeistof. Breek de nematoden zoals eerder aangetoond met behulp van een kraalhomogenisator, gevolgd door een korte centrifugatie van de plaat om de vloeistof naar de bodem te krijgen. Als u klaar bent, verzamelt u de suspensie en verdunt u deze serieel in één tot 10-verhouding.

Plaat tot 100 microliter van de verdunde suspensie op negen centimeter agarplaten. Incubeer vervolgens de platen bij 15 tot 20 graden Celsius gedurende 24 tot 48 uur. Om de pure bacteriecultuur te verkrijgen, kiest u een enkele kolonie uit de geïncubeerde plaat met behulp van een steriele lus of tandenstoker en streept u deze op een nieuwe agarplaat met hetzelfde agarmedium dat tijdens de zuivering is gebruikt.

Zorg ervoor dat u slechts 1/3 van de plaat gebruikt. Steriliseer vervolgens een herbruikbare lus of gebruik een nieuwe steriele lus en sleep deze door de eerste streep om een tweede streep op een ander 1/3 deel van de monsterplaat te maken. Herhaal het door een lus door de tweede streep te slepen en de derde streep te maken om de groei van de enkele kolonie te bereiken.

Incubeer de plaat onder dezelfde groeiomstandigheden die worden gebruikt voor isolatie en herhaal indien nodig de zuiveringsstap. Kweek de zuivere kolonies in een vloeibaar medium met dezelfde temperatuur en groeiomstandigheden. Karakteriseer vervolgens de bacteriën door het bacteriële DNA uit zuivere vloeistofculturen te extraheren en het 16S ribosomale RNA te versterken met behulp van 27 voorwaartse en 1495 omgekeerde primers en de PCR uit te voeren zoals beschreven in de tekst.

Wanneer de verzamelde fruit- en compostmonsters in petrischalen werden verdeeld en ondergedompeld in een vloeibaar of viskeus medium, resulteerde dit erin dat de wormen het substraatmateriaal verlieten en naar het oppervlak van het medium zwommen. De microben werden geïsoleerd als zuivere enkelvoudige kolonies en de zuivering speelde een essentiële rol omdat sommige C.elegans geassocieerde bacteriën biofilms kunnen vormen of gemakkelijk kunnen aggregeren, wat resulteert in multi-species culturen. De PCR met behulp van de C.elegans specifieke primers, namelijk NLP 30 forward en NLP 30 reverse, resulteerde in de versterking van een 154 base pair product voor C.elegans.

Het DNA geïsoleerd uit enkele wormen resulteerde in zwakke PCR-banden, terwijl DNA-extractie uit de wormpopulaties bestaande uit ten minste 50 wormen een grotere hoeveelheid en duidelijkere banden opleverde. Het succes van C.elegans specifieke PCR werd bevestigd door het DNA van een laboratoriumstam namelijk N2 als positieve controle gelijktijdig met het DNA van de geïsoleerde aaltjes te laten lopen Microben zijn overal. Daarom is het essentieel om onder steriele omstandigheden te werken om ervoor te zorgen dat die microben die geïsoleerd zijn, echt geassocieerd zijn met de worm in de natuur.

De geïsoleerde microben kunnen worden gebruikt om gastheer-microbiota-interacties of de rol van microben op gastheerbiologie te bestuderen, bijvoorbeeld veroudering, ontwikkeling of immuniteit in gecontroleerde laboratoriumexperimenten. Microben geïsoleerd met deze techniek worden momenteel gebruikt door de C.elegans-gemeenschap om het begrip van microbiotadiversiteit op gastheerfitness of de rol van microben op immuniteit te verbeteren.