Reconstitutie van op actine gebaseerde motiliteit met commercieel verkrijgbare eiwitten

Met een eenvoudige mix van ingrediënten en gefunctionaliseerde oppervlakken, herschept dit protocol een vitale functie van cellen, beweging aangedreven door actine assemblage. De biochemische en biofysische mechanismen van krachtproductie kunnen worden beoordeeld door de ingrediëntenmix en de eigenschappen van het gefunctionaliseerde oppervlak te variëren. Het grote voordeel van dit protocol is dat alle ingrediënten kunnen worden gekocht, dus expertise in eiwitzuivering is niet nodig.

Hierdoor kunnen niet-specialisten dit systeem gebruiken als hulpmiddel in hun onderzoek. Dit protocol biedt een onderwijsmodule op undergraduate-niveau, waardoor studenten hands-on ervaring hebben met het manipuleren van eiwitten en het observeren van een zelfgeprepareerd biologisch systeem onder de microscoop. Ze kunnen systeemparameters controleren en variëren.

Fysische analyse, zoals een Langmuir-vergelijking, kan worden uitgevoerd op trajecten. Begin met het resuspenderen van gelyofiliseerde eiwitten. Verzamel de vaste stof aan de onderkant van de buis door eiwitpoeders te centrifugeren op vier graden Celsius.

Voeg vervolgens water toe volgens de instructies van de fabrikant en incubeer op ijs gedurende ten minste 15 minuten. Meng voorzichtig door te pipetteren. Houd het nog 15 minuten op het ijs en meng opnieuw.

Verzamel de oplossing aan de onderkant van de buis door centrifugeren. Remix, en aliquot op ijs. Om actine-oligomeren gevormd tijdens lyofilisatie en bevriezing te depolymeriseren, verdunt u een aliquot geresuspendeerd actine achtvoudig in G-buffer met extra ATP, DTT en 10% gelabelde actine.

Laat het op ijs depolymeriseren met af en toe mengen gedurende ten minste een paar dagen tot een week voordat de eiwitconcentratie wordt gemeten. Om eiwitconcentraties van geresuspendeerde eiwitten te meten, bereidt u eerst een BSA-verdunningsreeks voor. Begin met het plaatsen van twee milliliter en 1,5 milliliter buizen in een rek zoals beschreven in het manuscript.

Vul een conische buis van 15 milliliter naar boven met Bradford Reagent en plaats deze op ijs. Neem 200 microliter Bradford Reagens en werp het terug in de conische buis om de pipetpunt nat te maken. Omdat de oplossing stroperig is, pipetteer dan langzaam om de oplossing in en uit de punt te laten komen en volledig te verlaten zonder bubbels te maken.

Pipetteer vervolgens met behulp van de voorvochtige punt 200 microliter Bradford-reagens in elk van de buizen van 1,5 milliliter in het rek. En breng de resterende inhoud van de conische buis van 15 milliliter terug naar de fles. Meet water uit in de twee milliliterbuizen van rijen één, drie en vijf.

Bereid de BSA-verdunningsreeks voor door de gekalibreerde BSA-stamoplossing te verdunnen zoals beschreven in het manuscript. Maak vervolgens seriële verdunningen door 900 microliter van elke oplossing in de volgende buis over te brengen. Voeg 800 microliter water toe aan de Bradford Reagent-buis voor de blanco en start de timer.

Meng 800 microliter van elke BSA-standaard met 200 microliter Bradford-reagens in de voorbereide buizen. Lees binnen vijf minuten na het mengen met het Bradford Reagens of elke standaard in een wegwerpcuvette de absorptie op 600 nanometer. Breng de verkregen absorptiewaarden in kaart als functie van de bekende BSA-concentratie en verkrijg een lineaire correlatie met een R-waarde van 0,99.

In de buizen die 2000 microliter water bevatten, verdunnen resolubiliseerde eiwitten voorzichtig zoals beschreven in het manuscript. Voeg onmiddellijk 800 microliter van elke oplossing toe aan het bereide Bradford-reagens en meng. Lees de absorpties in de spectrofotometer binnen vijf minuten.

Bereken eiwitconcentraties met behulp van de eerder geconstrueerde standaardcurve. Voor parelcoating koelt u de centrifuge voor tot vier graden Celsius. Pipetteer 50 microliter Xb buffer in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis.

Meng de kragelsuspensie met een diameter van 4,5 micrometer grondig door vortexing en voeg negen microliter van de suspensie toe aan de buis met Xb-buffer. Centrifugeer de monsters bij 20.000 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Om de kralen te coaten, verwijdert u het supernatant voorzichtig zonder de kralen te verstoren en resuspendeert u de kraalkorrel in 40 microliter van twee micromolaire SpVCA in Xb-buffer door voorzichtig te pipetteren.

Roer nu de kralen in het droge blok op 1000 RPM gedurende 20 minuten bij 18 graden Celsius. Was vervolgens de gecoate kralen door te centrifugeren. Het supernatant verwijderen en de kralen resuspenderen in 50 microliter koude Xb met 1%BSA.

Na het wassen van de kralen, resuspendeer de gecoate kraal pellet in 120 microliter koude Xb, 1% BSA. Bewaren op ijs in een koelkast of koelcel. Bereid het motiliteitsreactiemengsel zoals beschreven in het manuscript.

Meng snel de reactie en start de timer. Spot het hele motiliteitsreactiemengsel op een dia. Bedek het met een 18 millimeter bij 18 millimeter coverslip en sluit de coverslip af met gesmolten VALAP met een kleine kwast.

Om gemiddelde verplaatsingssnelheden voor een hele populatie kralen te verkrijgen, registreert u fasecontrast of fluorescerende stilstaande beelden in de loop van de tijd door de hele dia te scannen. Meet de komeetlengte met de hand en registreer de waarden. Zet de komeetlengte versus de tijd uit.

De helling van de lineaire fit is de gemiddelde groeisnelheid. Selecteer timelapse-films in fasecontrastmicroscopie om individuele kraalsnelheden te evalueren. Afhankelijk van de kraalsnelheid en de vereiste resolutie, neem frames om de 1 tot 10 seconden.

Gebruik de trackingtool van elk beeldverwerkingsprogramma om kraalsnelheden en trajecten te verkrijgen. Het mengen van BSA-normen met Bradford Reagent geeft een oplossing met gegradeerde blauwe tinten. Absorptiewaarden worden uitgezet ten opzichte van de standaard eiwitconcentraties en de lineaire correlatie wordt gebruikt om geresuspendeerde eiwitconcentraties te bepalen.

Het mengen van SPVCA-gecodeerde kralen en motiliteitsmedium dat capping-eiwit bevat, leidt binnen enkele minuten tot actinewolkvorming. Wolkenpolarisatie treedt op na ongeveer vijf minuten en komeetproductie op 15 tot 20 minuten. De actinekometen blijven vele uren uitrekken, maar een constante snelheid wordt niet gehandhaafd.

Dus de beweeglijkheid van kralen wordt binnen een uur geëvalueerd. Motility mix met ofwel capping protein of gelsolin geeft kometen op een vergelijkbare manier. Actinewolken polariseerden om kometen te vormen in de eerste 20 minuten van reactie en kometen verlengen in de loop van de tijd.

Evaluatie van komeetlengtes gemeten in de loop van de tijd wordt gebruikt om de verplaatsingssnelheid te berekenen. Bij afwezigheid van aftoppingsactiviteit vormen zich actinewolken rond kralen, maar komeetvorming treedt niet op. Zorgvuldige behandeling en pipettering van eiwitten is essentieel voor het succes van deze procedure, niet alleen bij het maken van de motiliteitsmix, maar ook bij het meten van eiwitconcentraties met de Bradford-test.

Komeetvorming en kraaltrajecten verkregen met dit protocol maken het mogelijk om het fysieke mechanisme van beweging te begrijpen met behulp van zachte materie en statistische fysica-analyse en biofysische experimenten, inclusief krachtmetingen en micromanipulatie.