Polysoom zuivering van sojabonen symbiotische knobbeltjes

Dit protocol is belangrijk omdat het, voor zover wij weten, het eerste is dat een nieuw op centrifuge gebaseerd metaal beschrijft voor kinetische polysoomzuivering van sojasymbiotische knobbeltjes. Het grote voordeel van deze techniek is dat in combinatie met RNA-Seq, de studie van de relatie mogelijk is en georganiseerd in een complex weefsel zoals de symbiotische knobbel. Weeg om te beginnen ongeveer 0,2 gram intacte knobbeltjes in een weegschaal en breng ze over in een voorgekoelde buis van twee milliliter.

Voeg vervolgens 1,2 milliliter polysoomextractiebuffer toe, laat het monster twee minuten ontdooien en homogeniseer met een weefselslijper tot volledige verstoring en homogenisatie van de knobbeltjes. Incubeer vervolgens de monsters op ijs met zachte agitatie gedurende 10 minuten of totdat alle monsters zijn verwerkt en centrifugeer op 16.000 keer G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius om het puin te pelleteren. Herstel vervolgens het supernatant en herhaal de centrifugestap.

Na zorgvuldig herstel van het geklaarde cytosolische extract, breng een aliquot van 200 microliter over naar een schone microcentrifugebuis van 1,5 milliliter voor totale isolatie. Giet vervolgens 4,5 milliliter van de 33,5% sucroselaag in de centrifugebuizen en voeg voorzichtig en langzaam 4,5 milliliter van de 12% laag toe met een P-1000 micropipette. Zet vervolgens de buisjes op ijs tot de toevoeging van het geklaarde cytosolische extract.

Laad een milliliter van het geklaarde cytosolische extract op het sucrosekussen door voorzichtig op de zijwand van de buis te pipetteren. Breng vervolgens de ultracentrifugebuizen over naar voorgekoelde emmers en centrifugeer bij 217, 874 G gedurende twee uur bij vier graden Celsius. Nadat u het resterende cytosolische extract en sucrosekussen hebt weggegooid, suspensie u de polysomale pellet opnieuw met 200 microliter voorgekoelde hersuspensiebuffer.

Incubeer vervolgens gedurende 30 minuten op ijs en breng vervolgens de polysomale re-suspensie over naar 1,5 milliliter voorgekoelde buizen om door te gaan met de RNA-extractie. Na het homogeniseren van de monsters met 750 microliter van het RNA-isolatiereagens gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur incuberen. Voeg vervolgens 200 microliter koud chloroform toe en schud de buizen krachtig gedurende 15 seconden.

Incubeer vervolgens bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Centrifugeer op 12.000 maal G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius voor fasescheiding en breng 500 microliter van de bovenste waterige fase over naar een schone buis zonder de roze organische fase te verstoren. Voeg vervolgens 375 microliter koud isopropanol en 0,5 microliter RNA-vrij glycogeen toe.

Meng daarna grondig door op en neer te pipetteren. Incubeer het mengsel gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius en centrifugeer gedurende 15 minuten op 12.000 maal G. Gooi vervolgens het supernatant weg en was het RNA-neerslag met één milliliter koud, 75% ethanol.

Meng door korte vortexing. Centrifugeer vervolgens op 7.500 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Gooi het supernatant weg en droog de RNA-pellet aan de lucht.

Los vervolgens de pellet op in 50 microliter RNA's vrij water en incubeer gedurende vijf minuten bij 65 graden Celsius. Beoordeel de RNA-concentratie en integriteit met zeer gevoelige capillaire elektroforese en of elektroforese op een 2% RNA-vrije agarose-gel. Voeg na het schatten van het monstervolume 0,1 volumes van drie molaire natriumacetaat, drie volumes koude ethanol en 0,5 microliter RNA's, vrij glycogeen, toe.

Meng ze vervolgens grondig. Capillaire elektroforese werd uitgevoerd voor verschillende totale en polysomale geassocieerde RNA-monsterfracties, die scherpe ribosomale RNA-banden vertoonden, zonder enig besmeurd uiterlijk. Dit komt echter niet tot uiting in de RIN-waarden, aangezien deze variëren tussen 5,9 en 7,5, wat overeenkomt met niet-intacte monsters.

De bioanalyzer slaagde er niet in om de 18S- en 25S-pieken te identificeren zoals te zien in de elektroferogrammen, zowel voor totale als polysoom geassocieerde RNA-monsters. Er was geen visueel teken van monsterdegradatie. Een monster werd echter geanalyseerd om het resultaat van bijna volledig gedegradeerd monster te visualiseren, ter vergelijking.

Het belangrijkste is om te werken in polysomische en RNA-behoudsomstandigheden gedurende het hele protocol. Na sequencing van de totale en par RNA-fracties kunnen standaardpatronen voor de geanalyseerde genexpressie worden gebruikt om differentiële expressiegenen op transcriptie- en translatieniveau te identificeren.