Name: Polysoom zuivering van sojabonen symbiotische knobbeltjes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Leer polysomale zuivering van sojabonen symbiotische knobbeltjes voor transcriptoom- en translatoomanalyse. Deze centrifugegebaseerde methode maakt RNA-Seq-studies mogelijk in complex plantenweefsel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gefinancierd door CSIC I+D 2020 subsidie nr. 282, FVF 2017 subsidie nr. 210 en PEDECIBA (María Martha Sainz).

1. Plantengroei en rhizobia-inenting
<ol><li>Om de benodigde knobbeltjes te genereren, zaait u de sojabonenzaden van keuze in het geselecteerde substraat in een groeikamer onder gecontroleerde omstandigheden. OPMERKING: In dit protocol werden zaden gezaaid in een plastic fles van 0,5 L gevuld met een mengsel van zand: vermiculiet (1: 1). De groeikamer werd ingesteld met een dag/nachtcyclustemperatuur van respectievelijk 28 °C /20 °C en een licht/donkerheid fotoperiode van respectievelijk 16 h/8 h. De fotosynthetisch actieve stralingsintensiteit was 620 μmol·m−2·s−1.</li>
	<li>Bereid van tevoren vloeibaar gist-extract mannitol (YEM) -medium (zie de tabel met materialen). Autoclaaf het medium.</li>
	<li>Ent op dezelfde dag van het zaaien van zaad één kolf met 100 ml YEM met de Bradyrhizobium elkanii U1302-stam. Incubeer de kolf bij 28 °C op een orbitale schudder bij 100 tpm.<ol><li>Laat de rhizobia 2 dagen groeien en ent de zaailingen in met 2 ml van de cultuur.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Behandeling van watertekorten (optioneel)
OPMERKING: Dit protocol schetst de behandeling van het watertekort van de sojaplanten. Dit deel kan worden gewijzigd of volledig worden weggelaten, afhankelijk van de experimentele vraag die voorhanden is.
<ol><li>Laat de sojabonenzaden gedurende 19 dagen groeien (V2-3 ontwikkelingsfase) zonder waterbeperking. Houd het substraat op veldcapaciteit met B&D-medium17 aangevuld met 0,5 mM KNO3.</li>
	<li>Trek op dag 20 water op. OPMERKING: Hier werd het watergehalte dagelijks gemeten door gravimetrie (water gravimetrische inhoud) tijdens de groei- en watertekortperioden.</li>
	<li>Meet de stomatale geleiding in drievoud dagelijks op het abaxiale bladoppervlak met een porometer, zoals geïnstrueerd door de fabrikant (zie de tabel met materialen), vanaf dag 20 tot het einde van de periode van watertekort. OPMERKING: Het einde van de periode van het watertekort werd voor elke installatie afzonderlijk bepaald wanneer de stomatale geleidingswaarde ongeveer 50% bedroeg van de waarde die op dag 20 werd verkregen door zaaien.</li>
</ol>3. Nodule oogst
<ol><li>Verzamel vloeibare stikstof in een schone container en label 15 ml buizen (één voor elke plant). LET OP: Behandel vloeibare stikstof met cryohandschoenen, gezichtsschermen en veiligheidsbrillen.</li>
	<li>Haal elke plant afzonderlijk op. Knip en gooi het bovengrondse deel weg. Was de wortel grondig met water om het resterende substraat te verwijderen.</li>
	<li>Maak elke knobbel los van de wortel en verzamel ze in een vooraf gechilleerde buis van 15 ml. Vries de buizen uit en bewaar ze bij −80 °C.</li>
</ol>4. Bereiding van cytosolische extracten
OPMERKING: Het uiteindelijke doel van dit protocol is het verkrijgen van hoogwaardig totaal RNA (TOTAL) en polysoom-geassocieerd RNA (PAR). Werk daarom onder omstandigheden die RNA-afbraak voorkomen, houd de monsters altijd op 4 °C en gebruik RNase-vrije laboratoriumapparatuur en -oplossingen. Tenzij anders vermeld, worden alle oplossingen bereid met steriel ultrapuur water.
<ol><li>Voorbereiding van buffervoorraadoplossingen<ol><li>Bereid de in tabel 1 vermelde autoclaveerbare stamoplossingen, autoclaaf ze gedurende 15 minuten en bewaar ze op RT.</li>
		<li>Bereid de in tabel 1 vermelde filtersteriliseerbare stamoplossingen, filtreer ze en houd ze op −20 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereid polysoomextractiebuffer (PEB, zie tabel 1) voor en houd deze op ijs. OPMERKING: De opgegeven volumes zijn voor zes monsters.</li>
	<li>Koel de centrifuge af tot 4 °C en plaats 2 ml microcentrifugebuizen op ijs.</li>
	<li>Weeg ongeveer 0,2 g intacte knobbeltjes in een weegschaal en breng ze over in een voorgekoelde buis van 2 ml. OPMERKING: Voer deze stap snel uit om te voorkomen dat de monsters ontdooien. Als alternatief kan een geschat nodulevolume van 0,4-0,5 ml worden gebruikt in plaats van de 0,2 g.</li>
	<li>Voeg 1,2 ml PEB toe, laat het monster gedurende 2 minuten ontdooien en homogeniseer met een weefselslijper tot volledige verstoring en homogenisatie van de knobbeltjes. OPMERKING: Zorg ervoor dat u de knobbeltjes maalt zodra ze zijn ontdooid, omdat ze zacht genoeg zijn om gemakkelijk te worden verstoord met weefselslijpmachines (zie de tabel met materialen) in microcentrifugebuizen. Bevroren knobbeltjes zijn moeilijk te malen. Ook wordt aanbevolen om de buizen in een benchtop koeler (0 °C) te plaatsen voor een goede homogenisatie terwijl de monsters koel blijven.</li>
	<li>Incubeer de monsters op ijs met zachte roering gedurende 10 minuten of totdat alle monsters zijn verwerkt.</li>
	<li>Centrifugeer bij 16.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C om het vuil te pelleteren. Herstel het supernatant en herhaal de centrifugestap.</li>
	<li>Herstel het geklaarde cytosolische extract zorgvuldig en breng een aliquot van 200 μL over naar een schone microcentrifugebuis van 1,5 ml voor TOTALE isolatie (TOTAL-monsters; zie rubriek 7).</li>
</ol>5. Bereiding van sucrosekussens
OPMERKING: Dit protocol gebruikt een tweelaags sucrosekussen (12% en 33,5%) in ultracentrifugebuizen van 13,2 ml (zie de tabel met materialen). Alle oplossingen worden bereid met steriel ultrapuur water.
<ol><li>Bereid de sucrose en zoutbouillonoplossingen.<ol><li>Bereid 100 ml sucrose-oplossing van 2 M (68,5%, tabel 1).</li>
		<li>Bereid 10x zoutoplossing (tabel 1).</li>
	</ol></li>
	<li>Bereid de twee lagen van het sucrosekussen zoals beschreven in tabel 2. Zie tabel 1 voor de samenstelling van de antibiotische (CHX en CHL) stamoplossingen. OPMERKING: De opgegeven volumes zijn voor zes kussens.</li>
	<li>Giet 4,5 ml van de 33,5% sucroselaag in de centrifugebuizen. Voeg vervolgens voorzichtig en langzaam 4,5 ml van de 12% laag toe met een P1000 micropipette. Zet de buisjes op ijs tot de toevoeging van het geklaarde cytosolische extract.</li>
</ol>6. Polysoomzuivering
<ol><li>Laad 1 ml van het geklaarde cytosolische extract (stap 4.8) op het sucrosekussen door voorzichtig op de zijwand van de buis te pipetteren.</li>
	<li>Breng de ultracentrifugebuizen over in voorgekoelde emmers en centrifugeer met 217.874 × g (35.000 tpm in de genoemde rotor [zie de materiaaltabel]) gedurende 2 uur bij 4 °C.</li>
	<li>Gooi het resterende cytosolische extract en sucrosekussen weg en resuspenseer de polysomale pellet met 200 μL voorgekoelde RB (eerder bereid volgens tabel 1).</li>
	<li>Incubeer gedurende 30 minuten op ijs en breng vervolgens de polysomale resuspensie over naar 1,5 ml voorgekoelde buizen. Ga verder met de RNA-extractie (PAR-monsters).</li>
</ol>7. RNA-extractie en kwaliteitscontrole
OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd voor TOTAL (stap 4.8) en PAR-monsters (stap 6.4).
<ol><li>Bereid 75% EtOH met steriel ultrapuur water en koel het af tot −20 °C. Koel daarnaast chloroform en isopropanol af tot −20 °C.</li>
	<li>Homogeniseer de monsters met 750 μL van het RNA-isolatiereagens en incubeer gedurende 5 minuten bij RT.</li>
	<li>Voeg 200 μL koude chloroform toe en schud de buisjes krachtig gedurende 15 s. Incubeer bij RT gedurende 10 min.</li>
	<li>Centrifugeer bij 12.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C voor fasescheiding. Breng 500 μL van de bovenste waterige fase over naar een schone buis zonder de roze organische fase te verstoren en voeg 375 μL koud isopropanol en 0,5 μL RNase-vrij glycogeen toe (zie de Tabel van Materialen). Meng grondig door op en neer te pipetteren. OPMERKING: Glycogeen is een drager die wordt gebruikt als een co-precipitant om het nucleïnezuurherstel van alcoholprecipitatie te verhogen.</li>
	<li>Incubeer het mengsel gedurende 10 minuten bij 4 °C en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 12.000 × g . Gooi het supernatant weg.</li>
	<li>Was het RNA neerslag met 1 ml koude 75% EtOH. Meng door korte vortexing. OPMERKING: Op dit punt kunnen de monsters 's nachts bij −20 °C worden bewaard.</li>
	<li>Centrifugeer op 7.500 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C, verwijder het supernatant voorzichtig met een micropipette en droog de RNA-pellet aan de lucht.</li>
	<li>Los de pellet op in 50 μL RNase-vrij water en incubeer bij 65 °C gedurende 5 min.</li>
	<li>Beoordeel de RNA-concentratie en integriteit met zeer gevoelige capillaire elektroforese18 (zie de tabel met materialen) en/of elektroforese op een 2% RNase-vrije agarosegel19 (zie de tabel met materialen). OPMERKING: Als de RNA-monsters niet onmiddellijk worden gebruikt of naar de sequencingfaciliteit worden gestuurd voor RNA-seq-bibliotheekvoorbereiding, wordt het aanbevolen om EtOH te gebruiken om ze te bespoedigen.</li>
</ol>8. RNA neerslag
<ol><li>Koel de centrifuge en EtOH af tot 4 °C.</li>
	<li>Bereid 3 M natriumacetaat.</li>
	<li>Bereid 70% EtOH met steriel ultrapuur water en koel het af tot −20 °C.</li>
	<li>Schat het monstervolume. Voeg 0,1 volumes 3 M natriumacetaat, 3 volumes koude EtOH en 0,5 μL RNase-vrij glycogeen toe. Meng.</li>
	<li>Laat bij −20 °C staan totdat het nodig is. OPMERKING: RNA-geprecipiteerde monsters kunnen maximaal 1 jaar worden bewaard bij −80 °C.</li>
</ol>9. Standaardpijplijn voor genexpressieanalyse
<ol><li>Voer een gemiddelde van 40M Illumina paired-end reads uit, met leeslengte > 100 bp, voor betrouwbare transcriptoom- en translatoomgegevensanalyse. OPMERKING: Standaard RNA-seq data-analyse omvat de volgende stappen 9.2-9.5.</li>
	<li>Voer leeskwaliteitsinspectie uit met FastQC (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) of de multisample MultiQC20.</li>
	<li>Verwijder adapters en sequenties van lage kwaliteit met behulp van trimmomatic21, BBDuk (http://jgi.doe.gov/data-and-tools/bb-tools/), cutadapt22, sikkel23 of Trim Galore (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/).</li>
	<li>Als er een referentiegenoom beschikbaar is voor de soort, voer dan leesmapping uit tegen de referentie, gevolgd door kwantificering van de abundantie, met behulp van Bowtie224, TopHat225 of Salmon26 en featureCounts27, naast andere open source-tools.</li>
	<li>Voer statistische analyse uit voor differentiële tot expressie gebrachte genenidentificatie met behulp van edgeR28, DESeq229 of limma30, onder anderen. OPMERKING: Deze open-source software kan lokaal worden gebruikt, via de opdrachtregel. Als alternatief kunnen ze worden bediend via een webbrowser op een openbare server, zoals Galaxy31 of GEOexplorer32, die een grafische gebruikersinterface bieden, zodat er geen opdrachtregelkennis vereist is voor hun gebruik.</li>
</ol>

<ol><li>Limpens, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-+and+tissue-specific+transcriptome+analyses+of+Medicago+truncatula+root+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cell- and tissue-specific transcriptome analyses of Medicago truncatula root nodules.</a> PLoS ONE. 8 (5), 64377(2013).</li>
<li>Masson-Boivin, C., Giraud, E., Perret, X., Batut, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+nitrogen-fixing+symbiosis+with+legumes%3A+How+many+rhizobium+recipes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Establishing nitrogen-fixing symbiosis with legumes: How many rhizobium recipes.</a> Trends in Microbiology. 17 (10), 458-466 (2009).</li>
<li>King, H. A., Gerber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translatome+profiling%3A+Methods+for+genome-scale+analysis+of+mRNA+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">Translatome profiling: Methods for genome-scale analysis of mRNA translation.</a> Briefings in Functional Genomics. 15 (1), 22-31 (2014).</li>
<li>Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+translation+using+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45 (3), 15(2017).</li>
<li>Yángüez, E., Castro-Sanz, A. B., Fernández-Bautista, N., Oliveros, J. C., Castellano, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genome-wide+changes+in+the+translatome+of+Arabidopsis+seedlings+subjected+to+heat+stress%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Analysis of genome-wide changes in the translatome of Arabidopsis seedlings subjected to heat stress.</a> PloS ONE. 8 (8), 71425(2013).</li>
<li>Brown, P. O., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+new+world+of+the+genome+with+DNA+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exploring the new world of the genome with DNA microarrays.</a> Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).</li>
<li>Krishnamurthy, A., Ferl, R. J., Paul, A. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+RNA-Seq+and+microarray+gene+expression+data+in+two+zones+of+the+Arabidopsis+root+apex+relevant+to+spaceflight%5BTitle%5D)+AND+%22Applications+in+Plant+Sciences%22%5BJournal%5D)">Comparing RNA-Seq and microarray gene expression data in two zones of the Arabidopsis root apex relevant to spaceflight.</a> Applications in Plant Sciences. 6 (11), 1197(2018).</li>
<li>Shulse, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+single-cell+transcriptome+profiling+of+plant+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput single-cell transcriptome profiling of plant cell types.</a> Cell Reports. 27 (7), 2241-2247 (2019).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+A+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Kawaguchi, R., Girke, T., Bray, E. A., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+mRNA+translation+contributes+to+gene+regulation+under+non-stress+and+dehydration+stress+conditions+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Differential mRNA translation contributes to gene regulation under non-stress and dehydration stress conditions in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journal. 38 (5), 823-839 (2004).</li>
<li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302(2013).</li>
<li>Vogel, C., Marcotte, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+regulation+of+protein+abundance+from+proteomics+and+transcriptomis+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Insights into regulation of protein abundance from proteomics and transcriptomis analyses.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2013).</li>
<li>Tebaldi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+uncoupling+between+transcriptome+and+translatome+variations+after+a+stimulus+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells.</a> BMC Genomics. 13 (220), 1-15 (2012).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+mRNAs+strongly+correlate+to+proteins+in+a+multivariate+manner+and+their+translation+ratios+are+phenotype+specific%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Translating mRNAs strongly correlate to proteins in a multivariate manner and their translation ratios are phenotype specific.</a> Nucleic Acids Research. 41 (9), 4743-4754 (2013).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling%3A+New+views+of+translation%2C+from+single+codons+to+genome+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling: New views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (3), 205-213 (2014).</li>
<li>Lukoszek, R., Feist, P., Ignatova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+adaptive+response+of+Arabidopsis+thaliana+to+prolonged+thermal+stress+by+ribosomal+profiling+and+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Insights into the adaptive response of Arabidopsis thaliana to prolonged thermal stress by ribosomal profiling and RNA-Seq.</a> BMC Plant Biology. 16 (1), 1-13 (2016).</li>
<li>Broughton, W. J., Dilworth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+leghaemoglobin+synthesis+in+snake+beans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Control of leghaemoglobin synthesis in snake beans.</a> Biochemical Journal. 125 (4), 1075-1080 (1971).</li>
<li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIN%3A+An+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 1-14 (2006).</li>
<li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nondenaturing+agarose+gel+electrophoresis+of+RNA+nondenaturing+agarose+gel+electrophoresis+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), 1-3 (2012).</li>
<li>Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MultiQC%3A+Summarize+analysis+results+for+multiple+tools+and+samples+in+a+single+report%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report.</a> Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+A+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
<li>Marcel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads%5BTitle%5D)+AND+%22EMBnet.journal%22%5BJournal%5D)">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
<li>Joshi, J., Fass, N. Sickle: A sliding-window, adaptive, quality-based trimming tool for FastQ files (Version 1.33). , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/najoshi/sickle">https://github.com/najoshi/sickle</a> (2011).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat2%3A+Accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions%2C+deletions+and+gene+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">TopHat2: Accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biology. 14 (4), 1-13 (2013).</li>
<li>Patro, R., Duggal, G., Love, M. I., Irizarry, R. A., Kingsford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmon+provides+fast+and+bias-aware+quantification+of+transcript+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression.</a> Nature Methods. 14 (4), 417-419 (2017).</li>
<li>Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((featureCounts%3A+An+efficient+general+purpose+program+for+assigning+sequence+reads+to+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">featureCounts: An efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features.</a> Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2013).</li>
<li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((edgeR%3A+A+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">edgeR: A Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (550), 1-21 (2014).</li>
<li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), 47(2015).</li>
<li>Afgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Galaxy+platform+for+accessible%2C+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses%3A+2018+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2018 update.</a> Nucleic Acids Research. 46, 537-544 (2018).</li>
<li>Hunt, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GEOexplorer%3A+A+webserver+for+gene+expression+analysis+and+visualisation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">GEOexplorer: A webserver for gene expression analysis and visualisation.</a> Nucleic Acids Research. , (2022).</li>
<li>Imbeaud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+standardization+of+RNA+quality+assessment+using+user-independent+classifiers+of+microcapillary+electrophoresis+traces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1-12 (2005).</li>
<li>Di Paolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDCD4+regulates+axonal+growth+by+translational+repression+of+neurite+growth-related+genes+and+is+modulated+during+nerve+injury+responses%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">PDCD4 regulates axonal growth by translational repression of neurite growth-related genes and is modulated during nerve injury responses.</a> RNA. 26 (11), 1637-1653 (2020).</li>
<li>Smircich, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling+reveals+translation+control+as+a+key+mechanism+generating+differential+gene+expression+in+Trypanosoma+cruzi%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling reveals translation control as a key mechanism generating differential gene expression in Trypanosoma cruzi.</a> BMC Genomics. 16 (1), 443(2015).</li>
<li>Eastman, G., Sharlow, E. R., Lazo, J. S., Bloom, G. S., Sotelo-Silveira, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+and+translatome+regulation+of+pathogenesis+in+Alzheimer%27s+disease+model+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Transcriptome and translatome regulation of pathogenesis in Alzheimer's disease model mice.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 86 (1), 365-386 (2022).</li>
<li>Zanetti, M. E., Chang, I. -F., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunopurification+of+polyribosomal+complexes+of+Arabidopsis+for+global+analysis+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Immunopurification of polyribosomal complexes of Arabidopsis for global analysis of gene expression.</a> Plant physiology. 138 (2), 624-635 (2005).</li>
<li>Mustroph, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+translatomes+of+discrete+cell+populations+resolves+altered+cellular+priorities+during+hypoxia+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18843-11848 (2009).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li>
<li>Brar, G. A., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling+reveals+the+what%2C+when%2C+where+and+how+of+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 16 (11), 651-664 (2015).</li>
<li>Eastman, G., Smircich, P., Sotelo-Silveira, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Following+ribosome+footprints+to+understand+translation+at+a+genome+wide+level%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+and+Structural+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Following ribosome footprints to understand translation at a genome wide level.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 16, 167-176 (2018).</li>
<li>Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+RNA-seq+of+pathogen+and+host%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dual RNA-seq of pathogen and host.</a> Nature Reviews Microbiology. 10 (9), 618-630 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Het bestuderen van genexpressieregulatie op translationeel niveau is van cruciaal belang om verschillende biologische processen beter te begrijpen, aangezien het eindpunt van celgenexpressie eiwitrijkdom is13,14. Dit kan worden beoordeeld door het translatoom te analyseren van het weefsel of organisme van belang waarvoor de polysomale fractie moet worden gezuiverd en de bijbehorende mRNA's moet worden geanalyseerd 3,4,34,35,36.<...

Vlinderbloemige planten, zoals sojabonen (Glycine max), kunnen symbiose tot stand brengen met specifieke bodembacteriën die rhizobia worden genoemd. Deze mutualistische relatie lokt de vorming uit van nieuwe organen, de symbiotische knobbeltjes, op de plantenwortels. De knobbeltjes zijn de plantenorganen die de bacteriën herbergen en bestaan uit gastheercellen waarvan het cytoplasma wordt gekoloniseerd met een gespecialiseerde vorm van rhizobia die bacteroïden wordt genoemd. Deze bacteroïden katalyseren de reductie van atmosferische stikstof (N2) tot ammoniak, die wordt overgebracht naar de plant in ruil voor koolhydraten 1,2.
Hoewel deze stikstofbindende symbiose een van de meest bestudeerde plant-microbe symbioses is, moeten veel aspecten nog beter worden begrepen, zoals hoe planten die worden blootgesteld aan verschillende abiotische stressomstandigheden hun interactie met hun symbiotische partner moduleren en hoe dit het knobbelmetabolisme beïnvloedt. Deze processen kunnen beter worden begrepen door het nodule-translatoom te analyseren (d.w.z. de subset van messenger RNA's [mRNA's] actief vertaald). Polyribosomen of polysomen zijn complexen van meerdere ribosomen geassocieerd met mRNA, vaak gebruikt om translatie te bestuderen3. De polysoomprofileringsmethode bestaat uit de analyse van de mRNA's geassocieerd met polysomen en is met succes gebruikt om de posttranscriptionele mechanismen te bestuderen die genexpressie beheersen die voorkomt in diverse biologische processen 4,5.
Historisch gezien heeft de analyse van genoomexpressie zich voornamelijk gericht op het bepalen van mRNA-abundantie 6,7,8,9. Er is echter een gebrek aan correlatie tussen transcriptie- en eiwitniveaus als gevolg van de verschillende stadia van posttranscriptionele regulatie van genexpressie, met name translatie 10,11,12. Bovendien is er geen afhankelijkheid waargenomen tussen de veranderingen op het niveau van het transcriptoom en die op het niveau van het translatoom13. De directe analyse van de set mRNA's die worden vertaald, maakt een nauwkeurigere en volledigere meting van de celgenexpressie mogelijk (waarvan het eindpunt eiwitrijkdom is) dan degene die wordt verkregen wanneer alleen mRNA-niveaus worden geanalyseerd 14,15,16.
Dit protocol beschrijft hoe plantaardige polysomen worden gezuiverd uit intacte sojaknollen door differentiële centrifugatie door een tweelaags sucrosekussen (figuur 1). Omdat van bacteroïden afgeleide ribosomen echter ook in de knobbeltjes aanwezig zijn, wordt een mix van ribosomen en RNA-soorten gezuiverd, ook al vertegenwoordigen de eukaryote de belangrijkste fractie (90% -95%). De daaropvolgende RNA-isolatie, kwantificering en kwaliteitscontrole worden ook beschreven (figuur 1). Dit protocol, in combinatie met RNA-seq, moet experimentele resultaten opleveren over de translationele regulatie van eukaryote mRNA's in een complex weefsel zoals de symbiotische knobbel.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64269/64269fig01.jpg"> Figuur 1: Schematisch overzicht van de voorgestelde methodologie voor eukaryote polysoomzuivering uit symbiotische knobbeltjes. Het schema geeft een overzicht van de stappen die in het protocol worden gevolgd van (1) plantengroei en (2) nodule-oogst tot (3) bereiding van de cytosolische extracten, (3) het verkrijgen van TOTAL-monsters en (4) PAR-monsters, en (5) RNA-extractie en kwaliteitscontrole. Afkortingen: PEB = polysoom extractiebuffer; RB = resuspensiebuffer; TOTAAL = totaal RNA; PAR = polysoom-geassocieerd mRNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64269/64269fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table><tbody><tr><td>Plantgroei en rhizobia-inoculatie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbitale shaker</td><td>Daihan Scientific</td><td></td><td>Model SHO-1D</td></tr><tr><td>YEM-medium</td><td>Amresco</td><td>J850 (gistextract) 0122 (mannitol)</td><td></td></tr><tr><td>Watertekort behandeling</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KNO3</td><td>Merck</td><td>221295</td><td></td></tr><tr><td>Porometer</td><td>Decagon Device</td><td></td><td>Model SC-1</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bereiding van cytosolische extracten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brij L23</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1254</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Sigma</td><td></td><td>Model 2K15</td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>DOC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Igepal CA 360</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1.04936</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Kunststof weefselmolen</td><td>Fisher Scientific</td><td>12649595</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>PTE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2393</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Invitrogen</td><td>15504-020</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Weegschaal&nbsp;</td><td>Deltalab</td><td>1911103</td><td></td></tr><tr><td>Bereiding van sucrose kussens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Invitrogen</td><td>15503022</td><td></td></tr><tr><td>SW 40 Ti rotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td>Optima L-100K</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge buizen</td><td>Beckman-Coulter</td><td>344059</td><td>13.2 mL buizen</td></tr><tr><td>RNA extractie en kwaliteitscontrole</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Thermo scientific</td><td>R0492</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td>Model 2100. Eukaryoot totaal RNA nano assay</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>DI</td><td>41191</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Dorwil</td><td>UN1170</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Mallinckrodt</td><td>3032-06</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Sigma</td><td>10814-010</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol LS</td><td>Ambion</td><td>102960028</td><td></td></tr><tr><td>Diverse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon buizen 15 mL</td><td>Biologix</td><td>10-0152</td><td></td></tr><tr><td>Filter tips 10 &micro;L</td><td>BioPointe Scientific</td><td>321-4050</td><td></td></tr><tr><td>Filter tips 1000 &micro;L</td><td>BioPointe Scientific</td><td>361-1050</td><td></td></tr><tr><td>Filter tips 20 &micro;L</td><td>BioPointe Scientific</td><td>341-4050</td><td></td></tr><tr><td>Filter tips 200 &micro;L</td><td>Tarsons</td><td>528104</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge buizen 1.5 mL</td><td>Tarsons</td><td>500010-N</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge buizen 2.0 mL</td><td>Tarsons</td><td>500020-N</td><td></td></tr><tr><td>Sequencing bedrijf</td><td>Macrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steriele 250 mL fles</td><td>Marienfeld</td><td>4110207</td><td></td></tr></tbody></table>

polysoom zuivering van sojabonen symbiotische knobbeltjes

Polysome Purification from Soybean Symbiotic Nodules

Het doel van dit protocol is om een strategie te bieden voor het bestuderen van het eukaryote translatoom van de symbiotische knobbel van sojabonen (Glycine max). Dit artikel beschrijft methoden die zijn geoptimaliseerd om van planten afgeleide polyribosomen en de bijbehorende mRNA's te isoleren die moeten worden geanalyseerd met behulp van RNA-sequencing. Ten eerste worden cytoplasmatische lysaten verkregen door homogenisatie in polysomische en RNA-conserverende omstandigheden van hele, bevroren sojabonenknobbels. Vervolgens worden lysaten gewist door centrifugatie met lage snelheid en wordt 15% van het supernatant gebruikt voor totale RNA (TOTAL) isolatie. Het resterende geklaarde lysaat wordt gebruikt om polysomen te isoleren door ultracentrifugatie door een tweelaags sucrosekussen (12% en 33,5%). Polysoom-geassocieerd mRNA (PAR) wordt gezuiverd uit polysomale pellets na resuspensie. Zowel TOTAL als PAR worden geëvalueerd door zeer gevoelige capillaire elektroforese om te voldoen aan de kwaliteitsnormen van sequencingbibliotheken voor RNA-seq. Als voorbeeld van een downstream-toepassing kunnen na sequencing standaardpijplijnen voor genexpressieanalyse worden gebruikt om differentieel tot expressie gebrachte genen op transcriptoom- en translatoomniveau te verkrijgen. Samenvattend maakt deze methode, in combinatie met RNA-seq, de studie mogelijk van de translationele regulatie van eukaryote mRNA's in een complex weefsel zoals de symbiotische knobbel.

De kwantiteits- en kwaliteitsbeoordeling van de TOTAL- en PAR-fracties die volgens de bovengenoemde procedure zijn gezuiverd, is van cruciaal belang om het succes ervan te bepalen, aangezien voor de meeste downstream-toepassingen, zoals RNA-sequencing, hoogwaardige monsters van fundamenteel belang zijn voor bibliotheekvoorbereiding en -sequencing. Bovendien maakt de integriteit van de RNA-moleculen het mogelijk om een momentopname van het genexpressieprofiel vast te leggen op het moment van monsterverzameling<sup class="...

Dit protocol beschrijft een methode voor eukaryote polysoomzuivering van intacte sojabonenknobbels. Na sequencing kunnen standaardpijplijnen voor genexpressieanalyse worden gebruikt om differentieel tot expressie gebrachte genen op transcriptoom- en translatoomniveau te identificeren.

Polysoom zuivering van sojabonen symbiotische knobbeltjes

The aim of this protocol is to provide a strategy for studying the eukaryotic translatome of the soybean (Glycine max) symbiotic nodule. This paper ...

Dit protocol is belangrijk omdat het, voor zover wij weten, het eerste is dat een nieuw op centrifuge gebaseerd metaal beschrijft voor kinetische polysoomzuivering van sojasymbiotische knobbeltjes. Het grote voordeel van deze techniek is dat in combinatie met RNA-Seq, de studie van de relatie mogelijk is en georganiseerd in een complex weefsel zoals de symbiotische knobbel. Weeg om te beginnen ongeveer 0,2 gram intacte knobbeltjes in een weegschaal en breng ze over in een voorgekoelde buis van twee milliliter.Voeg vervolgens 1,2 milliliter polysoomextractiebuffer toe, laat het monster twee minuten ontdooien en homogeniseer met een weefselslijper tot volledige verstoring en homogenisatie van de knobbeltjes. Incubeer vervolgens de monsters op ijs met zachte agitatie gedurende 10 minuten of totdat alle monsters zijn verwerkt en centrifugeer op 16.000 keer G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius om het puin te pelleteren. Herstel vervolgens het supernatant en herhaal de centrifugestap.Na zorgvuldig herstel van het geklaarde cytosolische extract, breng een aliquot van 200 microliter over naar een schone microcentrifugebuis van 1,5 milliliter voor totale isolatie. Giet vervolgens 4,5 milliliter van de 33,5% sucroselaag in de centrifugebuizen en voeg voorzichtig en langzaam 4,5 milliliter van de 12% laag toe met een P-1000 micropipette. Zet vervolgens de buisjes op ijs tot de toevoeging van het geklaarde cytosolische extract.Laad een milliliter van het geklaarde cytosolische extract op het sucrosekussen door voorzichtig op de zijwand van de buis te pipetteren. Breng vervolgens de ultracentrifugebuizen over naar voorgekoelde emmers en centrifugeer bij 217, 874 G gedurende twee uur bij vier graden Celsius. Nadat u het resterende cytosolische extract en sucrosekussen hebt weggegooid, suspensie u de polysomale pellet opnieuw met 200 microliter voorgekoelde hersuspensiebuffer.Incubeer vervolgens gedurende 30 minuten op ijs en breng vervolgens de polysomale re-suspensie over naar 1,5 milliliter voorgekoelde buizen om door te gaan met de RNA-extractie. Na het homogeniseren van de monsters met 750 microliter van het RNA-isolatiereagens gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur incuberen. Voeg vervolgens 200 microliter koud chloroform toe en schud de buizen krachtig gedurende 15 seconden.Incubeer vervolgens bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Centrifugeer op 12.000 maal G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius voor fasescheiding en breng 500 microliter van de bovenste waterige fase over naar een schone buis zonder de roze organische fase te verstoren. Voeg vervolgens 375 microliter koud isopropanol en 0,5 microliter RNA-vrij glycogeen toe.Meng daarna grondig door op en neer te pipetteren. Incubeer het mengsel gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius en centrifugeer gedurende 15 minuten op 12.000 maal G. Gooi vervolgens het supernatant weg en was het RNA-neerslag met één milliliter koud, 75% ethanol.Meng door korte vortexing. Centrifugeer vervolgens op 7.500 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Gooi het supernatant weg en droog de RNA-pellet aan de lucht.Los vervolgens de pellet op in 50 microliter RNA's vrij water en incubeer gedurende vijf minuten bij 65 graden Celsius. Beoordeel de RNA-concentratie en integriteit met zeer gevoelige capillaire elektroforese en of elektroforese op een 2% RNA-vrije agarose-gel. Voeg na het schatten van het monstervolume 0,1 volumes van drie molaire natriumacetaat, drie volumes koude ethanol en 0,5 microliter RNA's, vrij glycogeen, toe.Meng ze vervolgens grondig. Capillaire elektroforese werd uitgevoerd voor verschillende totale en polysomale geassocieerde RNA-monsterfracties, die scherpe ribosomale RNA-banden vertoonden, zonder enig besmeurd uiterlijk. Dit komt echter niet tot uiting in de RIN-waarden, aangezien deze variëren tussen 5,9 en 7,5, wat overeenkomt met niet-intacte monsters.De bioanalyzer slaagde er niet in om de 18S- en 25S-pieken te identificeren zoals te zien in de elektroferogrammen, zowel voor totale als polysoom geassocieerde RNA-monsters. Er was geen visueel teken van monsterdegradatie. Een monster werd echter geanalyseerd om het resultaat van bijna volledig gedegradeerd monster te visualiseren, ter vergelijking.Het belangrijkste is om te werken in polysomische en RNA-behoudsomstandigheden gedurende het hele protocol. Na sequencing van de totale en par RNA-fracties kunnen standaardpatronen voor de geanalyseerde genexpressie worden gebruikt om differentiële expressiegenen op transcriptie- en translatieniveau te identificeren.

polysome-purification-from-soybean-symbiotic-nodules

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

De bereiding van hoogwaardige gist celextracten is een noodzakelijke eerste stap in de analyse van afzonderlijke eiwitten of hele proteomen. Hier een snelle, efficiënte en betrouwbare homogeniseren protocol voor gist cellen die is geoptimaliseerd om proteïnefuncties, interacties, en post-translationele modificaties behouden beschrijven we.

Ontluikende Gist Protein extractie en zuivering voor de Studie van de functie, interacties, en post-translationele modificaties

Dit manuscript beschrijft de detectie van sumoylation en ubiquitinering van kinetochoor eiwitten, Ndc10 en Ndc80, in de gist Saccharomyces cerevisiae.

Eiwitzuivering Techniek dat Detectie van sumoylation en Ubiquitinering van Budding gist kinetochoor Eiwitten Ndc10 en Ndc80 Maakt

Om basisinformatie te verkrijgen over de sorption en het recyclen van goud uit waterige systemen, werd de interactie van Au(III) en Au(0) nanodeeltjes op S-laag-eiwitten onderzocht. De sorption van eiwitpolymeren werd onderzocht door ICP-MS en die van eiwitmonolagen door QCM-D. Daaropvolgend AFM maakt de beeldvorming van de nanostructuren mogelijk.

Au-Interactie van SLP1 Polymeren en monolaag van<em&gt; Lysinibacillus sphaericus</em&gt; JG-B53 - QCM-D, ICP-MS en de AFM als gereedschap voor Biomolecuul-metal Studies

Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode om transcripten uit plantweefsels te extraheren en te fractoneren op basis van het aantal gebonden ribosomen. Het maakt een globale schatting van de translatieactiviteit mogelijk en de bepaling van de translationele status van specifieke mRNA's.

Een eenvoudige methode voor Plant polysoomdisplays Profiling

Hier presenteren wij een interactief capture protocol toegepast op Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasten. Deze methode berust op in vivo UV-verknoping en staat voor isolatie en identificatie van plantaardige mRNA-bindende eiwitten uit een fysiologische omgeving.

MRNA Interactome Capture van Plant Protoplasts

We ontwikkelden een eenvoudige en efficiënte protocol voor de voorbereiding van grote hoeveelheden soja protoplasten om te studeren van de ingewikkelde regelgeving en signalering mechanismen in levende cellen.

Een eenvoudige methode voor het isoleren van soja protoplasten en toepassing op voorbijgaande gen expressie Analyses

Eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet interacties zijn cruciaal voor alle cellulaire functies. Hierin beschrijven we een protocol waarmee parallelle analyse van deze interacties met een eiwit van keuze. Ons protocol is geoptimaliseerd voor de plant celculturen en affiniteit zuivering combineert met massa spectrometrie gebaseerde eiwitten en metaboliet detectie.

2 in 1: stap zuivering van de affiniteit voor de parallelle analyse van eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet complexen

Een tandem RNA isolatie procedure (reis) voor herstel van endogeen gevormde mRNA-eiwitcomplexen wordt beschreven. Specifiek, RNA-eiwitcomplexen kruisverwijzende in vivo, polyadenylated RNAs zijn geïsoleerd uit extracten met oligo(dT) kralen en bepaalde mRNAs met gemodificeerde RNA antisense oligonucleotides worden vastgelegd. Eiwitten gebonden aan mRNAs worden gedetecteerd door analyse van de immunoblot.

Een Oligonucleotide gebaseerde Tandem RNA isolatie Procedure om te herstellen van eukaryotische mRNA-eiwitcomplexen

Hier presenteren we een aangepaste screeningmethode die uitgebreid kan worden gebruikt om RNA-uitschakelingssuppressors in plantenpathogenen snel te screenen.

Screening en identificatie van RNA Silencing Suppressors van secreted effectors of Plant Pathogens

Het vertalen van ribosoomaffiniteitszuivering (TRAP) biedt de mogelijkheid om ontwikkelingsprogramma's te ontleden met minimale verwerking van organen en weefsels. Het protocol levert hoogwaardig RNA op uit cellen die zijn gericht op een groene fluorescerende eiwit (GFP)-gelabelde ribosomalsubunit. Downstream analysetools, zoals qRT-PCR of RNA-seq, onthullen weefsel- en celtypespecifieke expressieprofielen.

Het vertalen van Ribosome Affinity Purification (TRAP) om Arabidopsis thaliana Root Development te onderzoeken op een cell type-specifieke schaal

Het protocol is ontwikkeld om intacte histonen effectief te extraheren uit sorghumbladmaterialen voor profilering van histon post-translationele modificaties die kunnen dienen als potentiële epigenetische markers om droogtebestendige gewassen te helpen.

Isolatie van histone van Sorghum Leaf Tissue voor Top Down Mass Spectrometry Profiling van potentiële epigenetische markers

Leer polysomale zuivering van sojabonen symbiotische knobbeltjes voor transcriptoom- en translatoomanalyse. Deze centrifugegebaseerde methode maakt RNA-Seq-studies mogelijk in complex plantenweefsel.

Polysoom zuivering van sojabonen symbiotische knobbeltjes

Meer video's verkennen