Name: Analyse van door uithongering geïnduceerde autofagie in het Drosophila melanogaster larvale vetlichaam (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Leer hoe u autofagie induceert in het larvale vetlichaam van Drosophila melanogaster door aminozuurdepletie en klonale verschillen analyseert met GFP-Atg8a-markering. Deze methode onthult genetische effecten op celhomeostase.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn THFC en BDSC dankbaar voor het leveren van de vliegsoorten. Dr. Tong Chao wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (32030027, 91754103, 92157201) en fundamentele onderzoeksfondsen voor de centrale universiteiten. We danken de kernfaciliteit in het Life Sciences Institute (LSI) voor het verlenen van diensten.

1. Drosophila kruising en het leggen van eieren
<ol><li>Introduceer 3 mannelijke (genotype hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a) en 15 vrouwelijke (genotype y' w* Mu FRT19A/ FM7, Kr GFP ) volwassen vliegen (zie tabel met materialen) in een kweekflacon (met standaard maïsmeel/melasse/agar Drosophila media bij 25 °C) voor paring. OPMERKING: Meerdere kweekflacons van hetzelfde kruis moeten worden opgezet om ervoor te zorgen dat er voldoende larven zijn voor verdere experimenten. De mannelijke vliegenstam met genotype hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a draagt een FRT-plaats op het X-chromosoom nabij het centromeer (FRT19A). Het drukt ook FLP uit bij een hitteschok bij 37 °C. Een transgen met alomtegenwoordige RFP-expressie wordt ingebracht op het X-chromosoom. GFP-Atg8a wordt uitgedrukt onder controle van cgGal4 in het larvale vetlichaam22. De vrouwelijke vliegenstam met genotype y' w* Mu FRT19A / FM7, Kr GFP draagt een dodelijke mutatie (Mu) en FRT19A op het X-chromosoom. Het gedetailleerde kruisingsschema is weergegeven in figuur 1.</li>
	<li>Breng voor het leggen van eieren de vliegen over naar een nieuwe kweekflacon. Tik 48 uur na introductie op de "paring" injectieflacon totdat de vliegen verdoofd zijn en op de media aan de basis van de injectieflacon vallen.<ol><li>Koppel de "paringsinjectieflacon" los en bedek de mond met een niet-aangesloten omgekeerde injectieflacon met verse media (injectieflacon met verse cultuur). Breng vervolgens de vliegen over naar de injectieflacon met verse cultuur door de injectieflacons om te draaien en erop te tikken.</li>
		<li>Sluit de verse kweekflacon (met de overgedragen vliegen) aan en gooi de oude kweekflacon weg. Plaats deze injectieflacon met verse cultuur in een broedmachine van 25 °C voor het leggen van eieren op de verse media. OPMERKING: Het voorverwarmen van de verse kweekflacons tot 25 °C gedurende 15 minuten vóór het vliegenoverdrachtsproces zal de vliegen helpen zich snel aan te passen aan de nieuwe omgeving en het leggen van eieren versnellen.</li>
	</ol></li>
	<li>Verwijder de vliegen na 6 uur eieren leggen. Als de experimenten moeten worden herhaald, breng deze vliegen dan over in een andere kweekflacon (zoals beschreven in stap 1.2). Gooi de vliegen anders weg door ze in een kolf met 75% ethanol te dumpen).<ol><li>Incubeer de injectieflacon met embryo's in een waterbad van 37 °C gedurende 1 uur om FLP-expressie te induceren. Plaats ze vervolgens in een incubator van 25 °C en laat de embryo's zich verder ontwikkelen. OPMERKING: De succesvolle vorming van gemuteerde klonen kan vervolgens worden bevestigd door middel van beeldvorming. De afwezigheid van RFP-signalen markeert de mutante klonen.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Aminozuurhonger induceert autofagie
<ol><li>Schep met behulp van een laboratoriumspatel de media met de zich ontwikkelende larven 75 uur na het leggen van het ei in een petrischaaltje. Voeg 3 ml 1x PBS toe aan het gerecht en scheid voorzichtig de kweekmedia en de larven met een lange tang. Selecteer 10 tot 15 vroege derde instarlarven. OPMERKING: Vroege derde instarlarven moeten zorgvuldig worden gekozen. Het ontwikkelingsstadium van de larven is van cruciaal belang voor het succes van dit protocol. Vanwege de beperkte legduur van het ei wordt verwacht dat de meeste larven in de kweekflacon zich in het vroege derde instarstadium bevinden tegen 75 uur incubatie. Verschillende recepten voor cultuurmedia kunnen echter leiden tot variaties in de ontwikkelingstiming van de larven. De criteria voor het onderscheiden van vroege derde instarlarven zijn de lichaamslengte, de aanwezigheid van voorste en achterste spiracles, evenals de mandibulaire haken van het mondapparaat23.</li>
	<li>Vul de putjes van een 9-well glazen drukspotplaat (zie Materiaaltabel) met 1x PBS. Plaats de afgescheiden derde instarlarven in de putjes met een lange tang en was de larven grondig om alle mediaresten te verwijderen.</li>
	<li>Neem 5 ml 20% sucrose (in 1x PBS) oplossing in een lege injectieflacon en plaats de schone derde instarlarven in deze oplossing met een lange tang. Incubeer deze injectieflacon gedurende 6 uur in een incubator van 25 °C voordat u ze oogst voor dissectie. OPMERKING: De 20% sucrose (in 1x PBS) oplossing dient als het aminozuur-deficiënte uithongeringsmedium.</li>
</ol>3. Derde instar larven dissectie en monsterweefselverwerking
<ol><li>Slijp twee paar #5 tangen (zie Materiaaltabel) gelijkmatig aan beide zijden met een slijpsteen.</li>
	<li>Voeg 400 μL 1x PBS toe aan elke put van de 9-well glazen depressiespotplaat en breng de larven met een lange tang over in de putjes. Plaats een larve in een put met de dorsale kant (de kant met de luchtpijp) naar boven gericht.<ol><li>Pak de cuticula van de larve vast met twee #5 tangen in het midden van de larvale stam en scheur voorzichtig de nagelriemen open. De blootgestelde vetlichamen, samen met andere larvale interne weefsels, zullen nog steeds aan het karkas van de larve worden bevestigd. Trek voldoende om de inwendige organen zoveel mogelijk bloot te leggen. Herhaal deze stap voor alle larven. OPMERKING: Elke larve heeft twee grote stukken vetlichaam langs de lichaamsstam. Vet lichaamsweefsel is een witte, ondoorzichtige en platte monolaag die gemakkelijk kan worden onderscheiden onder de dissectiemicroscoop24.</li>
	</ol></li>
	<li>Breng het larvale karkas over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml met 500 μL 4% paraformaldehyde (PFA). Incubeer gedurende 30 minuten bij 25 °C zonder de buizen te schudden. LET OP: 4% PFA is giftig. Draag handschoenen en maskers ter bescherming. OPMERKING: Het wordt aanbevolen om 4% PFA in 1x PBS-buffer te bereiden. PFA poeder lost niet direct op in 1x PBS. Daarom moet het mengsel gedurende een nacht bij 65 °C in een incubator worden geïncubeerd of met tussenpozen gedurende 45 minuten bij 25 °C worden geschud.</li>
	<li>Na 30 minuten incubatie van het karkas met 4% PFA, pipetteer de PFA-oplossing, voeg 500 μL 1x PBS toe aan de buis en schud de buis voorzichtig op een platte rotator gedurende 10 minuten voordat u de 1x PBS-oplossing weggooit (herhaal 3x).</li>
	<li>Breng met een lange tang het vaste en gewassen larvale karkas over naar een put in de 9-depressieve spotplaat gevuld met 1x PBS. Gebruik # 5 tang en verwijder alle niet-vette lichaamsweefsels.</li>
	<li>Gebruik # 5 tang om de stukjes van het vetlichaam op een microscoopglaasje te monteren met 80% glycerol als montagemedium en leg er een coverslip op. OPMERKING: Controleer voor de montage de pH van de 80% glycerol (met behulp van pH-papier, pH = 7 is optimaal) om het GFP-signaal te beschermen. Montagemedia (zie materiaaltabel) met DAPI in 80% glycerol helpen bij het in beeld brengen van de kernen van vetlichaamscellen. Deze glaasjes zijn 1 week stabiel wanneer ze in het donker bij 4 °C worden bewaard.</li>
</ol>

<ol><li>Yorimitsu, T., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy%3A+Molecular+machinery+for+self-eating%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Autophagy: Molecular machinery for self-eating.</a> Cell Death & Differentiation. 12 (2), 1542-1552 (2005).</li>
<li>Jin, S., White, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+autophagy+in+cancer%3A+Management+of+metabolic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Role of autophagy in cancer: Management of metabolic stress.</a> Autophagy. 3 (1), 28-31 (2007).</li>
<li>Mizushima, N., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Autophagy in human diseases.</a> New England Journal of Medicine. 383 (16), 1564-1576 (2020).</li>
<li>Mizushima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451 (7182), 1069-1075 (2008).</li>
<li>Yang, Z., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eaten+alive%3A+A+history+of+macroautophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Eaten alive: A history of macroautophagy.</a> Nature Cell Biology. 12 (9), 814-822 (2010).</li>
<li>Lamb, C. A., Yoshimori, T., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autophagosome%3A+Origins+unknown%2C+biogenesis+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The autophagosome: Origins unknown, biogenesis complex.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 759-774 (2013).</li>
<li>Klionsky, D. J., Eskelinen, E. L., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagosomes%2C+phagosomes%2C+autolysosomes%2C+phagolysosomes%2C+autophagolysosomes...Wait%2CI%27mconfused%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagosomes, phagosomes, autolysosomes, phagolysosomes, autophagolysosomes...Wait,I'mconfused.</a> Autophagy. 10 (4), 549-551 (2014).</li>
<li>Zhang, S., Hama, Y., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+autophagy+proteins-Diversification+in+eukaryotes+and+potential+ancestors+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The evolution of autophagy proteins-Diversification in eukaryotes and potential ancestors in prokaryotes.</a> Journal of Cell Science. 134 (13), (2021).</li>
<li>Scott, R. C., Schuldiner, O., Neufeld, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+and+regulation+of+starvation-induced+autophagy+in+the+Drosophila+fat+body%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Role and regulation of starvation-induced autophagy in the Drosophila fat body.</a> Developmental Cell. 7 (2), 167-178 (2004).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+protein+import+regulates+cytosolic+protein+homeostasis+and+neuronal+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial protein import regulates cytosolic protein homeostasis and neuronal integrity.</a> Autophagy. 14 (8), 1293-1309 (2018).</li>
<li>Ichimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ubiquitin-like+system+mediates+protein+lipidation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A ubiquitin-like system mediates protein lipidation.</a> Nature. 408 (6811), 488-492 (2000).</li>
<li>Rusten, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+autophagy+in+the+Drosophila+fat+body+is+induced+by+ecdysone+through+regulation+of+the+PI3K+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Programmed autophagy in the Drosophila fat body is induced by ecdysone through regulation of the PI3K pathway.</a> Developmental Cell. 7 (2), 179-192 (2004).</li>
<li>Nishida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+Atg5%2FAtg7-independent+alternative+macroautophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Discovery of Atg5/Atg7-independent alternative macroautophagy.</a> Nature. 461 (7264), 654-658 (2009).</li>
<li>Ravikumar, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mammalian+autophagy+in+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Regulation of mammalian autophagy in physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 90 (4), 1383-1435 (2010).</li>
<li>Xie, Z., Nair, U., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg8+controls+phagophore+expansion+during+autophagosome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Atg8 controls phagophore expansion during autophagosome formation.</a> Molecular Biology of the Cell. 19 (8), 3290-3298 (2008).</li>
<li>Shintani, T., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cargo+proteins+facilitate+the+formation+of+transport+vesicles+in+the+cytoplasm+to+vacuole+targeting+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cargo proteins facilitate the formation of transport vesicles in the cytoplasm to vacuole targeting pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (29), 29889-29894 (2004).</li>
<li>Russell, R. C., Yuan, H. X., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+regulation+by+nutrient+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Autophagy regulation by nutrient signaling.</a> Cell Research. 24 (1), 42-57 (2014).</li>
<li>Nagy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+and+why+to+study+autophagy+in+Drosophila%3A+It%27s+more+than+just+a+garbage+chute%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">How and why to study autophagy in Drosophila: It's more than just a garbage chute.</a> Methods. 75, 151-161 (2015).</li>
<li>Golic, K. G., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FLP+recombinase+of+yeast+catalyzes+site-specific+recombination+in+the+Drosophila+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome.</a> Cell. 59 (3), 499-509 (1989).</li>
<li>Senecoff, J. F., Cox, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directionality+in+FLP+protein-promoted+site-specific+recombination+is+mediated+by+DNA-DNA+pairing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Directionality in FLP protein-promoted site-specific recombination is mediated by DNA-DNA pairing.</a> Journal of Biological Chemistry. 261 (16), 7380-7386 (1986).</li>
<li>Germani, F., Bergantinos, C., Johnston, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis in Drosophila.</a> Genetics. 208 (2), 473-490 (2018).</li>
<li>Zappia, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E2F%2FDp+inactivation+in+fat+body+cells+triggers+systemic+metabolic+changes%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">E2F/Dp inactivation in fat body cells triggers systemic metabolic changes.</a> eLife. 10, 67753(2021).</li>
<li>Demerec, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDemerec%2C+M+%22Biology+of+Drosophila%22">Biology of Drosophila</a>. , Hafner Pub. Co. New York, NJ. (1965).</li>
<li>Rizki, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+fat+body+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Wilhelm+Roux%27s+Archives+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval fat body surfaces.</a> Wilhelm Roux's Archives of Developmental Biology. 192 (1), 1-7 (1983).</li>
<li>Szeto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALIS+are+stress-induced+protein+storage+compartments+for+substrates+of+the+proteasome+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">ALIS are stress-induced protein storage compartments for substrates of the proteasome and autophagy.</a> Autophagy. 2 (3), 189-199 (2006).</li>
<li>Renna, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+inducers+of+autophagy+that+enhance+the+clearance+of+mutant+proteins+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chemical inducers of autophagy that enhance the clearance of mutant proteins in neurodegenerative diseases.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (15), 11061-11067 (2010).</li>
<li>Guo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+RNA+interference+screen+identifies+genes+that+regulate+autophagy+at+different+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A large-scale RNA interference screen identifies genes that regulate autophagy at different stages.</a> Scientific Reports. 8, 1-15 (2018).</li>
<li>Tian, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antibody+for+analysis+of+autophagy+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An antibody for analysis of autophagy induction.</a> Nature Methods. 17 (2), 232-239 (2020).</li>
<li>Nezis, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+autophagy+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Selective autophagy in Drosophila.</a> International Journal of Cell Biology. 2012, 146767(2012).</li>
<li>Chu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+materials+for+monitoring+mitochondrial+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Fluorescent materials for monitoring mitochondrial biology.</a> Materials. 14 (15), 4180(2021).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.

Het huidige protocol beschrijft de methoden om (1) vliegen te genereren die gemuteerde klonen in de larvale vetlichamen dragen, (2) autofagie te induceren door aminozuurhonger en (3) de larvale vetlichamen te ontleden. Om met succes klonen in de larvale vetlichamen te genereren, moeten de volgende kritieke stappen ijverig worden uitgevoerd. (1) Het nauwkeurig timen van de hitteschok is cruciaal omdat mitotische recombinatie alleen optreedt wanneer het weefsel mitose ondergaat, en (2) zowel de temperatuur als de duur van ...

Autofagie is een "zelf-etend" proces geïnduceerd door verschillende stress, waaronder aminozuurhonger1. Macroautofagie (hierna autofagie genoemd) is het meest bestudeerde type autofagie en speelt een onvervangbare rol bij het handhaven van cellulaire homeostase2. De storing van autofagie is geassocieerd met verschillende menselijke ziekten3. Bovendien zijn sommige autofagie-gerelateerde genen potentiële doelwitten voor de behandeling van verschillende ziekten4. 
Autofagie wordt op een zeer geavanceerde manier gereguleerd5. Bij uithongering sequesteren de isolatiemembranen cytoplasmatische materialen om dubbelmembrane autofagosomen te vormen6. Autofagosomen fuseren dan met endosomen en lysosomen om amfosomen en autolysosomen te vormen. Met behulp van lysosomale hydrolytische enzymen wordt de overspoelde cytoplasmatische inhoud afgebroken en worden de voedingsstoffen gerecycled7. 
Autofagie is een evolutionair geconserveerd proces8. Drosophila melanogaster is een geweldig model voor het bestuderen van het autofagieproces in vivo. Aminozuurhonger induceert gemakkelijk autofagie in vliegvet lichaamsweefsel, een analoog van menselijke lever en vetweefsel9. Defecten in autofagie verstoren de verschillende punctapatronen van verschillende autofagie-gerelateerde eiwitten, zoals Atg8, Atg9, Atg18, Syx17, Rab7, LAMP1 en p62, onder andere10. Daarom zal het analyseren van de patronen van deze autofagiemarkers helpen bij het onderscheiden van het optreden van autofagiedefecten en de defecte autofagiestap. Het ubiquitine-achtige eiwit Atg8 is bijvoorbeeld de meest gebruikte autofagiemarker11. In Drosophila melanogaster zijn transgene stammen met een groen fluorescerend eiwit (GFP)-gelabeld Atg8a met succes ontwikkeld12. GFP-Atg8a wordt verspreid in het cytosol en de kernen in de gevoede cellen. Bij uithongering wordt GFP-Atg8a verwerkt en gemodificeerd door fosfatidylethanolamine (PE) en vormt puncta, die de isolatiemembranen en volledig ontwikkelde autofagosomen labelen13,14. Door middel van directe fluorescentiemicroscopie kan de autofagie-inductie gemakkelijk worden waargenomen als een toename van GFP-Atg8 punctavorming15. Atg8a puncta zou zich niet vormen als reactie op uithongering in de aanwezigheid van een autofagie-initiatiedefect. Omdat GFP-Atg8a kan worden geblust en verteerd door de lage pH in autolysosomen, kan GFP-Atg8a puncta in aantal toenemen als autofagie in late stadia wordt geblokkeerd16.
Omdat autofagie zeer gevoelig is voor de beschikbaarheid van voeding17, leiden kleine verschillen in kweekomstandigheden vaak tot variaties in fenotypen. Daarom heeft klonale analyse, een methode die mutante cellen analyseert versus wild-type controlecellen in hetzelfde weefsel, een groot voordeel bij het ontleden van autofagiedefecten18. Door gebruik te maken van flippase / flippase recognition target (FLP / FRT) -gemedieerde site-specifieke recombinatie tussen homologe chromosomen, worden vliegen die mozaïekweefsels dragen gemakkelijk gemaakt19,20. De wild-type cellen rond de mutante cellen vormen een perfecte interne controle om individuele verschillen te voorkomen21.
De huidige studie beschrijft hoe autofagie te induceren door aminozuurhonger en GFP-Atg8a-expressie mozaïekvetweefsels te genereren. Deze protocollen kunnen worden gebruikt voor het analyseren van verschillen in autofagie tussen gemuteerde klonen.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL microcentrifuge tube</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>#5 Forceps</td><td>Dumont</td><td>RS-5015</td><td></td></tr><tr><td>9 Dressions Spot plate</td><td>PYREX</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100854-0100</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610440-0500</td><td>Samenstelling van 1x PBS-oplossing</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600445-0500</td><td>Samenstelling van 1x PBS-oplossing</td></tr><tr><td>Laboratory spatula</td><td>Fisher</td><td>14-375-10</td><td></td></tr><tr><td>Long forceps</td><td>R' DEER</td><td>RST-14</td><td></td></tr><tr><td>Microscope cover glass</td><td>CITOTEST</td><td>80340-1130</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>CITOTEST</td><td>80302-2104</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501727-0500</td><td>Samenstelling van 1x PBS-oplossing</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610476-0005</td><td>Samenstelling van 1x PBS-oplossing</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>Standard cornmeal/molasses/agar fly food</td><td></td><td></td><td>Tong Lab-made</td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.</td><td>10021418</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield antifade mounting medium with DAPI</td><td>Vectorlabratory</td><td>H-1200-10</td><td>Aanbevolen montagemedium</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vliegstammen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>y'w* Iso FRT19A</td><td></td><td></td><td>Tong Lab's vliegstammen</td></tr><tr><td>y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFP</td><td></td><td></td><td>Tong Lab's vliegstammen</td></tr><tr><td>y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFP</td><td></td><td></td><td>Tong Lab's vliegstammen</td></tr><tr><td>hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a</td><td></td><td></td><td>Tong Lab's vliegstammen</td></tr></tbody></table>

analyse van door uithongering geïnduceerde autofagie in het drosophila melanogaster larvale vetlichaam

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

Autofagie is een cellulair zelfverteringsproces. Het levert lading aan de lysosomen voor degradatie als reactie op verschillende spanningen, waaronder uithongering. De storing van autofagie wordt geassocieerd met veroudering en meerdere menselijke ziekten. De autofagiemachinerie is sterk geconserveerd - van gist tot mens. Het larvale vetlichaam van Drosophila melanogaster, een analoog voor gewervelde lever en vetweefsel, biedt een uniek model voor het monitoren van autofagie in vivo. Autofagie kan gemakkelijk worden geïnduceerd door uithongering van voedingsstoffen in het larvale vetlichaam. De meeste autofagie-gerelateerde genen worden bewaard in Drosophila. Er zijn veel transgene vliegenstammen ontwikkeld die gelabelde autofagiemarkers tot expressie brengen, wat de monitoring van verschillende stappen in het autofagieproces vergemakkelijkt. De klonale analyse maakt een nauwkeurige vergelijking mogelijk van autofagiemarkers in cellen met verschillende genotypen in hetzelfde stuk weefsel. Het huidige protocol beschrijft procedures voor (1) het genereren van somatische klonen in het larvale vetlichaam, (2) het induceren van autofagie via aminozuuruithongering en (3) het ontleden van het larvale vetlichaam, met als doel een model te creëren voor het analyseren van verschillen in autofagie met behulp van een autofagosoommarker (GFP-Atg8a) en klonale analyse.

Onder gevoede omstandigheden wordt het GFP-gelabelde ubiquitine-achtige eiwit, GFP-Atg8a, verspreid in de cellen. Bij uithongering vormt het groene puncta en labelt het autofagosomen. Zodra autofagosomen versmelten met lysosomen, wordt GFP geblust in de zure autolysosomen en verdwijnen de groene puncta. Als autofagie niet wordt geïnduceerd of de rijping van het autofagosoom wordt versneld, zal het aantal GFP-puncta naar verwachting laag zijn. Als de fusie tussen autofagosomen en lysosomen echter wordt geblokkeerd of als ...

Het huidige protocol beschrijft de inductie van autofagie in het Drosophila melanogaster larvaal vetlichaam via nutriëntendepletie en analyseert veranderingen in autofagie met behulp van transgene vliegenstammen.

Analyse van door uithongering geïnduceerde autofagie in het Drosophila melanogaster larvale vetlichaam

Autophagy is a cellular self-digestion process. It delivers cargo to the lysosomes for degradation in response to various stresses, including starvation. ...

Dit protocol beschrijft hoe autofagie in het Drosophila melanogaster larvaal vetlichaam kan worden geïnduceerd via aminozuurdepletie en hoe de verschillen in autofagie tussen gemuteerde klonen kunnen worden geanalyseerd. Omdat autofagie zeer gevoelig is voor de beschikbaarheid van voeding in kweekomstandigheden, heeft klonale analyse, een methode die mutante cellen versus wilde cellen in hetzelfde weefsel analyseert, een voordeel bij het ontleden van autofagiedefecten. Begin met het introduceren van drie mannetjes en 15 vrouwelijke volwassen vliegen in een kweekflacon met standaard maïsmeel of melasse of agar Drosophila media bij 25 graden Celsius om te paren.Tik 48 uur na inductie op de paringsflacon totdat de vliegen zijn verdoofd en op de media aan de basis van de injectieflacon vallen. Koppel de paringsflacon los en bedek de mond met een niet-aangesloten omgekeerde cultuurflacon met verse media. Draai vervolgens om en tik op de injectieflacons om de vliegen over te brengen naar de injectieflacon met verse cultuur.Sluit de injectieflacon met verse cultuur aan en gooi de oude injectieflacon weg. Plaats de injectieflacon met verse cultuur in een broedmachine van 25 graden Celsius voor het leggen van eieren op de verse media. Verwijder de vliegen na zes uur eieren leggen en gooi de vliegen weg door ze in een kolf met 75% ethanol te dumpen.Incubeer de injectieflacon met embryo's in een waterbad van 37 graden Celsius gedurende één uur om flippase-expressie te induceren. Plaats ze vervolgens in een couveuse van 25 graden Celsius en laat de embryo's zich verder ontwikkelen. Schep met behulp van een laboratoriumspatel de media met de zich ontwikkelende larven 75 uur na het leggen van het ei in een petrischaaltje.Voeg 1X PBS toe aan de schaal en scheid voorzichtig de kweekmedia en de larven met een lange tang. Selecteer vervolgens 10 tot 15 vroege derde instarlarven. Vul de putjes van een negen-well glazen depressie spotplaat met 1X PBS en plaats de gescheiden derde instar larven in de putjes met behulp van een lange tang.Was de larven grondig om alle mediaresten te verwijderen. Neem vijf milliliter 20% sucrose-oplossing in een lege injectieflacon en plaats de schone derde instarlarven in deze oplossing met een lange tang. Incubeer deze injectieflacon gedurende zes uur in een incubator van 25 graden Celsius voordat u ze oogst voor dissectie.Voeg 1X PBS toe aan elke put van de negen-well glazen depressie spotplaat en breng de larven over in de putten met een lange tang. Plaats één larve in een put met de dorsale kant naar boven gericht. Pak de cuticula van de larve vast met twee tangen van 5 in het midden van de larvale stam en scheur voorzichtig de nagelriemen open.De blootgestelde vetlichamen, samen met andere larvale interne weefsels, zullen nog steeds aan het karkas van de larve worden bevestigd. Trek voldoende om de inwendige organen zoveel mogelijk bloot te leggen. Herhaal deze stap voor alle larven.Breng het larvale karkas over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter met 500 microliter 4% PFA en incubeer gedurende 30 minuten bij 25 graden Celsius zonder de buizen te schudden. Pipetoneer na 30 minuten de PFA-oplossing. Voeg 500 microliter 1X PBS toe aan de buis.Schud de buis voorzichtig op een platte rotator gedurende 10 minuten en gooi vervolgens de 1X PBS-oplossing weg. Herhaal dit drie keer. Breng met een lange tang het vaste en gewassen larvale karkas over naar een put in de negen depressievlekplaat gevuld met 1X PBS.Verwijder alle niet-vette lichaamsweefsels met 5 tangen. Monteer ten slotte de stukjes van het vetlichaam op een microscoopglaasje met 80% glycerol als montagemedium en leg er een coverslip op. Mutant één en mutant twee zijn twee onafhankelijke dodelijke mutanten op het X-chromosoom en geïsogeniseerde geelwitte FRT 19A-vliegen dienen hier als controle.GFP-Atg8a-patronen werden geanalyseerd in de controle-, mutant één of mutant twee mozaïeklarvale vetlichamen, en de mutante klonen of controleklonen werden negatief gemarkeerd door RFP. In de controleklonen waren de patronen van GFP-Atg8a Puncta vergelijkbaar met die in de omringende RFP-positieve cellen. Bij mutant één mutant klonen waren de GFP-Atg8a Puncta sterk verminderd.En in mutant twee mutante klonen werden het aantal en de grootte van GFP-Atg8a Puncta verhoogd. Het ontwikkelingsstadium van de larven is hier van cruciaal belang. De tijd voor ontwikkeling en de duur van de honger moeten worden aangepast aan de recepten van het kweekmedium van elk laboratorium.Deze procedure kan worden toegepast om selectieve autofagie te onderzoeken. Mitofagie kan bijvoorbeeld worden gecontroleerd in vliegenvetlichamen door een fluorescerend eiwit te hechten aan een mitochondriale targetingsequentie.

analyzing-starvation-induced-autophagy-drosophila-melanogaster-larval

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De beperkende factor in het gebruik van de...

Single Drosophila Ommatidium Dissection en Imaging

We stellen robuuste biochemische en microscopische methoden voor het...

Biochemische en High Throughput microscopische beoordeling van Fat Mass in<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

De voeding circuit in Drosophila melanogaster larven serveert een eenvoudige maar krachtige model waarmee veranderingen in de voeding koers die moet worden gecorreleerd met veranderingen in de stomatogastric neurale circuits. Dit circuit bestaat uit centrale serotonerge neuronen die uitsteeksels aan de mond haken en de voordarm sturen.

Functionele analyse van de larvenvraat Circuit in Drosophila</i

Hier presenteren we een methode om organismal vetgehalte in het derde instar (L3) larvale stadium van Drosophila melanogaster gemeten. Deze methode maakt gebruik van de relatief lage dichtheid van vetweefsel om onderscheid te maken tussen de larven met gewijzigde vetreserves. Drijfvermogen gebaseerde analyse is een waardevol hulpmiddel voor snelle, reproduceerbare en economisch screening.

A-drijfvermogen gebaseerde methode voor het bepalen vetgehalte in<em&gt; Drosophila</em

Dit is een hoog vet dieet voeding protocol om zwaarlijvigheid in Drosophila, een model voor begrip fundamentele moleculaire mechanismen betrokken bij lipotoxicity. Het biedt ook een hoge doorvoersnelheid triglyceride assay voor het meten van vet accumulatie in Drosophila en mogelijk andere (insect) modellen onder verschillende voeding, milieu, genetische of fysiologische omstandigheden.

Hoog vet dieet voeding en High Throughput triglyceride test bij Drosophila Melanogaster

Presenteren we een protocol voor het meten van zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring in Drosophila melanogaster larvale en volwassen hersenen. Een metabole analyzer wordt gebruikt met een aangepast en geoptimaliseerd protocol. Micro-weefsel beperkingen werden zijn een essentieel onderdeel van dit protocol en ontworpen en gemaakt speciaal voor hun gebruik in deze analyse.

Metabole analyse van Drosophila melanogaster Larval en volwassen hersenen

Hebben we een eenvoudige en flexibele workflow om kwantitatieve gegevens extract van fluorescentie imaging-gebaseerde cel biologische studies van aggregatie van eiwitten en autophagic flux in het centrale zenuwstelsel van Drosophila modellen van neurodegeneratie.

Kwantitatieve celbiologie van neurodegeneratie in Drosophila door onbevooroordeelde analyse van Fluorescently Tagged eiwitten met behulp van ImageJ

Dit protocol beschrijft een in vivo fagocytose assay in volwassen Drosophila melanogaster te kwantificeren fagocytensysteem erkenning en goedkeuring van de microbiële infecties.

Beoordeling van de cellulaire immuunrespons van de fruitvlieg, Drosophila melanogaster, met behulp van een In Vivo fagocytose Assay

Hier wordt een protocol beschreven dat de colorimetrische kwantificering mogelijk maakt van de hoeveelheid voedsel die binnen een bepaald tijdsinterval wordt gegeten door Drosophila melanogasterlarven die worden blootgesteld aan diëten van verschillende macronutriëntenkwaliteit. Deze assays worden uitgevoerd in de context van een neuronaal thermogenetisch scherm.

Kwantificering van de inname van macronutriënten in een thermogenetisch neuronaal scherm met drosophilalarven

Gestimuleerde Raman scattering (SRS) microscopie maakt selectieve, labelvrije beeldvorming van specifieke chemische moieties mogelijk en het is effectief gebruikt om lipidemoleculen in vivo in beeld te brengen. Hier geven we een korte inleiding tot het principe van SRS-microscopie en beschrijven we methoden voor het gebruik ervan bij de opslag van beeldvormende lipiden in Caenorhabditis elegans.

Labelvrije beeldvorming van lipideopslagdynamiek bij Caenorhabditis elegans met behulp van gestimuleerde Raman-verstrooiingscopie

Dit protocol beschrijft een gedragstest voor het registreren van door suiker uitgelokt zoekgedrag met behulp van Drosophila melanogaster. De test kan worden gebruikt om voedings- en foerageergerelateerd gedrag te bestuderen, evenals de onderliggende neuronale mechanismen.

Volgen van door suiker uitgelokt lokaal zoekgedrag in Drosophila

Leer hoe u autofagie induceert in het larvale vetlichaam van Drosophila melanogaster door aminozuurdepletie en klonale verschillen analyseert met GFP-Atg8a-markering. Deze methode onthult genetische effecten op celhomeostase.

Analyse van door uithongering geïnduceerde autofagie in het Drosophila melanogaster larvale vetlichaam

Meer video's verkennen