Hybride celanalysesysteem om structurele en contractiele veranderingen van menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten te beoordelen voor preklinische cardiale risico-evaluatie

De methode kan helpen bij het beantwoorden van preklinische cardiale veiligheid en toxiciteit gerelateerde vragen met behulp van echte op mensen gebaseerde gegevens voor een veilige overgang van nieuwe kandidaat-geneesmiddelen naar klinische stadia. In plaats van een reeks verschillende in-vitro- en in-vivotechnieken te gebruiken, is het belangrijkste voordeel van dit hybride systeem de gelijktijdige beoordeling van van menselijke iPC afgeleide cardiomyocyten, elektrofysiologische en levensvatbaarheidsparameters en de analyse van contractiele eigenschappen onder fysiologische omstandigheden. Deze methode kan worden toegepast voor het ontdekken van geneesmiddelen, omdat het elektrofysiologische, structurele en contractiele veranderingen van cardiomyocyten en een systeem met een hogere doorvoer omvat dat het mogelijk maakt om 69 putten tegelijkertijd te testen.

Om te beginnen met het coaten van de plaat, laat u de onderkant van de contractieplaat bedekt door de extra meegeleverde membraanbescherming tot de meting in de contractiliteitsmodule. Bereid voor het zaaien van cardiomyocyten een verdunde EHS-gelcoatingoplossing door 2,75 milliliter EHS-gel kant-en-klare oplossing en 8,25 milliliter DPBS met calcium en magnesium in een steriele centrifugebuis over te brengen. Meng vervolgens de oplossing.

Verwijder de membraanbeschermer van de samentrekkingsplaat. Breng de voorbereide coatingoplossing over in een steriel reagensreservoir in de laboratoriumautomatiseringsrobot. Gebruik het programma, voeg 100 microliter toe met de laboratoriumautomatiseringsrobot en voeg 100 microliter van de coatingoplossing per put toe.

Plaats vervolgens het deksel terug op de 96-well plaat en incubeer gedurende drie uur bij 37 graden Celsius. Na het ontdooien en tellen van de cellen, pas de cellen in het aanbevolen platingmedium aan volgens de instructies van de celfabrikant, wat resulteert in 11 keer 10 tot de zesde cellen per 11 milliliter voor het zaaien van een volledige 96-well plaat. Gebruik het programma verwijder 100 microliter om de EHS-geloplossing uit de putten te verwijderen met de laboratoriumautomatiseringsrobot.

Breng vervolgens de 11 milliliter celsuspensie over in een steriel reagensreservoir dat in de laboratoriumautomatiseringsrobot is geplaatst en zaai de cellen met 100 microliter suspensie per put. Met behulp van het programma voegen cellen 100 microliter toe. Breng onmiddellijk na het zaaien van de cel de flexibele 96-well-plaat over in de vochtigheid gecontroleerde incubator bij 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide en laat de cellen een nacht bezinken.

Verwarm 22 milliliter cardiomyocytenonderhoudsmedium dat aan elke plaat moet worden toegevoegd tot 37 graden Celsius in een centrifugebuis van 50 milliliter. Breng het verse medium 18 tot 24 uur na het zaaien over in een steriel reagensreservoir en laat het naast de laboratoriumautomatiseringsrobot staan. Voer vervolgens mediumverwijdering uit met het programma, verwijder 100 microliter.

Plaats vervolgens het reagensreservoir met het verse medium in de laboratoriumautomatiseringsrobot en doseer 200 microliter van het verse medium per put met het programma, voeg 100 microliter toe. Voer deze stap twee keer uit om 200 microliter per put te bereiken. Breng onmiddellijk na mediumuitwisseling de plaat over in de incubator.

Voer om de dag een gemiddelde uitwisseling uit tot samengestelde toevoeging. Vier tot zes uur voor toevoeging van de verbinding voert u een laatste mediumverandering uit door 22 milliliter verse en warme testbuffer over te brengen in een steriel reagensreservoir en deze naast de laboratoriumautomatiseringsrobot te laten. Breng onmiddellijk na mediumuitwisseling de flexibele plaat terug in de incubator.

Breng de plaat een uur voor de nulmeting over naar het betreffende meetapparaat. Open in de besturingssoftware Protocol bewerken en selecteer de respectievelijke meetmodus, Flex Site of impedantie-EFP. Definieer de sweepduur of -lengte van één meting tot 30 seconden en een herhalingsinterval tot 10 minuten voordat u het protocolnummer opslaat.

Selecteer vervolgens Start Protocol en ga verder met het invullen van de gevraagde velden. Wanneer de parameters zijn ingesteld, selecteert u Meting starten. Voer minimaal drie nulmetingen uit in intervallen van vijf minuten kort voordat de samenstelling wordt toegevoegd.

Verwijder 50 microliter van de testbuffer uit elke put zonder de flexibele 96-wellsplaat uit het meetapparaat te verwijderen, gevolgd door de toevoeging van 50 microliter van de vier keer geconcentreerde samengestelde oplossing in elke put van de plaat volgens het meetplan. Selecteer na toevoeging van de samenstelling reagensmarkering toevoegen om de lay-out van de samengestelde plaat en het volume van de samengestelde oplossing te definiëren. Selecteer vervolgens Doorgaan met standaardmeting of doorgaan met meetreeks volgens het experimentele plan.

De representatieve analyse toont de effecten van kinaseremmer Erlotinib op de contractiliteit van van humane iPSC afgeleide cardiomyocyten. Bij de laagste concentratie induceerde Erlotinib een statistisch onbeduidende afname van de amplitude, terwijl micromolaire concentraties van Erlotinib tijd- en dosisafhankelijke cardiotoxische effecten vertoonden. Het begin van het effect werd waargenomen vanaf 96 uur met één micromolair Erlotinib, terwijl behandeling met 10 micromolair Erlotinib resulteerde in een significante afname 24 uur na toevoeging van de verbinding.

Na de toepassing van 10 micromolair epirubicine stopten de cellen binnen 24 uur met kloppen. Met de toepassing van één micromolair epirubicine werd een drastische afname van de amplitude na 24 uur gevolgd door volledige beat-stopzetting tot 48 uur. Bij 100 nanomolair werd een tijdsafhankelijke afname van de beatamplitude waargenomen.

Bij de laagste concentratie van 10 nanomolair fluctueerde de amplitude gestaag, wat bevestigt dat het effect van epirubicine alleen dosisafhankelijk was. De behandeling met Doxorubicine en Nifedipine gedurende 24 uur vermindert de levensvatbaarheid van de cel op een concentratie- en tijdsafhankelijke manier. Bij toepassing van toenemende Nifedipineconcentraties onthullen veldpotentiaalregistraties op cellen een concentratieafhankelijke verkorting van de genormaliseerde veldduur.

Nifedipinebeoordeling met betrekking tot cardiale contractiliteit toonde ook een significante concentratieafhankelijke amplitudeafname bij acute meting met 10 nanomolaire en 13 nanomolaire concentraties. Het is belangrijk om te onthouden dat de cellen over het algemeen gevoelig zijn voor omgevingsparameters zoals temperatuur- en pH-veranderingen, evenals mechanische simulatie die vooral wordt ondersteund op de contractieplaten.