Name: Gewijzigde experimentele omstandigheden voor lawaai-geïnduceerd gehoorverlies bij muizen en beoordeling van de gehoorfunctie en schade aan de buitenste haarcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Leer een gedetailleerd protocol voor lawaai-geïnduceerd gehoorverlies bij C57BL/6J muizen met ABR-metingen en analyse van buitenste haarcellen. Deze methode ondersteunt onderzoek naar gehoorbeschadiging.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken de subsidies van het ministerie van Wetenschap en Technologie (MOST) van de Taiwanese regering (MOST 110-2314-B-715-005, MOST 111-2314-B-715-009-MY3) en intramurale onderzoeksbeurzen van Mackay Medical College (MMC-RD-110-1B-P030, MMC-RD-111-CF-G002-03).

Dierproeven in deze studie werden goedgekeurd door de Animal Care Committee van Mackay Medical College. Acht weken oude mannelijke C57BL / 6J-muizen werden gekocht bij het National Laboratory Animal Center (New Taipei City, Taiwan). Alle muizen werden gefokt en gehuisvest volgens het standaard dierprotocol.
1. Inductie van NIHL bij muizen
<ol><li>Bereid de kooi voor op de experimentele muizen<ol><li>Gebruik hiervoor een rattenvalkooi met afmetingen van 14 cm × 17 cm × 24 cm. Snijd vier stukken golfplaten in de juiste maten, zodat ze in de kooi passen (13 cm × 23 cm en 13 cm × 16 cm).</li>
		<li>Om te voorkomen dat de muizen hun voeten door het gaasrooster laten snijden, plaatst u twee van de stukken respectievelijk aan de onderkant en aan de achterkant. Plaats de andere twee stukken loodrecht op elkaar, om de ruimte in de kooi in vieren te verdelen.</li>
	</ol></li>
	<li>Voer dit onderzoek uit in een geluiddichte doos. Plaats een luidspreker 8,5 cm voor de kooi en plaats zowel de luidspreker als de kooi in een geluiddichte doos.</li>
	<li>Open de CLIO-toepassingssoftware</li>
	<li>Verplaats de cursor naar het luidsprekerpictogram en klik vervolgens op TwoSin. Voer de waarde van Freq 1 tot 1000 Hz, Freq 2 tot 6000 Hz in en wijzig deze en klik op OK om het geluid af te spelen.</li>
	<li>Wijzig op het tabblad Leq dBV in dBSPL. Nadat u de tijd op de software-interface hebt ingesteld, klikt u op de groene driehoekknop om het geluid af te spelen.</li>
	<li>Plaats een microfoon voor de luidspreker op een afstand van 8,5 cm om het geluidsniveau te kalibreren (zie Aanvullend dossier 1). Stel het geluidsniveau in op 125 dB SPL-A en monitor continu gedurende maar liefst 3 minuten om ervoor te zorgen dat het geluidsniveau voldoende stabiel is. Gebruik een generator, een analyzer en een versterker om de ruis te creëren en te regelen. (Figuur 1) OPMERKING: Voer deze stap uit in een geluiddichte doos om schade aan het gehoor van de operator te voorkomen.</li>
	<li>Plaats vier mannelijke C57BL/6J-muizen in de kooi (één voor elk kwartaal) voor blootstelling aan lawaai. Wijs de muizen willekeurig toe in elk kwartaal tijdens de blootstelling aan lawaai. Plaats een microfoon op de bovenkant van de kooi om het geluidsniveau tijdens de blootstelling aan lawaai te controleren (figuur 2). OPMERKING: Voer deze stap uit in een geluiddichte doos om schade aan het gehoor van de operator te voorkomen.</li>
	<li>Stel de muizen bloot aan het geluid met frequenties van 1 kHz en 6 kHz continu gedurende 6 uur per dag, gedurende 5 opeenvolgende dagen.</li>
	<li>Meet de gehoordrempels van de muizen 1 dag na de blootstelling aan lawaai (d.w.z. op de 6e dag) door de ABR te meten. Herhaal deze ABR-metingen opnieuw 1 week na de blootstelling aan lawaai (d.w.z. op de13e dag). Offer na de ABR-metingen alle betrokken muizen op en oogst hun slakkenhuis (figuur 3).</li>
</ol>2. Auditieve hersenstamrespons (ABR)-gebaseerde beoordeling van de gehoordrempel
<ol><li>Gebruik een commercieel ABR-testsysteem dat speciaal is ontworpen voor kleine dieren10.</li>
	<li>Injecteer intraperitoneaal een mengsel van tiletamine en zolazepam (40 mg / kg) en xylazine (9,3 mg / kg) in de muizen voor algemene anesthesie. OPMERKING: ABR-beoordeling duurt ~ 2 uur. Zorg ervoor dat u thermische ondersteuning biedt via een verwarmingskussen en breng oogzalf aan om uitdroging te voorkomen terwijl de muis onder narcose is.</li>
	<li>Meet de ABR in de muis onder algemene anesthesie. Plaats subdermale naaldelektroden (12 mm) op de hoekpunt, achter de pinna van het linkeroor en terug in de buurt van de staart om de gehoordrempel te meten.</li>
	<li>Presenteer akoestische stimuli met behulp van een luidspreker die op 1 cm van het linkeroor van het dier is geplaatst.</li>
	<li>Gebruik een oscilloscoop om de akoestische prikkels te regelen. Kies sinusgolf voor de prikkels en 10 k voor de vensterschaal. Draai aan de Frequentieknop om de gewenste frequentie van de akoestische prikkels te verkrijgen.</li>
	<li>Pas de stimulusintensiteit aan door aan de AMLP-knop op de functiegenerator te draaien. Verkrijg de gewenste stimulusintensiteit door de AMLP-knop op een geschikte spanning te draaien, berekend op basis van kalibratie.</li>
	<li>Verzamel de ABR-metingen onder een reeks stimulusintensiteiten, van 10 dB SPL tot 100 dB SPL, met een stapgrootte van 10 dB. OPMERKING: Meet de gehoordrempel in een geluiddichte doos. Het minimale stimulusintensiteitsniveau dat aanleiding zou kunnen geven tot een waarneembare Golf V in het verzamelde signaal werd verondersteld de ABR-drempel10,11 te zijn (figuur 4). Controleer het dier na de ABR-beoordeling totdat het herstelt van de anesthesie (~ 1 uur).</li>
</ol>3. Microscopisch onderzoek
<ol><li>Fixeren van het geoogste weefsel<ol><li>Offer na de ABR-metingen de muis op door intraperitoneaal een mengsel van tiletamine en zolazepam (100 mg/kg) en xylazine (23,25 mg/kg) te injecteren voor het microscopisch onderzoek.</li>
		<li>Oogst de slakkenhuizen van de muis en dompel ze onmiddellijk onder in 10% formaldehyde (FA) voor fixatie (twee slakkenhuis/ml) gedurende ten minste 8 uur bij 4 °C.</li>
		<li>Vervang na fixatie de FA-oplossing door een 10% ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA)-oplossing voor ontkalking gedurende 3-4 dagen bij 4 °C. Controleer vervolgens elk slakkenhuis met een pincet om te bevestigen dat de slakkenhuizen voldoende zijn verzacht.</li>
		<li>Plaats het slakkenhuis in een petrischaaltje gevuld met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en snijd het spiraalvormige orgaan van Corti (OC) (elk ontkalkt slakkenhuis) in drie secties - de basale draai, middelste draai en apicale draai - voor weefselkleuring.</li>
		<li>Verwijder onder een ontleedmicroscoop (vergroting: 8x-35x) de benige structuren (scala vestibuli, scala tympani en modiolus) van het ontkalkte slakkenhuis en verkrijg het zachte weefsel, inclusief de OC (dikte: ongeveer 40 μm).</li>
	</ol></li>
	<li>Cochlea immunofluorescentie kleuring<ol><li>Bereiding van de blokkeringsbuffer: Bereid 2% runderserumalbumine (BSA) en 0,2% Triton X-100-oplossingen in PBS.</li>
		<li>Breng het te kleuren weefsel over van de petrischaal naar een microcentrifugebuis en dompel het weefsel gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (RT) onder in 0,1 ml van de blokkerende buffer.</li>
		<li>Bereiding van de Myo7A primaire antilichaambuffer: Verdun het primaire myo7A-antilichaam in de blokkeringsbuffer met een volumeverhouding van 1:200.</li>
		<li>Behandel het weefsel in de microcentrifugebuis met 100 μL Myo7A primaire antilichaambuffer gedurende 2 uur bij RT.</li>
		<li>Spoel het weefsel drie keer in PBS gedurende 5 minuten elk.</li>
		<li>Bereiding van het Myo7A secundaire antilichaam (Myo7A-Rb-488) en falloïdine antilichaam (falloïdin-594) buffer: Verdun Myo7A secundair antilichaam (1:400) en falloidine antilichaam (1:200) in de blokkerende buffer.</li>
		<li>Behandel het weefsel met 100 μL Myo7A secundair antilichaam en falloidine antilichaambuffer gedurende 2 uur bij RT.</li>
		<li>Na behandeling met antilichaam + falloidine-antilichaam, spoel het weefsel in PBS drie keer, gedurende 5 minuten elk.</li>
		<li>Breng het gespoelde weefsel van de microcentrifugebuis over in een petrischaal gevuld met PBS met behulp van een plastic transferpipet van 1 ml met een gesneden punt.</li>
		<li>Om u voor te bereiden op het microscopisch onderzoek, vouwt u het weefsel open, plaatst u het op een glazen dia en voegt u 15 μL 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) fluoromount-medium toe aan het weefsel om het volledig te bedekken. Plaats een glazen afdekplaat voorzichtig over het weefsel. Laat de dia een nacht bij RT staan voordat je hem afsluit met nagellak.</li>
	</ol></li>
	<li>Beeldacquisitie<ol><li>Verkrijg 2D-beelden met behulp van een rechtopstaande fluorescentiemicroscoop en beeldacquisitiesoftware.</li>
		<li>Voordat u het microscopisch onderzoek uitvoert, centreert u het weefsel in het gezichtsveld en past u de gevoeligheid aan ISO 100 aan. Pas de belichtingstijd in eerste instantie aan door op de knop Automatische modus van de software te klikken en pas vervolgens handmatig af door op de knop Aanpassen te klikken om de signaal-ruisverhouding te optimaliseren.</li>
		<li>Pas de golflengte van het invallende licht aan om de fluoroforen te prikkelen door de fluorescentiekubus te draaien. Pseudokleuren werden gebruikt om de emissie van verschillende fluorescerende labels te markeren (blauw licht: DAPI; groen licht: Myo7A; rood licht: falloïdine).</li>
		<li>Door het weefselmonster te scannen, genereert en verzamelt u de beeldgegevens als .tif en .jpg beeldbestanden.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>World Report on Hearing. World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/publications/i/item/9789240020481">https://www.who.int/publications/i/item/9789240020481</a> (2021).</li>
<li>Fernandez, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+cochlear+synaptopathy+with+and+without+sensory+cell+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Noise-induced cochlear synaptopathy with and without sensory cell loss.</a> Neuroscience. 427, 43-57 (2020).</li>
<li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+insult+to+injury%3A+cochlear+nerve+degeneration+after+%26%2334%3Btemporary%26%2334%3B+noise-induced+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after &#34;temporary&#34; noise-induced hearing loss.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+X-linked+inhibitor+of+apoptosis+protein+protects+against+noise-induced+hearing+loss+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Overexpression of X-linked inhibitor of apoptosis protein protects against noise-induced hearing loss in mice.</a> Gene Therapy. 18 (6), 560-568 (2011).</li>
<li>Takeda, S., Mannström, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+aging+and+noise+exposure+on+auditory+brainstem+responses+and+number+of+presynaptic+ribbons+in+inner+hair+cells+of+C57BL%2F6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Effects of aging and noise exposure on auditory brainstem responses and number of presynaptic ribbons in inner hair cells of C57BL/6J mice.</a> Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).</li>
<li>Rouse, S. L., Matthews, I. R., Li, J., Sherr, E. H., Chan, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+stress+response+inhibition+provides+sex-dependent+protection+against+noise-induced+cochlear+synaptopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Integrated stress response inhibition provides sex-dependent protection against noise-induced cochlear synaptopathy.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18063(2020).</li>
<li>Amanipour, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+hearing+loss+in+mice%3A+Effects+of+high+and+low+levels+of+noise+trauma+in+CBA+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+International+Conference+of+the+IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Society%22%5BJournal%5D)">Noise-induced hearing loss in mice: Effects of high and low levels of noise trauma in CBA mice.</a> Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2018, 1210-1213 (2018).</li>
<li>Edderkaoui, B., Sargsyan, L., Hetrick, A., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+duffy+antigen+receptor+for+chemokines+ameliorated+cochlear+damage+from+noise+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Deficiency of duffy antigen receptor for chemokines ameliorated cochlear damage from noise exposure.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 173(2018).</li>
<li>Hultcrantz, M., Simonoska, R., Stenberg, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+and+hearing%3A+a+summary+of+recent+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Oto-laryngologica%22%5BJournal%5D)">Estrogen and hearing: a summary of recent investigations.</a> Acta Oto-laryngologica. 126 (1), 10-14 (2006).</li>
<li>Tsai, S. C. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intravenous+administration+of+skin-derived+mesenchymal+stem+cells+ameliorates+hearing+loss+and+preserves+cochlear+hair+cells+in+cisplatin-injected+mice%3A+SMSCs+ameliorate+hearing+loss+and+preserve+outer+hair+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">The intravenous administration of skin-derived mesenchymal stem cells ameliorates hearing loss and preserves cochlear hair cells in cisplatin-injected mice: SMSCs ameliorate hearing loss and preserve outer hair cells in mice.</a> Hearing Research. 413, 108254(2022).</li>
<li>Choi, M. Y., Yeo, S. W., Park, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hearing+restoration+in+a+deaf+animal+model+with+intravenous+transplantation+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+human+umbilical+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Hearing restoration in a deaf animal model with intravenous transplantation of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 427 (3), 629-636 (2012).</li>
<li>Yu, S. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+functional+evaluation+of+ribbon+synapses+at+specific+frequency+regions+of+the+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Morphological and functional evaluation of ribbon synapses at specific frequency regions of the mouse cochlea.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59189(2019).</li>
</ol>

Geen belangenverstrengeling openbaar te maken.

NIHL kan worden onderverdeeld in twee typen: tijdelijke NIHL, die een tijdelijke verschuiving van de gehoordrempel laat zien, en permanente NIHL, die wordt gekenmerkt door een permanente gehoordrempelverschuiving. Het gehoorverlies dat we op de 6e dag (1 dag na de blootstelling aan lawaai) hebben waargenomen, wordt verondersteld een combinatie van deze twee typen te zijn. In dit geval zou de gehoordrempel in de loop van de tijd een geleidelijk herstel vertonen als gevolg van de temporele component van gehoorve...

Ongeveer 1,3 miljard mensen wereldwijd lijden aan gehoorverlies als gevolg van blootstelling aan lawaai1. In deze studie wilden we een duidelijk stapsgewijs proces opzetten voor het induceren en bevestigen van lawaaigeïnduceerd gehoorverlies (NIHL). NIHL is het gevolg van een degeneratie/vernietiging van de haarcellen (HC's) en spiraalvormige ganglionneuronen (SGN's), schade in de HC-stereocilia en/of verlies van synapsen tussen de cochleaire binnenste HC's en SGN's. Dergelijke afwijkingen kunnen naast NIHL ook tinnitus en verminderde spraakperceptie veroorzaken (vooral in een complexe akoestische omgeving). Sociale, psychologische en cognitieve functies kunnen achtereenvolgens worden beïnvloed door deze fysiologische tekortkomingen 2,3,4,5,6.
In NIHL-gerelateerde preklinische studies op basis van muizen zijn de meest populaire muizenstammen CBA / CaJ 2,3,6,7 en C57BL / 6 4,5,8. De mannelijke 3,4,7 muizen worden bovendien vaker gebruikt dan de vrouwelijke, omdat oestrogeen een beschermend effect heeft op het gehoor. Daarom gebruikten we in deze studie alleen mannelijke muizen9. Na verwijzing naar de literatuur kozen we 1 kHz en 6 kHz als de frequenties van de toegepaste ruis. De intensiteit van het toegepaste geluid was 115 dB SPL-A (rondom de kooi) tot 125 dB SPL-A (in het midden van de kooi). Na blootstelling van de experimentele muizen aan het geluid continu gedurende 6 uur per dag, gedurende 5 opeenvolgende dagen, gaf een optimale toename van de gehoordrempel aan dat een optimale mate van NIHL werd gegenereerd in de experimentele muizen. De handelingen voor het hanteren van de dieren, het bouwen van de experimentele opstelling en het induceren van geluid worden allemaal duidelijk stap voor stap beschreven in het meegeleverde protocol.

<table><tbody><tr><td>&nbsp;1/4" CCP Free-field Standard Microphone Set</td><td>GRAS</td><td>428158</td><td>Voor geluidsbelasting</td></tr><tr><td>Amplifier Input Module, AMI100D</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>Voor auditieve stamhersenreactie</td></tr><tr><td>Bio-amplifier, BIO100C</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>Voor auditieve stamhersenreactie</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>SIGMA</td><td>A9647</td><td>Immunofluorescencekleuring</td></tr><tr><td>Cellsens software</td><td>Olympus life science</td><td></td><td>Beeldverwerving</td></tr><tr><td>Gegolfd plastic</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI fluoromount</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td>Immunofluorescencekleuring</td></tr><tr><td>Ethyleendiaminetetraazijnzuur</td><td>SIGMA</td><td>E5134</td><td>Decalcificatie</td></tr><tr><td>Evoked Response Amplifier, ERS100C</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>Voor auditieve stamhersenreactie</td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>APLHA</td><td>F030410</td><td>Fixatie van cochlea</td></tr><tr><td>High Performance Data Acquisition System, MP160</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>Voor auditieve stamhersenreactie</td></tr><tr><td>Modular Extension Cable, MEC110C</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>Voor auditieve stamhersenreactie</td></tr><tr><td>Myo7A primaire antistof</td><td>Proteus</td><td>25-6790</td><td>Immunofluorescencekleuring</td></tr><tr><td>Myo7A secundaire antistof</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>711-545-152</td><td>Immunofluorescencekleuring</td></tr><tr><td>Naaldelectroden, unipolaire 12 mmTp, EL452</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>Voor auditieve stamhersenreactie</td></tr><tr><td>phalloidin antistof</td><td>Alexa Fluor</td><td>A12381</td><td>Immunofluorescencekleuring</td></tr><tr><td>fosfaatgedempte zoutoplossing</td><td>SIGMA</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Rattenval</td><td></td><td></td><td>14 cm x 17 cm x 24cm</td></tr><tr><td>ROMPUN- xylazine-injectie, oplossing&nbsp;</td><td>Bayer HealthCare, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Geluidsversterker, MT-1000</td><td>unika</td><td></td><td>Voor geluidsbelasting</td></tr><tr><td>Geluidsgenerator/analyser/divers, FW-02</td><td>CLIO</td><td>620300719</td><td>Voor geluidsbelasting</td></tr><tr><td>Geluiddichte kamer</td><td>IEA Electro-Acoustic Technology</td><td></td><td>Voor geluidsbelasting en ABR</td></tr><tr><td>Luidspreker&nbsp;</td><td>IEA Electro-Acoustic Technology</td><td></td><td>Voor geluidsbelasting</td></tr><tr><td>Stimulator Module, STM100C</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>Voor auditieve stamhersenreactie</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA</td><td>T8787</td><td>Immunofluorescencekleuring</td></tr><tr><td>Tubephone Set, OUT101</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>Voor auditieve stamhersenreactie</td></tr><tr><td>Staande microscoop, BX53</td><td>Olympus</td><td></td><td>Beeldverwerving</td></tr><tr><td>Zoletil</td><td>Virbac</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

gewijzigde experimentele omstandigheden voor lawaai-geïnduceerd gehoorverlies bij muizen en beoordeling van de gehoorfunctie en schade aan de buitenste haarcellen

Modified Experimental Conditions for Noise-Induced Hearing Loss in Mice and Assessment of Hearing Function and Outer Hair Cell Damage

Een diermodel van lawaai-geïnduceerd gehoorverlies (NIHL) is nuttig voor pathologen, therapeuten, farmacologen en gehooronderzoekers om het mechanisme van NIHL grondig te begrijpen en vervolgens de bijbehorende behandelingsstrategieën te optimaliseren. Deze studie heeft tot doel een verbeterd protocol te creëren voor het ontwikkelen van een muismodel van NIHL. Mannelijke C57BL/6J muizen werden gebruikt in deze studie. Onverdoofde muizen werden blootgesteld aan harde geluiden (1 en 6 kHz, gelijktijdig gepresenteerd bij 115-125 dB SPL-A) continu gedurende 6 uur per dag gedurende 5 opeenvolgende dagen. De auditieve functie werd 1 dag en 1 week na blootstelling aan lawaai beoordeeld met behulp van auditieve hersenstamrespons (ABR). Na de ABR-meting werden de muizen opgeofferd en werden hun organen van Corti verzameld voor immunofluorescentiekleuring. Uit de metingen van de auditieve hersenstamrespons (ABR) werd 1 dag na blootstelling aan lawaai significant gehoorverlies waargenomen. Na 1 week daalden de gehoordrempels van de experimentele muizen tot ~80 dB SPL, wat nog steeds een significant hoger niveau was dan de controlemuizen (~40 dB SPL). Uit de resultaten van immunofluorescentiebeeldvorming bleek dat buitenste haarcellen (OHC's) beschadigd waren. Samenvattend hebben we een model van NIHL gemaakt met mannelijke C57BL / 6J-muizen. Een nieuw en eenvoudig apparaat voor het genereren en leveren van zuivere toonruis werd ontwikkeld en vervolgens gebruikt. Kwantitatieve metingen van gehoordrempels en morfologische bevestiging van OHC-schade toonden beide aan dat het toegepaste geluid met succes een verwacht gehoorverlies veroorzaakte.

Een verschuiving in de ABR-gehoordrempel De gehoordrempel van de muizen werd gemeten met behulp van tone-burst ABR 1 dag of 1 week na de blootstelling aan lawaai. Een significante toename van de gehoordrempel bij alle drie de geteste frequenties werd waargenomen (12 kHz: 84,29 ± 2,77 dB SPL; 24 kHz: 91,43 ± 0,92 dB SPL; 32 kHz: 98,57 ± 1,43 dB SPL) 1 dag na de blootstelling aan lawaai (d.w.z. de6e dag). Gedeeltelijk gehoorherstel trad 1 week na de blootstelling aan lawaai op (d.w.z. de...

Hier presenteren we een protocol voor een muismodel van lawaai-geïnduceerd gehoorverlies (NIHL). Om NIHL te induceren, ontwikkelden we een nieuw en eenvoudig apparaat met golfkarton, een rattenvangkooi en een luidspreker. Auditieve hersenstamrespons en immunofluorescentie beeldvorming werden gebruikt om respectievelijk de gehoorfunctie en de buitenste haarcelbeschadiging te beoordelen.

Gewijzigde experimentele omstandigheden voor lawaai-geïnduceerd gehoorverlies bij muizen en beoordeling van de gehoorfunctie en schade aan de buitenste haarcellen

An animal model of noise-induced hearing loss (NIHL) is useful for pathologists, therapists, pharmacologists, and hearing researchers to thoroughly ...

Hoewel er studies zijn geweest naar lawaai-geïnduceerd gehoorverlies, heeft geen enkele de methode zo gedetailleerd vastgelegd, waardoor dit een belangrijke procedure is. Deze methode veroorzaakte effectief lawaaigeïnduceerd gehoorverlies bij muizen en observeert de werkelijke veranderingen in de gehoordrempel door ABR. Een diermodel van lawaai-geïnduceerd gehoorverlies is nuttig voor wetenschappers om het mechanisme van lawaai-geïnduceerd gehoorverlies grondig te begrijpen en vervolgens de bijbehorende behandelingsstrategieën te optimaliseren.De procedure wordt gedemonstreerd door Dian-Shiue Lee, een zeer getalenteerde student uit mijn laboratorium. Om de kooi voor te bereiden op de experimentele muizen, gebruikt u een rattenvalkooi en snijdt u vier stukken golfplaten in de juiste maten, zodat ze in de kooi passen. Om te voorkomen dat de muizen hun voeten door het gaasrooster laten snijden, plaatst u twee van de stukken respectievelijk aan de onderkant en aan de achterkant.Plaats de andere twee stukken loodrecht op elkaar, om de ruimte in de kooi in vieren te verdelen Open de CLIO-toepassingssoftware. Verplaats de cursor naar het luidsprekerpictogram en klik op TwoSin. Voer de waarde van Frequentie 1 in 1, 000 hertz, Frequentie 2 tot 6, 000 hertz in en wijzig deze en klik op OK om het geluid af te spelen.Wijzig op het tabblad Leq dBV in dBSPL. Nadat u de tijd op de software-interface hebt ingesteld, klikt u op de groene driehoekknop om het geluid af te spelen. Plaats een microfoon voor de luidspreker op een afstand van 8,5 centimeter om het geluidsniveau te kalibreren.Stel het geluidsniveau in op 125 decibel SPL-A en controleer gedurende ten minste drie minuten continu om ervoor te zorgen dat het geluidsniveau voldoende gestabiliseerd is. Gebruik een generator, een analyzer en een versterker om de ruis te creëren en te regelen. Plaats vier mannelijke C57 zwarte 6J-muizen in de kooi, één voor elk kwartaal, voor blootstelling aan lawaai.Wijs de muizen willekeurig toe aan elk kwartaal tijdens de blootstelling aan lawaai. Plaats een microfoon op de bovenkant van de kooi om het geluidsniveau tijdens de blootstelling aan lawaai te controleren. Plaats de kooi voor de luidspreker in een geluiddichte doos en zorg ervoor dat de luidspreker op 8,5 centimeter afstand van de kooi is geplaatst.Stel de muizen bloot aan het geluid met frequenties van één kilohertz en zes kilohertz continu gedurende zes uur per dag, gedurende vijf opeenvolgende dagen. Meet de gehoordrempels van de muizen op de 6e en 13e dag door de ABR te meten. Gebruik een commercieel ABR-testsysteem, speciaal ontworpen voor kleine dieren voor ABR-metingen, en houd het dier onder algemene anesthesie.Plaats 12 millimeter subdermale naaldelektroden op het hoekpunt achter de pinna van het linkeroor en terug in de buurt van de staart om de gehoordrempel te meten. Nadat u de luidspreker op een centimeter afstand van het linkeroor van het dier hebt geplaatst, presenteert u akoestische stimuli met behulp van de luidspreker. Kies sinusgolf voor de stimuli en 10 k voor de vensterschaal.Draai aan de frequentieknop om de gewenste frequentie van de akoestische prikkels te verkrijgen. Pas de stimulusintensiteit aan door aan de AMLP-knop op de functiegenerator te draaien. Verkrijg de gewenste stimulusintensiteit door de AMLP-knop op een geschikte spanning te draaien die is berekend op basis van kalibratie.Verzamel de ABR-metingen onder een reeks stimulusintensiteiten van 10 tot 100 decibel SPL, met een stapgrootte van 10 decibel. Markeer het minimale stimulusintensiteitsniveau dat aanleiding kan geven tot een waarneembare Golf V als de ABR-drempel. Offer de muizen op na ABR-metingen en oogst het slakkenhuis van de geëuthanaseerde muizen.Onmiddellijk na het oogsten van de weefsels, dompel ze onder in 10% formaldehyde voor fixatie en laat ze minstens acht uur rusten bij vier graden Celsius. Gebruik EDTA voor ontkalking, zoals beschreven in de tekst. Leg het slakkenhuis in een petrischaaltje gevuld met PBS.Voor weefselkleuring snijdt u het spiraalvormige orgaan van Corti, of OC, in drie secties: de basale draai, middelste draai en apicale draai. Verwijder onder een ontleedmicroscoop met een vergroting van 8x tot 35x de benige structuren die scala vestibuli, scala tympani en modiolus van de ontkalkte cochleae omvatten en verkrijg de zachte weefsels, waaronder de OC. Een significante toename van de gehoordrempel werd waargenomen bij 12 kilohertz, 24 kilohertz en 32 kilohertz één dag na de blootstelling aan lawaai. Gedeeltelijk gehoorherstel trad een week na de blootstelling aan lawaai op, maar de gehoordrempels waren nog steeds verhoogd met meer dan 30 decibel op alle frequenties in vergelijking met de controlegroepen.In dit onderzoek was het gehoor meer beschadigd bij hoge frequenties. Een significant verschil werd waargenomen in de gehoordrempel tussen de controle- en experimentele groepen op zowel de 6e als de 13e dag, bij 12 kilohertz en 32 kilohertz. Een verlies van buitenste haarcellen werd consequent waargenomen in de microscopische beelden verkregen van de NIHL-muizen, vergeleken met die van de controlemuizen.Terwijl de binnenste haarcellen intact bleven in alle afbeeldingen, waren de buitenste haarcellen in de basale en middelste bochten van de OC ernstig beschadigd. Daarentegen waren de buitenste haarcellen in de apicale draai bijna intact. De belangrijkste stap in dit protocol omvat blootstelling aan lawaai, ABI-meting, het oogsten van het slakkenhuis.Deze procedure kan worden toegepast om het effect van blootstelling aan lawaai bij verschillende frequenties op gehoorverlies te onderzoeken door verschillende soorten geluid te gebruiken.

modified-experimental-conditions-for-noise-induced-hearing-loss-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een snelle en goedkope methode voor de gedrags-bepaling van het horen van parameters zoals gehoordrempels, gehoorproblemen of fantoom perceptie (subjectieve tinnitus) wordt beschreven. Het gebruikt pre-puls remming van de akoestische schrikreactie en kan gemakkelijk worden geïmplementeerd in een personal computer met een programmeerbare AD / DA-omzetter en een piezo sensor.

Een Low Cost Setup voor Behavioral Audiometrie in Knaagdieren

This video demonstrates a method for evaluating ribbon synapses in specific regions of the mouse cochlea. It utilizes immunostaining and confocal imaging techniques to identify functional synapses across different frequency regions in each cochlear turn.

Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of Mouse Cochlea

Source: Lee, D. et. al., Modified Experimental Conditions for Noise-Induced Hearing Loss in Mice and Assessment of Hearing Function and Outer Hair Cell Damage. J. Vis. Exp. (2023)This video demonstrates the procedure of noise-induced hearing loss in mice. High-volume sound damages hair cells in the inner ear and disrupts auditory pathways, resulting in hearing impairment.

Inducing Hearing Loss in Mice Through Prolonged High-Volume Sound Exposure 

Source: Lee, D., et. al. Modified Experimental Conditions for Noise-Induced Hearing Loss in Mice and Assessment of Hearing Function and Outer Hair Cell Damage. J. Vis. Exp. (2023)This video demonstrates the measurement of auditory brainstem response (ABR) in a mouse. Electrodes are placed on the head, behind the ear, and near the tail of an anesthetized mouse. Acoustic stimuli at various intensities are delivered, and electric signals generated are recorded as waveforms.

Measuring the Auditory Brainstem Response in Mice

De beschreven postauriculaire chirurgische benadering maakt een snelle en directe toediening mogelijk in de scala tympani van de muizencochlea, terwijl bloedverlies en sterfte bij dieren wordt geminimaliseerd. Deze methode kan worden gebruikt voor cochleaire therapie met behulp van moleculaire, farmacologische en virale toediening aan postnatale muizen via het ronde venmembraan.

Chirurgische methode voor viraal gemedieerde Gene Levering aan de Mouse Inner Ear door het ronde venster membraan

Er bestaan verschillende methoden voor het introduceren van ototoxische middelen in de slakken van diermodellen. Hier wordt een chirurgisch protocol gepresenteerd voor het toedienen van ototoxische middelen in de ronde venster nis. De procedure is betrouwbaar, creëert gerichte intra-cochleaire laesies en voorkomt mechanische schade aan de microarchitectuur. Onderzoek naar zelfherstel/regeneratie van de cochlea is mogelijk.

De muis Round-window aanpak voor Ototoxische Agent Levering: een snelle en betrouwbare techniek voor het induceren van Cochlear celdegeneratie

Twee microchirurgiebenaderingen voor lokale medicijntoediening aan het binnenoor worden hier beschreven en vergeleken in termen van impact op gehoorparameters, cochleaire cytoarchitectuur en expressie van inflammatoire markers.

Een vergelijkende studie van Drug Delivery Methoden Gericht op de Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection

Dierlijke modellen van cochleaire implantaten kunnen vooraf kennis van de technologische grondslagen voor de behandeling van permanente perceptief gehoorverlies met elektrische stimulatie. Deze studie geeft een chirurgische protocol voor acute oorverdovend en cochleaire implantatie van een elektrodenserie in muizen, alsmede de beoordeling van de functionele met auditieve brainstem response.

Cochleair implantaatchirurgie en elektrisch opgeroepen auditieve Brainstem Response opnamen in C57BL/6 muizen

Dit manuscript beschrijft een experimenteel protocol voor het evalueren van de morfologische kenmerken en functionele status van het lint synapsen in normale muizen. Het huidige model is ook geschikt voor door lawaai geïnduceerde en leeftijdsgebonden cochlear synaptopathy-beperkte modellen. De correlatieve resultaten van eerdere muizen studies worden ook besproken.

Morfologische en functionele evaluatie van het lint synapsen op specifieke frequentiegebieden van de muis cochlea

Hersenstam Evoked Response audiometrie is een belangrijk hulpmiddel in de klinische neurofysiologie. Tegenwoordig is Brain stem Evoked Response audiometrie ook toegepast in de basiswetenschap en preklinische studies waarbij zowel farmacologische als genetische diermodellen betrokken zijn. Hier geven we een gedetailleerde beschrijving van hoe auditieve hersenstam reacties met succes kunnen worden opgenomen en geanalyseerd in muizen.

Data-acquisitie en analyse in hersenstam evoked respons-Audiometrie bij muizen

Dit artikel presenteert een gemodificeerde cochleaire oppervlakte bereidingsmethode die de decalcificatie en het gebruik van een cel en weefsellijm vereist om de stukjes cochleaire epitheel te hechten aan 10 mm ronde afdek stroken voor immunohistochemie in volwassen muis cochleae.

Cochleaire oppervlakte voorbereiding in de volwassen muis

Leer een gedetailleerd protocol voor lawaai-geïnduceerd gehoorverlies bij C57BL/6J muizen met ABR-metingen en analyse van buitenste haarcellen. Deze methode ondersteunt onderzoek naar gehoorbeschadiging.

Gewijzigde experimentele omstandigheden voor lawaai-geïnduceerd gehoorverlies bij muizen en beoordeling van de gehoorfunctie en schade aan de buitenste haarcellen (Video) | JoVE Journal

Gewijzigde experimentele omstandigheden voor lawaai-geïnduceerd gehoorverlies bij muizen en beoordeling van de gehoorfunctie en schade aan de buitenste haarcellen

Meer video's verkennen