Efficiënte transfectie van in vitro getranscribeerd mRNA in gekweekte cellen met behulp van peptide-poloxamine nanodeeltjes

Peptide-poloxamine nanodeeltjes is een van de potentiële pulmonale mRNA-afgiftesystemen. Ons protocol maakt de peptide-poloxamine nanodeeltjes met een hogere productiviteit en efficiëntie, wat de ontwikkeling van het mucosale mRNA-vaccin vergemakkelijkt. De materialen die nodig zijn voor de techniek zijn goedkoop en het protocol kan in korte tijd worden voltooid.

De peptide-poloxamine nanodeeltjes hebben het vermogen om efficiënte mRNA-transfectie te bemiddelen. Peptide-poloxamine nanodeeltjes vertoonden succesvolle mRNA-transfectie in menselijke bronchiale epitheelcellen, wat extra toepassingen impliceert voor mucosale COVID-19-vaccins, behandeling van longkanker en cystic fibrosis-gentherapie. Ik verwacht dat het individu enige basiskennis heeft op een gerelateerd gebied en met het protocol en veel van de technieken, voordat hij of zij de experimenten begint uit te voeren.

Nadat u het open leesframe van Metridia luciferase hebt gesynthetiseerd en in de pUC57-vector hebt gekloond, bereidt u een gelineariseerd DNA-sjabloon voor met BamHI en KpnI bij 37 graden Celsius gedurende een uur. Bereid een reactie van 20-microliter volume voor mRNA-synthese voor met behulp van een T7-transcriptiekit en pseudouridine zoals beschreven in het manuscript. Meng de componenten grondig en incubeer drie uur bij 37 graden Celsius.

Verwijder vervolgens de secundaire structuur van 50 microgram ongecapituleerd IVT-mRNA door het gedurende 10 minuten op 65 graden Celsius te verwarmen. Gebruik het Cap 1-afdeksysteem voor de IVT-mRNA-aftopping en bereid Cap 1 voor door de 7-methylguanosine-dopstructuur gedurende 30 tot 60 minuten te wijzigen met behulp van S-adenosylmethionine en 2'O-methyltransferases bij 37 graden Celsius. Meet de concentratie van afgedekt IVT-mRNA met een UV-zichtbare spectrofotometer.

Analyseer met behulp van een RNA-marker de moleculaire grootte van afgetopt IVT-mRNA in een 1% formaldehyde denaturerende agarose-gel die 18% formaldehyde bevat. Bereid 10 milligram per milliliter stamoplossing van poloxamine 704 door de T704 op te lossen in nucleasevrij water. Bereid 2 milligram per milliliter stamoplossing van het peptide door het peptide op te lossen in nucleasevrij water.

Bewaar de bereide oplossing bij 4 graden Celsius. Ontdooi het IVT-mRNA op ijs. Voordat u de buis opent, centrifugeert u de buis op 300 keer G gedurende drie seconden bij kamertemperatuur en verdunt u de IVT-mRNA-oplossing met nucleasevrij water.

Bereid T704 en synthetische peptidemixoplossing door de T704-oplossing te verdunnen tot acht microgram per microliterconcentratie en de synthetische peptideoplossing tot 0,555 microgram per microliterconcentratie, met respectievelijk nucleasevrij water. Incubeer de gemengde oplossing gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur voor verder gebruik. Zuig de IVT-mRNA-oplossing in een spuit van één milliliter en vermijd luchtspleten of bellen in de punt van de spuit.

Plaats de spuit in één zijde van de patroon naast het roterende blok. Vul vervolgens een spuit van één milliliter met T704 en synthetische peptidemixoplossing en verwijder eventuele bellen of luchtspleten aan de punt van de spuit. Plaats de spuit in de andere inlaat van de pomp en stel de pomp in met een totaal debiet van 4 tot 10 milliliter per minuut.

Plaats een tien milliliter RNase-vrije conische buis om de gemengde IVT-mRNA/PP-sNp-oplossing aan het einde van het stroompad van het mengapparaat te verzamelen. Laat de pomp draaien om het mengen te starten en zorg ervoor dat de parameters correct worden ingevoerd. Nadat u de pomp zes seconden hebt laten draaien, verzamelt u het IVT-mRNA/PP-sNp-monster uit de conische buis.

Plaat menselijke bronchiale epitheelcellen en een dendritische cellijn in 96-well platen 24 uur vóór transfectie. Kweek de cellen in een kweekmedium aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum en 1% penicilline streptomycine. Was na het verwijderen van het groeimedium de vergulde cellen met 0,2 milliliter per put PBS.

Voeg 170 microliter serumvrij kweekmedium toe aan elke put die de vergulde celculturen bevat. Voeg vervolgens 30 microliter IVT-mRNA / PP-sNp-formulering toe die 0,4 microgram Metridia luciferase-mRNA druppelsgewijs in elke put bevat. Incubeer de cellen met de IVT mRNA/ PP-sNp formulering in een bevochtigde 5% koolstofdioxide-verrijkte atmosfeer bij 37 graden Celsius gedurende vier uur.

Aspirateer het transfectiemedium en voeg 0,2 milliliter vers kweekmedium toe, aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum en 1% penicilline streptomycine. Incubeer de getransfecteerde cellen gedurende 24 uur zoals eerder aangetoond en verzamel de supernatanten die uit elke put moeten worden gedetecteerd. Bereid een verse testoplossing door PBS toe te voegen aan het coelenterazinesubstraat.

Meng de oplossing grondig door gedurende 10 seconden te vortexen. Voeg 50 microliter van het verzamelde supernatant toe aan een plaat met 96 putten. Stel de microplaatlezer in met een leestijd van 1.000 milliseconden en voeg handmatig of via geautomatiseerde injectie 30 microliter coelenterazine-oplossing toe aan elke put.

Direct na het toevoegen van de coelenterazine-oplossing aan het supernatant, klikt u op Start om het luminescentiesignaal te meten. Het recombinante plasmide werd geïsoleerd en verteerd om het gelineariseerde DNA-sjabloon te produceren. De in vitro transcriptie produceerde upcapped en capped MetLuc mRNA.

Cellen getransfecteerd met Metridia luciferase mRNA/PP-sNp vertoonden een significant hogere expressie van luciferase in vergelijking met die getransfecteerd met commercieel beschikbare lipide-gebaseerde transfectiereagens, naakt Metridia luciferase mRNA, PBS of T7044 synthetische peptiden, gemengde oplossing in menselijke bronchiale epitheelcellen, 16 HBE en dendritische cellijn DC2.4 Metridia luciferase mRNA / PP-sNp vertoonde een hogere luciferase-expressie dan LP.wat suggereert dat het PP-sNp-afgiftesysteem belangrijk is voor het beschermen van het MetLuc mRNA tegen afbraak en voor het bevorderen van de transfectie-efficiëntie van het exogene Metridia luciferase mRNA. Zorg ervoor dat de synthetische structuur van ongecapped Met-mRNA met succes is verwijderd. Bereken en download de Met-mRNA T704 en peptideverbinding zorgvuldig om de poloxamine nanodeeltjes voor te bereiden en te verdichten.

Transmissie-elektronenmicroscopie kan worden uitgevoerd om de morfologie van peptide-poloxamine nanodeeltjes te observeren. Deze techniek helpt onderzoekers om mucosale mRNA-vaccins te ontwikkelen en high-throughput screening van gentherapieformuleringen voor elke gerelateerde cel mogelijk te maken.