Cyclische peptiden construeren met behulp van een on-tether sulfoniumcentrum

In dit protocol werd het sulfoniumzout geconstrueerd dat kon fungeren als een nieuwe hand die reageerde met het eiwit cysteïne op de speciale nabijheid. Het voordeel van deze techniek was dat deze reactie snel en efficiënt was, en Met-katalysator vrij en ontwikkelde een eenvoudige en efficiënte methode voor het stabiliseren van peptiden. Bereid om te beginnen de N-terminale 9-fluorinyl-methyloxycarbonyl-deprotectie-oplossing van 20% piperidine of 50% morfoline en DMF in een bekerglas of kolf van 500 milliliter.

Voeg vervolgens 10 milliliter van de deprotectieoplossing toe aan de kolom en bel stikstof in de oplossing gedurende 30 minuten of twee keer gedurende vijf minuten. Giet de oplossing af met een vacuümpomp en was de hars sequentieel gedurende vijf keer met dichloormethaan en N, N-dimethylformamide. Om de hars als een donkergele kleuroplossing te detecteren, voegt u een milliliter N, N-dimethylformamide toe aan een kleine hoeveelheid hars en voegt u 200 microliter 5% ninhydrine toe aan een glazen buis.

Verwarm het op 130 graden Celsius gedurende drie minuten om veranderingen in de harskleur te beoordelen. Bereid voor de koppeling van peptiden een mengseloplossing zoals beschreven in het manuscript in een polypropyleenbuis en los deze op in drie milliliter N, N-dimethylformamide. Voeg vervolgens 173 microliter N, N-diisopropylethylamine of 154 microliter N, N'diisopropylcarbodiimide toe aan de oplossing om het aminozuur te inactiveren.

Voeg vervolgens het mengsel toe aan de kolom met hars en bel het gedurende twee uur met stikstof. Voeg na koppeling een milliliter N, N-dimethylformamide toe aan een kleine hoeveelheid hars en voeg 200 microliter 5% ninhydrine toe aan een glazen buis. Verwarm het op 130 graden Celsius gedurende drie minuten terwijl de hars kleurloos werd, wat de afwezigheid van een vrije aminogroep vóór de deprotectiestap bevestigt.

Na het aftappen van de oplossing, wast u de hars zoals eerder aangetoond en voegt u 10 milliliter van de deprotectieoplossing toe aan de kolom. Bel vervolgens met stikstof gedurende 30 minuten of twee keer gedurende vijf minuten. En nogmaals, voeg verse oplossing toe.

Voeg 10 milliliter watervrij methanol toe aan de kolom met hars om te dehydrateren en droog met stikstof voor het volgende gebruik. Weeg 100 milligram van de hars in een kolom en was de hars met dichloormethaan en N, N-dimethylformamide vóór de koppelingsstap. Bereid een oplossing voor het verwijderen van de trityl-L-cysteïnebeschermingsgroep door trifluorazijnzuur, triisopropylsilaan en dichloormethaanmengsel toe te voegen in een bekerglas of kolf van 100 milliliter voor het verwijderen van de beschermende groep.

Voeg vijf tot 10 milliliter van de bereide oplossing toe aan de kolom om de beschermingsgroep gedurende 10 minuten te verwijderen. Herhaal zes keer met stikstof die borrelt totdat de gele kleur volledig verdwijnt. Na het aftappen van de oplossing door een vacuümpomp, wast u de hars zoals eerder aangetoond.

Bereid vervolgens een oplossing voor het reageren met gedeprotecteerde cysteïne door gedihalogeneerde linker en N, N-diisopropylethylamine toe te voegen in een bekerglas van 50 milliliter of kolf met N, N-dimethylformamide. Voeg vijf tot 10 milliliter van de reactieoplossing toe aan de kolom om gedurende ten minste drie uur te reageren met beschermde cysteïne met opborrelende stikstof. Nogmaals, giet de oplossing af met een vacuümpomp en was de hars sequentieel zoals eerder aangetoond.

Om de peptidecyclisatie-oplossing te bereiden, voegt u trifluorazijnzuurmengsel toe in een bekerglas van 20 milliliter of kolf in de zuurkast voor peptidecyclisatie. Voeg vervolgens vijf tot 10 milliliter van de mengseloplossing toe aan de polypropyleenbuis en splits de hars gedurende drie uur onder de trifluorazijnzuurcocktail. Nadat het uitdrogen en wassen van de hars voordat de koppelingsstap eerder is aangetoond, bereidt u een 1% mierenzuur waterige oplossing en een millimolar propargylbromide en voegt u toe aan de methioninepeptide-oplossing.

Schud vervolgens de koppelingsreactie van methionine en propargylbromide bij kamertemperatuur gedurende 12 uur. Los na de reactie het product op in een polypropyleenbuis en acetonitril en filter het door een filtermembraan van 0,22 micrometer. Zuiver vervolgens de oplossing onmiddellijk door reverse phase HPLC en vriesdroog deze tot poeder voor het volgende gebruik.

De gesynthetiseerde cyclische peptiden met behulp van bis-alkylering tussen cysteïne en methionine werden gekenmerkt door HPLC- en LCMS-spectrum, wat aantoont dat de epimeren verschillende retentietijden en identieke molecuulgewichten vertoonden. De HPLC-sporen van de epimeren en het geconjugeerde product toonden de tijdsafhankelijke conversie tussen het cyclische peptide en zijn product. Het molecuulgewicht van cyclische peptiden gesynthetiseerd met behulp van een thiol-yne-type reactie werd bepaald door LCMS en het peptide werd geïsoleerd en gezuiverd door HPLC.

De peptiden werden verder gekenmerkt door proton NMR en heteronucleaire single quantum coherente spectra, die de chemische verschuiving onthulden. Proton NMR spectra van de tijdsafhankelijke conversie tussen cyclisch peptide en dithiothreitol en deuteriumoxide werd verkregen om de stabiliteit van peptide te onderzoeken als gevolg van het openen van de sulfoniumring. De resultaten toonden aan dat er na 24 uur geen toevoegings- of ringopeningsproducten werden gevormd.

Deze procedure heeft een effectieve strategie vastgesteld voor het synthetiseren van cyclische peptiden. De reactie zegt dat de selectiviteit ook is verbeterd door een bevestiging te vormen die het cyclisatiepeptide stabiliseert, wat aangeeft dat cyclische peptiden veelbelovende medicijnkatalysator waren.