Name: Snelle kolonievormende eenheidstelling in 96-wells plaatformaat toegepast op het Drosophila-microbioom (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-13T13:50:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Leer een snelle methode voor kolonievormende eenheidstelling in 96-wells formaat toegepast op het Drosophila-microbioom. Deze geautomatiseerde techniek biedt een honderdvoudige tijdswinst voor microbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Kerwyn Casey Huang, Dr. Andrés Aranda-Díaz, Ted Cooper en leden van het Ludington lab gaven waardevolle input over de ontwikkeling van dit protocol. Financiering werd verstrekt door NSF IOS-subsidie 2032985, NIH-subsidie DP5OD017851, een Carnegie Institution of Canada-subsidie en de Endowment van het Carnegie Institute for Science.

1. Vliegkolonisatie
OPMERKING: Deze methode is geschikt voor kwantitatieve analyse van vliegen met een cultureerbaar darmmicrobioom door groeiplating van CFU's. Een gedetailleerd protocol voor het fokken van gnotobiotische vliegen is eerder gepubliceerd12.
<ol><li>Stel stabiele kolonisatie vast door een commensale bacteriesoort.<ol><li>Bereid een verse bacteriecultuur, pellet door centrifugeren bij 400 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur, en resuspenseer de celpellet in PBS tot een OD600 van 1,0. Voor dit protocol werd Lactiplantibacillus plantarum (voorheen bekend als Lactobacillus plantarum) 's nachts gekweekt tot een OD600 van 2,0.</li>
		<li>Pipetteer 100 μL op het voedsel in een vliegenflacon (zie Materiaaltabel). Verdeel gelijkmatig en laat de vloeistof 15-30 min intrekken.</li>
		<li>Breng 20 kiemvrije vliegen over in deze injectieflacon met behulp van de standaardflacon naar injectieflacon omdraaitechniek34. Elke vlieg eet ongeveer evenveel van de bacteriële dosis35. Als alternatief kunnen kiemvrije eieren worden toegevoegd.</li>
		<li>Breng de vliegen dagelijks gedurende 3 dagen over naar vers steriel voedsel. Doe dit alles in een bioveiligheidskast en gebruik steriele techniek (figuur 1A-1).</li>
	</ol></li>
	<li>Voordat u de CFU-belasting meet, brengt u de vliegen gedurende 4 uur over naar een injectieflacon met steriel agarwater om voorbijgaande bacteriën uit de darm te verwijderen. De agar-waterflacons bieden een bron van vocht voor de vlieg, maar geen voeding voor de vlieg of bacteriën op het oppervlak. Ze worden bereid in dezelfde steriele vliegenflacons als bij standaardvoedsel, maar bevatten alleen gedeïoniseerd water en 1,5% agar.</li>
</ol>2. Homogeniserende vliegen individueel in een 96-well PCR-plaat
<ol><li>Bereid van tevoren kraalklopperplaten voor.<ol><li>Giet 0,5 μm glaskralen (zie Materiaaltabel) op de kraalmeetlade (3D-geprint met behulp van Supplemental Coding File 1 S1-bead-measurer.stl). Spreid de kralen op de lade zodat alle putten vol en waterpas zijn en borstel vervolgens overtollige kralen af in een conische buis om ze te herstellen.</li>
		<li>Plaats een halfronde PCR-plaat (zie Materiaaltabel) ondersteboven op de maatlade en lijn deze uit met de putjes door deze in de inkeping op de maatlade te plaatsen. Draai het vervolgens snel om om de kralen over te brengen.</li>
		<li>Verwijder overtollige kralen van het PCR-plaatoppervlak en bedek het met folie. Inspecteer de PCR-plaat om er zeker van te zijn dat alle putten kralen bevatten. Gebruik indien nodig een weegschep om kralen aan een enkele put toe te voegen. Als statische elektriciteit ervoor zorgt dat er kralen op de plaatoppervlakken blijven plakken, veeg of spuit dan de achterkant van de meetlade en pcr-plaat met 70% ethanol.</li>
		<li>Dek af met aluminiumfolie. Veel platen kunnen op deze manier worden bereid en vervolgens worden geautoclaveerd en opgeslagen voor later gebruik. Voeg, wanneer u klaar bent voor gebruik, 100 μL PBS toe aan elke put met behulp van de 96-kanaals pipettor (zie Materiaaltabel).</li>
	</ol></li>
	<li>Steriliseer de microbe-gekoloniseerde vliegen (zie stap 1) met 70% ethanol vóór homogenisatie.<ol><li>Verdoof de vliegen met 100% CO2 gedurende 5 s. Breng verdoofde vliegen van de injectieflacon over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml met behulp van een kleine trechter (figuur 1A-2). In deze studie werden meestal 25 vliegen per buis toegevoegd.</li>
		<li>Spuit onmiddellijk ~ 1 ml 70% ethanol in de buis, sluit de buis en meng door inversie gedurende 10 s. Zuig vervolgens de ethanol aan met een P1000-pipet en pas op dat u geen vliegen aanzuigt. Herhaal dit nogmaals met ethanol en vervolgens tweemaal met steriel PBS (figuur 1A-3).</li>
	</ol></li>
	<li>Sluit na de laatste PBS-wasbeurt de buis en tik er met de dopkant naar beneden een paar keer hard op de bank zodat de vliegen in de dop gaan.</li>
	<li>Open de buis en doseer vliegen in de putten met behulp van een tang (figuur 1A-4). Plaats één vlieg in elke put (figuur 1A-5). Houd de plaat op ijs tijdens het laden om de vliegen verdoofd te houden.</li>
	<li>Sluit de plaat af met thermal bond heat sealing folie (zie Materiaaltabel).<ol><li>Verwijder eerst alle verdwaalde kralen die zich dicht bij de putten bevinden, omdat deze lekkage in de folieafdichting kunnen veroorzaken. Zorg ervoor dat de doffe kant van de folie naar beneden op de plaat is gericht en de glanzende kant naar de warmtesealer. Druk de warmtesealer (zie Materiaaltabel) gedurende 5 s stevig aan (figuur 1A-6). Brand met de handapplicator (zie Materiaaltafel) om de folie vast te zetten. OPMERKING: Slechte afdichting is een oorzaak van monsterverlies.</li>
	</ol></li>
	<li>Bevestig de plaat in de platenschudder. Homogeniseer gedurende 5 minuten (figuur 1A-7). Draai de kraalplaat gedurende 30 s in een mini-platendraaier (zie Materiaaltafel) op 350 x g om vloeistof uit de afdichtingsfolie te verwijderen.</li>
	<li>Verwijder de folie terwijl u de plaat vasthoudt om geen druppels vlieghomogenaat uit de putten te spatten.</li>
</ol>3. Seriële verdunning van vlieghomogenaat en spotting op CFU-platen
<ol><li>Plaats vier rechthoekige MRS agar groeischijven (zie Tabel van Materialen) in de bioveiligheidskast en verwijder hun deksels. In dit protocol werd MRS agar gebruikt voor de groei van L. plantarum. Laat deze platen minstens 10 min drogen (20 min als ze vers zijn gegoten of koud uit de opslag komen). OPMERKING: Als de platen nat zijn, zullen de druppels van de 96-well plaat samenlopen en de tellingen verpesten.</li>
	<li>Bereid drie verdunningsplaten voor door 100 μL PBS toe te voegen aan elke put van een steriele 96-well plaat met behulp van een 96-kanaals pipettor. Plaats een rek met P20-tips op de 96-kanaals pipettor.</li>
	<li>Voer een verdunning van 1:10 uit door 11,1 μL homogenaat uit de in punt 2 bereide monsterplaat te zuigen (figuur 1A-8). Zorg ervoor dat u uit het midden van de putten trekt in plaats van uit de bodem van de putten, omdat de vlieghomogenaat en glaskralen de pipetten zullen verstoppen. De kralen zinken en de vliegdeeltjes drijven, waardoor de middelste laag grotendeels helder blijft.</li>
	<li>Doseer de 11,1 μL in de eerste verdunningsplaat, die al 100 μL steriel PBS per put bevat. Houd de verdunningsplaat 10 s op de platenschudder bij 600 rpm. Meng opnieuw door vijf cycli op en neer te pipetteren. Breng 11,1 μL over van de eerste verdunningsplaat naar de tweede verdunningsplaat en herhaal de mengstappen voor de volgende twee verdunningsplaten.</li>
	<li>Voer verdunningsreeksplating uit zoals hieronder beschreven.<ol><li>Haal de groeischijven uit de bioveiligheidskast.</li>
		<li>Begin met de meest verdunde plaat en spot 2 μL van elke put op de agarplaten met behulp van de 96-well pipettor (figuur 1A-9).<ol><li>Laat de pipettorkop langzaam op de plaat zakken en zorg ervoor dat je niet in de agar steekt. Onderzoek de plaat zorgvuldig en zorg ervoor dat alle vlekken zijn afgegeven; zo niet, voeg dan handmatig 2 μL toe aan de juiste positie. Controleer of de vloeistofvlekken snel in de agar trekken en niet samen lopen.</li>
			<li>Als de vlekken samenlopen, droog dan een nieuwe set verse agarplaten voor een langere periode en doe de spotting opnieuw. Als er meerdere plaattypen zijn (bijvoorbeeld verschillende media of met antibiotica), zoek die dan ook. Doseer de resterende oplossing terug in de verdunningsplaat en ga verder met de volgende hogere concentratie. OPMERKING: Meng bij het spotten van verdunningen de volgende verdunning vijf keer om ervoor te zorgen dat de inhoud van de pipetpunten vrij is van de vorige verdunning. De verdunningsplaten kunnen >8 uur bij 4 °C worden bewaard zonder de kolonietellingen35 aan te tasten.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Herhaal het beplatingsproces zoals beschreven in stap 3.5 voor de resterende verdunningsplaten, gaande van meest verdund naar meest geconcentreerd tot de plaat met het oorspronkelijke homogenaat.</li>
	<li>Wanneer alle vloeistof in de agar is opgenomen, keert u de platen om en plaatst u ze in de incubator (figuur 1A-10). Voor Lactiplantibacillus en Acetobacter van Drosophila is de optimale temperatuur 30 °C op MRS-media. Incubeer totdat de kolonies de optimale grootte hebben bereikt: kolonies zijn groot genoeg om ze duidelijk te zien, maar niet zo groot dat ze samensmelten of interfereren met elkaars groei (zie de representatieve resultaten voor kwantificering van de optimale grootte). OPMERKING: Optimale groeiomstandigheden zijn spanningsafhankelijk en moeten empirisch worden bepaald. Voor Lactiplantibacillus van Drosophila is de optimale incubatietijd 26 uur tot 30 uur op MRS agar. Voor Acetobacter van Drosophila is de optimale incubatietijd 30 uur tot 48 uur op MRS, afhankelijk van de stam.</li>
	<li>Bewaar de platen na incubatie indien nodig bij 4 °C totdat ze klaar zijn om te tellen.</li>
</ol>4. Kwantificering van CFU's
<ol><li>Kwantificeer CFU's door de platen te fotograferen en vervolgens de kolonies te tellen met behulp van geautomatiseerde software, zoals hieronder beschreven. Als de platen bij 4 °C zijn bewaard, laat ze dan eerst op kamertemperatuur komen, zodat er geen condensatie op de platen is, wat verblinding veroorzaakt.</li>
	<li>Organiseer de platen in een logische volgorde en houd ze in die volgorde tijdens het fotograferen - het maakt het gemakkelijker om de bestanden een naam te geven. Oriënteer alle platen zo dat A1 in de linkerbovenhoek staat voor alle platen. Het wordt aanbevolen om de A1-hoek te labelen met een unieke ID om ervoor te zorgen dat de foto's niet worden verward. Stapel elke verdunningsreeks in volgorde.</li>
	<li>Verwijder het plaatdeksel en plaats de plaat op het podium met A1 in de juiste hoek georiënteerd. Ontwerpen zijn inbegrepen voor de plaatfotodoos (Supplemental File 1, Supplemental File 2), die is geoptimaliseerd voor het fotograferen van deze trayplaten en verlichtings- en filteropties bevat om fluorescerende kolonies in beeld te brengen.</li>
	<li>Stel je de platen voor. Gebruik de camera (zie Materiaaltabel) met handmatige instellingen om een consistent belichtingsniveau tussen platen te bereiken. Een instelling voor een lange brandpuntsafstand wordt aanbevolen om perspectiefvervorming te minimaliseren. Leg de foto vast met een externe sluiter om onscherpte door camerabewegingen te minimaliseren.</li>
	<li>Breng de afbeeldingen over naar een computer en wijzig de naam ervan, inclusief de naam van het experiment, het type media, de verdunningsfactor en andere relevante details. Sommige besturingssystemen (zie Materiaaltabel) hebben een handige functie voor het wijzigen van batches in Finder door met de rechtermuisknop op een selectie van bestanden te klikken.</li>
</ol>5. Geautomatiseerde kolonietelling met behulp van de Count-On-It-suite (Aanvullend bestand 3)
<ol><li>Snijd de afbeeldingen bij met behulp van de meegeleverde Croptacular-plug-in (Supplemental Coding File 2) voor ImageJ. Deze plug-in helpt om de afbeelding op te delen in een ordelijke reeks subregio's (bijvoorbeeld 8 x 12 voor een plaat met 96 putten). De subregio's worden individueel geteld. OPMERKING: Een aparte plug-in voor het tellen van cirkelvormige platen genaamd Circus wordt beschreven in het Supplemental Coding File 3 Circus_.ijm.<ol><li>Organiseer de afbeeldingen die moeten worden verwerkt voor kwantificering in een map. Kies bestandsnamen die de platen onderscheiden, omdat deze bestandsnamen kolomtitels worden voor elke reeks tellingen . Maak in deze map submappen met de naam 'bijgesneden' en 'ontvangstbewijzen'.</li>
		<li>Start Croptacular en klik op OK om te beginnen met bijsnijden. OPMERKING:De standaardinstellingen worden weergegeven en zijn meestal voldoende. Afhankelijk van de resolutie van het beeld, de belichting, de spotgrootte, etc., kan het handig zijn om de basisparameters aan te passen.</li>
		<li>Als de afbeelding al recht is, drukt u gewoon op Spatiebalk. Anders kunt u de afbeelding rechttrekken door een lijn te tekenen langs een rand die horizontaal moet worden. Teken de lijn zo vaak als nodig opnieuw als de afbeelding nog steeds niet rechtgetrokken wordt weergegeven.</li>
		<li>Teken vervolgens een grensvak van het gebied waarvoor moet worden geteld. Pas de grootte en verhouding aan totdat alle vlekken zich in hun cellen bevinden. Sleep de cursor buiten het grensvak om het raster te vernieuwen. Wanneer het raster er goed uitziet, drukt u op Spatiebalk.</li>
		<li>Zorg ervoor dat de volgende afbeelding automatisch in dezelfde hoek draait als de eerste. de plug-in gaat ervan uit dat alle foto's hetzelfde zijn uitgelijnd. Als dit juist is, drukt u op Spatiebalk om door te gaan. Anders zet u de afbeelding recht zoals voorheen. Het raster herinnert ook aan dezelfde positie als de vorige afbeelding; indien nodig aanpassen en druk vervolgens op Spatiebalk.</li>
	</ol></li>
	<li>Som de kolonies op de platen op met behulp van de meegeleverde Count-On-It: Gridiron-plug-in voor ImageJ (Supplemental Coding File 4). Gedetailleerde instructies voor het installeren en gebruiken van de plug-in zijn opgenomen in Supplemental File 3.<ol><li>Start Count-On-It > Gridiron. Gebruik dezelfde rasterinstellingen als bij Croptacular. Gebruikers kunnen een hele map batchen, één afbeelding analyseren of beginnen met de huidige afbeelding.</li>
		<li>Stel de drempel in op basis van een bovenste en een lagere pixelintensiteitswaarde. Maak de drempel zo streng mogelijk terwijl u nog steeds alle kolonies selecteert. Idealiter is er enige ruimte tussen de geselecteerde kolonies, maar de software is in staat om de klodders tot op zekere hoogte te segmenteren. Klik op OK in het dialoogvenster "Actie vereist" wanneer de drempel bevredigend is.</li>
		<li>Om de resultaten te inspecteren, zoomt u in en kijkt u beter naar de kolonietellingen. Als u op annuleren klikt, wordt de plug-in afgebroken. Klik op OK om door te gaan.</li>
		<li>Zorg er op de eerste afbeelding voor dat de optie wordt gegeven om door te gaan of terug te keren naar het setup-menu, bijvoorbeeld om de minimale koloniegrootte te wijzigen. Als u wilt doorgaan met het batchproces, klikt u op OK. Selecteer vervolgens een map om de tabel met ontvangstbewijzen en resultaten te bewaren. Gebruik de map "bonnen" of maak een nieuwe map.</li>
		<li>Na de eerste afbeelding worden de volgende afbeeldingen standaard op dezelfde drempel geplaatst als de vorige instellingen. Klik op OK om deze instellingen te gebruiken of de instellingen aan te passen. Als de foto's consistent zijn en de instelling nauwkeurig is, klikt u op OK in het dialoogvenster 'Actie vereist'. OPMERKING: Zodra alle afbeeldingen in de batch zijn voltooid, wordt de resultatentabel automatisch opgeslagen in dezelfde map als de ontvangstbewijzen.</li>
		<li>Controleer de telbewijzen die door de software worden geproduceerd en corrigeer handmatig eventuele telfouten. De ImageJ-plug-in is statistisch nauwkeurig, maar er treden wel fouten op. Bewijs de ontvangsten om uitschieters te onderzoeken en mistellingen te identificeren. De software slaat de CFU-gegevens op als een .csv bestand in dezelfde map als de ontvangstbewijzen.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyseer de gegevens met behulp van de software die door de gebruiker wordt geprefereerd.</li>
</ol>

<ol><li>McFall-Ngai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animals+in+a+bacterial+world%2C+a+new+imperative+for+the+life+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (9), 3229-3236 (2013).</li>
<li>Shepherd, E. S., Deloache, W. C., Pruss, K. M., Whitaker, W. R., Sonnenburg, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+exclusive+metabolic+niche+enables+strain+engraftment+in+the+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An exclusive metabolic niche enables strain engraftment in the gut microbiota.</a> Nature. 557 (7705), 434-438 (2018).</li>
<li>Taur, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+domination+and+the+risk+of+bacteremia+in+patients+undergoing+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Intestinal domination and the risk of bacteremia in patients undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.</a> Clinical Infectious Diseases. 55 (7), 905-914 (2012).</li>
<li>Buffie, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+microbiome+reconstitution+restores+bile+acid+mediated+resistance+to+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to Clostridium difficile.</a> Nature. 517 (7533), 205-208 (2015).</li>
<li>Callahan, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DADA2%3A+High-resolution+sample+inference+from+Illumina+amplicon+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data.</a> Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).</li>
<li>Vandeputte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+variability+in+quantitative+human+gut+microbiome+profiles+and+implications+for+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Temporal variability in quantitative human gut microbiome profiles and implications for clinical research.</a> Nature Communications. 12 (1), 6740(2021).</li>
<li>D'hoe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+culturing%2C+modeling+and+transcriptomics+uncovers+complex+interactions+and+emergent+behavior+in+a+three-species+synthetic+gut+community%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Integrated culturing, modeling and transcriptomics uncovers complex interactions and emergent behavior in a three-species synthetic gut community.</a> eLife. 7, 2892(2018).</li>
<li>Ludington, W. B., Ja, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+for+the+gut+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model for the gut microbiome.</a> PLoS Pathogens. 16 (4), 1008398(2020).</li>
<li>Chandler, J. A., Lang, J. M., Bhatnagar, S., Eisen, J. A., Kopp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+communities+of+diverse+Drosophila+species%3A+Ecological+context+of+a+host-microbe+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Bacterial communities of diverse Drosophila species: Ecological context of a host-microbe model system.</a> PLoS Genetics. 7 (9), 1002272(2011).</li>
<li>Pais, I. S., Valente, R. S., Sporniak, M., Teixeira, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+establishes+a+species-specific+mutualistic+interaction+with+stable+gut-colonizing+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster establishes a species-specific mutualistic interaction with stable gut-colonizing bacteria.</a> PLoS Biology. 16 (7), 2005710(2018).</li>
<li>Adair, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+determinants+of+among-species+variation+in+microbiome+composition+in+drosophilid+flies%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Host determinants of among-species variation in microbiome composition in drosophilid flies.</a> The ISME Journal. 14, 217-229 (2019).</li>
<li>Koyle, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rearing+the+fruit+fly+Drosophila+melanogaster+under+axenic+and+gnotobiotic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rearing the fruit fly Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), e54219(2016).</li>
<li>Lesperance, D. N. A., Broderick, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiomes+as+modulators+of+Drosophila+melanogaster+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Microbiomes as modulators of Drosophila melanogaster homeostasis and disease.</a> Current Opinion in Insect Science. 39, 84-90 (2020).</li>
<li>Grenier, T., Leulier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+commensal+microbes+shape+the+physiology+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">How commensal microbes shape the physiology of Drosophila melanogaster.</a> Current Opinion in Insect Science. 41, 92-99 (2020).</li>
<li>Broderick, N. A., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut-associated+microbes+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Gut-associated microbes of Drosophila melanogaster.</a> Gut Microbes. 3 (4), 307-321 (2012).</li>
<li>Tkacz, A., Hortala, M., Poole, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantitation+of+microbiota+abundance+in+environmental+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Absolute quantitation of microbiota abundance in environmental samples.</a> Microbiome. 6 (1), 110(2018).</li>
<li>Téfit, M. A., Gillet, B., Joncour, P., Hughes, S., Leulier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+association+of+a+Drosophila-derived+microbiota+with+its+animal+partner+and+the+nutritional+environment+throughout+a+fly+population%27s+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Stable association of a Drosophila-derived microbiota with its animal partner and the nutritional environment throughout a fly population's life cycle.</a> Journal of Insect Physiology. 106, 2-12 (2017).</li>
<li>Ryu, J. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+homeostasis+by+the+homeobox+gene+caudal+and+commensal-gut+mutualism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Innate immune homeostasis by the homeobox gene caudal and commensal-gut mutualism in Drosophila.</a> Science. 319 (5864), 777-782 (2008).</li>
<li>Sieuwerts, S., De Bok, F. A. M., Mols, E., De Vos, W. M., Van Hylckama Vlieg, J. E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+fast+method+for+determining+colony+forming+units%5BTitle%5D)+AND+%22Letters+in+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A simple and fast method for determining colony forming units.</a> Letters in Applied Microbiology. 47 (4), 275-278 (2008).</li>
<li>Eckburg, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+the+human+intestinal+microbial+flora%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diversity of the human intestinal microbial flora.</a> Science. 308 (5728), 1635-1638 (2005).</li>
<li>Newell, P. D., Douglas, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+interactions+determine+the+impact+of+the+gut+microbiota+on+nutrient+allocation+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Interspecies interactions determine the impact of the gut microbiota on nutrient allocation in Drosophila melanogaster.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (2), 788-796 (2013).</li>
<li>Costello, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+community+variation+in+human+body+habitats+across+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial community variation in human body habitats across space and time.</a> Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).</li>
<li>Fadrosh, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+dual-indexing+approach+for+multiplexed+16S+rRNA+gene+sequencing+on+the+Illumina+MiSeq+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq platform.</a> Microbiome. 2 (1), 6(2014).</li>
<li>Vega, N. M., Ludington, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+a+parts+list+to+assembly+instructions+and+an+operating+manual%3A+How+small+host+models+can+re-write+microbiome+theory%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">From a parts list to assembly instructions and an operating manual: How small host models can re-write microbiome theory.</a> Current Opinion in Microbiology. 64, 146-151 (2021).</li>
<li>Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+responses+to+bacteria+from+its+natural+habitats%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).</li>
<li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiota+from+diverse+soil+microbial+environments%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments.</a> The ISME Journal. 10, 1998-2009 (2016).</li>
<li>Sundarraman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher-order+interactions+dampen+pairwise+competition+in+the+zebrafish+gut+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Higher-order interactions dampen pairwise competition in the zebrafish gut microbiome.</a> mBio. 11 (5), 1-15 (2020).</li>
<li>Douglas, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+animal+models+for+microbiome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Simple animal models for microbiome research.</a> Nature Reviews Microbiology. 17, 764-775 (2019).</li>
<li>Friedman, J., Higgins, L. M., Gore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+structure+follows+simple+assembly+rules+in+microbial+microcosms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Ecology+%26+Evolution%22%5BJournal%5D)">Community structure follows simple assembly rules in microbial microcosms.</a> Nature Ecology & Evolution. 1, 0109(2017).</li>
<li>Gilchrist, J. E., Campbell, J. E., Donnelly, C. B., Peeler, J. T., Delaney, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiral+plate+method+for+bacterial+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Spiral plate method for bacterial determination.</a> Applied Microbiology. 25 (2), 244-252 (1973).</li>
<li>Thomas, P., Sekhar, A. C., Upreti, R., Mujawar, M. M., Pasha, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+single+plate-serial+dilution+spotting+%28SP-SDS%29+with+sample+anchoring+as+an+assured+method+for+bacterial+and+yeast+cfu+enumeration+and+single+colony+isolation+from+diverse+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Reports%22%5BJournal%5D)">Optimization of single plate-serial dilution spotting (SP-SDS) with sample anchoring as an assured method for bacterial and yeast cfu enumeration and single colony isolation from diverse samples.</a> Biotechnology Reports. 8, 45-55 (2015).</li>
<li>Nuñez, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+cost+and+open+source+multi-fluorescence+imaging+system+for+teaching+and+research+in+biology+and+bioengineering%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Low cost and open source multi-fluorescence imaging system for teaching and research in biology and bioengineering.</a> PLoS One. 12 (11), 0187163(2017).</li>
<li>Putman, M., Burton, R., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+method+to+automatically+count+bacterial+colony+forming+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Simplified method to automatically count bacterial colony forming unit.</a> Journal of Immunological Methods. 302 (1-2), 99-102 (2005).</li>
<li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila.+A+Laboratory+Handbook%22">Drosophila. A Laboratory Handbook</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (1989).</li>
<li>Dodge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gut+commensal+niche+regulates+stable+association+of+a+multispecies+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A gut commensal niche regulates stable association of a multispecies microbiota.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Obadia, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probabilistic+invasion+underlies+natural+gut+microbiome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Probabilistic invasion underlies natural gut microbiome stability.</a> Current Biology. 27 (13), 1999-2006 (2017).</li>
<li>Vega, N. M., Gore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+assembly+produces+heterogeneous+communities+in+the+Caenorhabditis+elegans+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Stochastic assembly produces heterogeneous communities in the Caenorhabditis elegans intestine.</a> PLoS Biology. 15 (3), 2000633(2017).</li>
<li>Jaime, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+high-throughput+WAFFL+system+for+treating+and+monitoring+individual+Drosophila+melanogaster+adults%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The high-throughput WAFFL system for treating and monitoring individual Drosophila melanogaster adults.</a> bioRxiv. , (2018).</li>
<li>Ren, C., Webster, P., Finkel, S. E., Tower, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+internal+and+external+bacterial+load+during+Drosophila+aging+without+life-span+trade-off%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Increased internal and external bacterial load during Drosophila aging without life-span trade-off.</a> Cell Metabolism. 6 (2), 144-152 (2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De hier gepresenteerde gedetailleerde technieken maken een >100-voudige toename mogelijk van het aantal monsters dat kan worden geëvalueerd in een CFU-telexperiment. Deze techniek bevordert bestaande methoden voor microbioomexperimenten in Drosophila 12,35,36 door het 96-well plaatformaat te gebruiken om individuele vliegen te testen. Verder past het een efficiëntere spotplating methode19,31 toe en een geautomatiseerde workflow met een fotografie- en kolonietelplatform. Het belang van deze methode voor Drosophila is om experimenten te standaardiseren naar het 96-well plaatformaat, wat de gelijktijdige verwerking van een groot aantal biologische replicaties met automatisering mogelijk maakt om high-throughput kwantificering van CFU's te bereiken.
Het 96-well platform laat zien dat een verhoogde frequentie van overdracht en het "opruimen" van voorbijgaande bacteriën een significante vermindering van zowel de gemiddelde abundantie als de variatie tussen monsters veroorzaakt (figuur 1B, C), wat de strengheid van dit verbeterde protocol aantoont. Een beperking van co-housing vliegen is de horizontale overdracht van bacteriën tussen vliegen. Een voorgestelde oplossing is om vliegen individueel te houden in een 96-well plaatformaat, zoals de Whole Animal Feeding Flat38.
Hoewel een significante vermindering van de bacteriële belasting niet werd waargenomen wanneer vliegen in ethanol werden gewassen, waren deze vliegen slechts 3 dagen in de aanwezigheid van externe bacteriën gehouden. Huisvesting voor langere tijdsperioden zou een grotere bacteriële belasting kunnen toestaan om39 te accumuleren. Daarom wordt wassen in ethanol nog steeds aanbevolen.
Het overbrengen van vliegen naar de 96-well plaat is de kritieke eerste stap voor het opzetten van de workflow (figuur 1A). Zodra de vliegen zijn gewassen, worden ze één voor één in de putten verdeeld. Een plaatdiagram is in dit stadium handig om te noteren welke omstandigheden in elke put aanwezig zijn en eventuele notities toe te voegen zoals "vlieg is verloren gegaan". Homogenisatie is een andere cruciale stap met enkele belangrijke kanttekeningen. Bacteriën overleven het homogenisatieproces in de aanwezigheid van een vlieg (figuur 1D, E), en vermoedelijk is dit principe ook waar wanneer de bacteriën zich in de darm van de vlieg bevinden. Bacteriën worden echter ook gedood wanneer ze alleen in kraalklopperplaten worden gehomogeniseerd, wat aantoont dat de homogenisatie de bacteriële cellen in bepaalde omstandigheden kan doden, een beperking die belangrijk kan zijn als men bijvoorbeeld ontlede darmen homogeniseert. Met name het verlies van CFU's bij het homogeniseren is afhankelijk van het aantal CFU's in het monster en het verlies is minimaal wanneer ~ 105 CFU's per put worden gebruikt. Verder behoud van CFU's kan worden bereikt door halverwege de homogenisatie te stoppen en de plaat op ijs af te koelen.
Homogenisatie werd gedurende 5 minuten uitgevoerd in dit protocol op basis van controle-experimenten waarbij een bekend aantal CFU's werden gemengd met een kiemvrije vlieg, en dit werkte empirisch voor vliegenbacteriën. Minder kloppen zorgde ervoor dat grotere vliegdelen aanwezig waren, wat het pipetteren verstoort, terwijl aanzienlijk langere homogenisatietijden van ~ 10 minuten CFU-tellingen variabeler maakten. Het kleinere volume en de schuine vorm van conische plaatputten werden waargenomen om de efficiëntie van het kraal kloppen te verminderen in vergelijking met cilindrische buizen van 2 ml. Er zijn veel variaties op deze algemene benadering mogelijk, waaronder welke bacteriestammen, welke kralen kloppende container, welke kralen en welk vliegengenotype worden gebruikt. Individuele gebruikerscases moeten positieve controles gebruiken om hun aanpak vast te stellen.
De spotplatingmethode werd op een specifieke manier toegepast: 1:2 verdunningen van L. plantarum WF in PBS werden gespot op MRS-platen en geïncubeerd bij 30 °C gedurende 2 dagen (kortere incubatietijden kunnen worden geïmplementeerd om kleinere koloniegroottes te genereren). De methode vereist enige investering vooraf in apparatuur, voornamelijk de kraalklopper en de 96-kanaals pipettor (figuur 2A), die nodig is voor zowel de verdunningsserie als de spotplating. Er zijn echter minder dure opties beschikbaar, waaronder een 96-well plaatreplicator met sleufpennen. De verdunningsreeks is een kritieke stap die de nauwkeurigheid van de CFU-telresultaten beïnvloedt. In termen van faalmodi is het mogelijk om de pipetpunten te verstoppen met vliegende delen of glazen kralen en voor de pipetpunten om niet goed af te sluiten op de pipettor of om een andere reden te falen. Al deze problemen leiden tot ondertelling van de aangetaste putten en moeten worden gecontroleerd. Adequate menging bij elke stap van de verdunningsreeks is ook cruciaal. Elke verdunning moet grondig worden gemengd door de plaat op een platenschudder te leggen of door 15-20 keer op en neer te pipetteren, wat ook dient om de uiteinden te spoelen. Door te spotten van de meest verdunde tot minst verdunde plaat, kunnen de tips worden hergebruikt voor de hele verdunningsreeks. Met 1:2 verdunningen is het tellen nauwkeurig over een bereik van 2-25 kolonies, verspreid over een orde van grootte (figuur 2C). Daarom besparen 1:10 verdunningen tijd en materialen. Een andere variabele waarvan kan worden geprofiteerd, is de incubatietijd, die kan worden aangepast om kleinere kolonies te produceren en zo het bereik van aftelbare plekken te vergroten door het samenvoegen van aangrenzende kolonies te voorkomen.
Een kwaliteitsfoto van de plaat is essentieel omdat het de onbewerkte brongegevens worden waaruit de CFU's worden geanalyseerd en voor onbepaalde tijd kunnen worden gearchiveerd. De FluoroBox is ontworpen om foto's van de platen te produceren met een uniforme lichtintensiteit, waardoor verblinding op het agaroppervlak wordt geminimaliseerd. Bovendien is het ontwerp in staat om selectief fluorescerende kolonies te fotograferen met behulp van led-lampen in één kleur en gekleurde fotofilters (figuur 3A). De constructie van een opstelling zoals de FluoroBox, met gecontroleerde verlichting en camera-instellingen, kan de reproduceerbaarheid van CFU-beelden aanzienlijk vergroten, wat belangrijk is voor geautomatiseerde analyse. Koloniemorfologieën, fluorescentie-intensiteit en de effecten van tijd of dichtheid op koloniegroei zijn slechts enkele van de eigenschappen die kunnen worden geanalyseerd met behulp van de foto's. De fotodoos kan worden gebouwd zonder de kleurfilters en eenkleurige lichten als er geen fluorescerende bacteriën worden gebruikt, waardoor de kosten en complexiteit worden verminderd. Verschillende excitatielampen en emissiefilters kunnen worden vervangen door de hier aanbevolen als een andere fluorofoor door een laboratorium wordt gebruikt. Een camera die via WiFi met een app op een tablet is aangesloten, is handig voor zowel de geautomatiseerde sluiterfunctie om schudden te voorkomen als voor het gemak van gegevensoverdracht. Afbeeldingen kunnen worden overgebracht naar de tablet en vervolgens naar een laptop met behulp van draadloze software voor bestandsoverdracht. Aanbevolen camera's met deze mogelijkheden worden aangegeven in de materiaaltabel.
Count-On-It is een plug-in geschreven in ImageJ. De geautomatiseerde CFU-telsoftware segmenteert het plaatbeeld in een uniform raster met 96 putten, telt de kolonies in elke rastercel en batcht de resultaten in een eenvoudige spreadsheet. Omdat er altijd variatie is in de positie van het spotraster op de plaat en in de foto, moet de gebruiker het raster handmatig aanpassen aan de foto met behulp van de Croptacular plug-in. Dit helpt ook om gebieden in de buurt van de plaatrand uit te sluiten, die verblinding hebben. Het instellen van de drempel is de sleutel tot het verkrijgen van de meest nauwkeurige CFU-telling van de afbeelding. Als de drempel te hoog wordt gesteld, zullen de kolonies fuseren; als de drempel te laag wordt gesteld, worden de kolonies uitgesloten. Zodra de drempel is ingesteld, past de macro gaussiaanse onscherpte toe om de randen te verzachten en aliasing te verminderen, verdeelt het stroomgebiedfilter overlappende kolonies en worden de blobs geteld met behulp van analysedeeltjes. 
Soms is de dichtheid van kolonies op een bepaalde plek te hoog. Count-On-It biedt een manier om hiermee om te gaan. Om het aantal kolonies in een rastercel met gedeeltelijk samengevoegde kolonies te schatten, wordt eerst de gemiddelde oppervlakte van een cirkelvormige klodder van de hele plaat genomen als Cavg. Vervolgens wordt de oppervlakte van blob A1 gedeeld door de gemiddelde oppervlakte van een cirkelvormige blob A1/Cgem. Dit getal wordt afgerond op het dichtstbijzijnde gehele getal, en dat is de schatting voor hoeveel kolonies zich in een blob bevinden. Deze functie is een van de redenen waarom de drempel de telresultaten kan beïnvloeden: het relatieve gemiddelde koloniegebied versus een samengevoegd blobgebied zal verschillen, afhankelijk van hoe de drempel samengevoegde klodders beïnvloedde.
De gepresenteerde methoden hebben verschillende beperkingen. Deze omvatten de noodzaak voor apparatuur om vloeibare media nauwkeurig af te geven van 96-well platen. Deze apparatuur, een 96-kanaals pipettor of een sleuf replicator pin tool, kan duizenden dollars kosten om te verkrijgen. Goedkopere alternatieven bestaan, maar zijn minder nauwkeurig. Geautomatiseerd tellen via Count-On-It brengt ook enkele beperkingen met zich mee. Als bijvoorbeeld twee kolonietypen in een gemengde populatie zouden worden afgebakend op basis van alleen de grootte, zou blobteling niet in staat zijn om kolonies aan het juiste type toe te wijzen. In dit geval zouden vlekken met klodders moeten worden verwijderd uit tellingen. Verdere differentiatie van kolonies op basis van morfologie zou een waardevolle uitbreiding zijn van de methode die momenteel niet wordt geïmplementeerd. Het gebruik van selectieve media, waaronder stamspecifieke voedingsstoffen en antibiotica, vereenvoudigt de noodzaak van complexe beeldanalyse.
Het onderhouden van fruitvliegexperimenten in platen met 96 putten vermenigvuldigt het aantal monsters en omstandigheden dat in één experiment kan worden getest en kan high-throughput schermen in Drosophila-bacterie associatiefenotypen vergemakkelijken. We stellen ons voor dat deze methode kan worden uitgebreid door selectieve media te gebruiken om veel bacteriestammen in complexe mengsels te onderscheiden. De methode is niet beperkt tot de studie van het vliegmicrobioom. Kwantificering van CFU's komt vaak voor in veel toepassingen van de microbiologie, van colibacteriën in drinkwater tot de identificatie van pathogenen. Het hier gepresenteerde CFU-platingsysteem maakt schermen met hoge doorvoer mogelijk, evenals geautomatiseerde acquisitie, verwerking, opslag en levering van resultaten.

De relatie tussen darmmicrobiota en hun dierlijke gastheer staat steeds meer in de voorhoede van biologische studies1, die aantonen dat de stamsamenstelling van het microbioom belangrijk is voor de gastheerfysiologie 2,3,4. Het tempo van ontdekking is beperkt door verstorende factoren zoals hoge natuurlijke interindividuele variatie en hoge diversiteit van koloniserende bacteriën 5,6,7. De fruitvlieg, Drosophila melanogaster, is naar voren gekomen als een veelbelovend model vanwege zijn van nature lage diversiteit microbioom, gebruiksgemak en robuuste gastheergenetica 8,9,10,11. Vliegen kunnen kiemvrij worden gemaakt en opnieuw worden geassocieerd met een gedefinieerde microbiota12, en het is aangetoond dat de flora invloed heeft op de fysiologische eigenschappen van vliegen13,14. De aangeboren flora bestaat uit een beperkte reeks bacteriën die allemaal kweekbaar zijn, en nauwe verwanten hiervan zijn ook endogeen voor de darm van zoogdieren, waaronder Lactobacillen, Proteobacteria en Enterococci15.
Het bestuderen van de invloed van het microbioom op gastheereigenschappen vereist kwantificering van het microbioom in termen van zowel welke soorten aanwezig zijn als hun absolute abundanties16. De belangrijkste manieren om het vliegenmicrobioom te analyseren zijn kolonievormende eenheid (CFU) tellingen17, 16S rRNA-gen amplicon sequencing9 en qPCR van het 16S rRNA-gen18. CFU-tellingen kunnen worden verkregen zonder dure reagentia en ze bevestigen de levensvatbaarheid van de bacteriële cellen19. De 16S-technieken, waaronder qPCR, hebben voordelen in die zin dat taxonomische identiteiten van microben kunnen worden vastgesteld zonder rekening te houden met hun groeivereisten of koloniemorfologieën20.
In het geval dat experimenten vliegen gebruiken met een gedefinieerd microbioom van bekende bacteriën (gnotobiotische vliegen), hebben CFU-tellingen bijzondere voordelen ten opzichte van sequencing21. Sequencing is duur en vereist DNA-extractie, PCR-gebaseerde bibliotheekvoorbereiding en high-throughput sequencing om relatieve abundanties te verkrijgen22. Vanwege de hoge kosten moeten sequencingmethoden met hoge doorvoer meestal in bulk worden uitgevoerd om de prijs per monster te verlagen23. Verdere methoden zoals qPCR zijn vereist om absolute abundanties te verkrijgen16. CFU-tellingen daarentegen zijn snel en goedkoop en geven de absolute aantallen levensvatbare cellen. Drosophila8 en andere kleine microbioommodellen24, waaronder de worm, Caenorhabditis elegans25,26, en de larvale zebravis, Danio rerio, gnotobiotisch gekweekt27, hebben een beperkt aantal bacteriën, die bekende groeikenmerken hebben28. In deze gevallen, met name bij gnotobiotische dieren, kan CFU-telling alle soorten bacteriën binnen de multispecies darmgemeenschappen onderscheiden 21,27,29. CFU-telmethoden met een hogere doorvoer zouden de kosteneffectiviteit en snelheid van het meten van de samenstelling van het microbioom verder verbeteren en kunnen worden toegepast op vele andere microbiologische experimenten.
Het tellen van CFU's door seriële verdunning van een bacteriële suspensie op op agar gebaseerde groeimedia is een standaardmethode op het gebied van microbiologie. De kolonies die op de platen groeien, worden dan handmatig geteld. De verdunningen stellen de onderzoeker in staat om een dichtheid van kolonies te selecteren die aftelbaar is (bijv. ~ 100 CFU's per plaat), wat betekent dat de kolonies niet in elkaar groeien en in een redelijke hoeveelheid tijd kunnen worden geteld. De meeste microbiologen gebruiken in wezen dezelfde CFU-telmethode die 140 jaar geleden is ontwikkeld in het laboratorium van Robert Koch, en voor veel toepassingen is deze methode nog steeds adequaat. Er ontstaat echter een probleem bij het kwantificeren van een groot aantal monsters. Een enkel monster kan 1 tot 10 seriële verdunningen van het monster vereisen om telbare CFU's te verkrijgen, zodat experimenten met meer dan enkele tientallen monsters belastend worden. Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om de efficiëntie van CFU-inventarisatie te verhogen. Geautomatiseerde spiraalbeplating elimineert de noodzaak van seriële verdunningen30, waardoor slechts één plaat nodig is voor CFU-telling, maar de tijd om het monster te platen toeneemt. Single plate-serial dilution spotting (SP-SDS) maakt CFU-schattingen mogelijk van minder platen per monster31. Deze methoden zijn een verbetering ten opzichte van de traditionele spread-plating-methode, maar vereisen nog steeds het afzonderlijk hanteren en plating van bacteriële monsters en zijn dus niet ideaal voor een hoge doorvoer. Het hanteren van monsters in 96-well platen en het spotten van die 96 monsters op rechthoekige agarplaten verbetert de doorvoer van monsters19 aanzienlijk.
Microbiomen zijn meestal samengesteld uit meerdere stammen en soorten. Hoewel soorten vaak kunnen worden onderscheiden door koloniemorfologie of groeimedia, kan fluorescentie worden gebruikt om verschillende soorten bacteriën en hun groeikenmerken verder te onderscheiden32. Verschillende genotypen van dezelfde soort kunnen bijvoorbeeld worden gelabeld met verschillende genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten. Plaatbeeldvormingsmethoden die fluorescentie bevatten, stellen onderzoekers in staat om te profiteren van deze genetische technieken in op CFU gebaseerde assays32. Het opnemen van fluorescentie in CFU-telmethoden met hoge doorvoer zou hun nut verder verbeteren.
Het handmatig tellen van CFU's wordt omslachtig wanneer er een groot aantal monsters is. Geautomatiseerde telling van CFU's kan worden uitgevoerd door de plaat te fotograferen en het beeld te verwerken met behulp van gespecialiseerde software33. Sieuwerts et al. combineerden de verbeterde plating-efficiëntie van spot-plating met geautomatiseerde kolonietellingen met behulp van conventionele digitale fotografie en ImageJ-software19.
Een high-throughput methode om de fenotypen van specifieke microben en gastverenigingen te screenen, zou bijdragen aan studies van microbioomgemeenschapsvergadering en de impact op de gezondheid en fitheid van de gastheer. Voor studies van het Drosophila-microbioom zou een microbiologisch platform met hoge doorvoer de behandeling van vliegenmonsters in 96-wells plaatformaat, vliegenlysis zonder bacteriële lyse, de efficiëntie van spotplating, de mogelijkheid om fluorescentie te gebruiken en meerdere fluoroforen te onderscheiden, een gecontroleerde lichtomgeving voor reproduceerbare beeldvorming van CFU-platen en een betrouwbare geautomatiseerde kolonietelsoftware omvatten. Dit artikel beschrijft een methode die is geoptimaliseerd voor de bepaling van CFU's in gnotobiotische vliegen, die eenvoudig, snel en geautomatiseerd is. Dit protocol schetst een nieuwe workflow die het beste van eerder gepubliceerde methoden combineert en geoptimaliseerd is voor het verkennen van het darmmicrobioom in Drosophila.

<table><tbody><tr><td>Bead beating en spot plating</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fly vials</td><td>Genesee</td><td>32-121</td><td>autoclavable</td></tr><tr><td>Fly vial stoppers</td><td>Genesee</td><td>59-201</td><td>autoclavable</td></tr><tr><td>Hand Applicator</td><td>3M</td><td>3M PA1</td><td></td></tr><tr><td>Heat Sealer</td><td>Eppendorf</td><td>5390</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater 96</td><td>BioSpec</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>Mini-BeadBeater Glass Mill Beads, 0.5 mm</td><td>BioSpec&nbsp;</td><td>11079105</td><td></td></tr><tr><td>MPS 1000 Mini PCR Plate Spinner</td><td>Labnet</td><td>LI-CF-P1000</td><td></td></tr><tr><td>Rainin BenchSmart 96 semi-automated pipettor</td><td>Mettler Toledo</td><td>30296705</td><td>Less expensive options available, including slotted 96 well pin tool from VP Scientific</td></tr><tr><td>TempPlate semi-skirted 96-well PCR plate, straight skirt, natural</td><td>USA scientific</td><td>1402-9220</td><td>Must be polypropylene for heat sealer</td></tr><tr><td>Thermal Bond Heat Seal Foil</td><td>4titude</td><td>4ti-0591</td><td>Keep sterile</td></tr><tr><td>Tray Plate,128 x 85 mm, Polystyrene, Sterile</td><td>SPL Life Sciences</td><td>31001</td><td>For making rectangular agar plates</td></tr><tr><td>Photobox construction</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&frac14;&rdquo;-20 X &frac12;&rdquo; Bolts (X2)</td><td>Amazon</td><td>ASIN: B07BP1WR3H</td><td>To attach the camera bracket. Brand not important. Any 1/4"-20 1/2" bolt works.</td></tr><tr><td>&frac14;&rdquo;-20 x &frac12;&rdquo; Connector Nut&nbsp;</td><td>Amazon</td><td>UPC: 799862376780</td><td>AKA cap nut or connector bolt. This is for attaching the rubber bands on the plate holder. Brand not important.</td></tr><tr><td>&frac14;&rdquo;-20 x &frac34;&rdquo; bolts (X3)</td><td>Amazon</td><td>ASIN: B003QZSZY4</td><td>For the plate holder. Brand not important.</td></tr><tr><td>1/8&rdquo; x &frac12;&rdquo; washer</td><td>Amazon</td><td>UPC: 611982484599</td><td>Washer for the cap nuts on outside of box. Brand not important. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic.</td></tr><tr><td>18 Gauge Wire - Two Conductor Power Wire - 18 AWG Power Wire &ndash; 10ft</td><td>Superbrightleds.com</td><td>WP18-2</td><td></td></tr><tr><td>22-10 AWG Red Wire Nut - WN-R2210 &ndash; Quantity 4</td><td>Superbrightleds.com</td><td>WN-R2210</td><td></td></tr><tr><td>22-18 AWG 3/16in Female Push On Connector - 22-18 AWG &ndash; Quantity 3</td><td>Superbrightleds.com</td><td>SCFP-2218</td><td></td></tr><tr><td>4" Solderless Clamp-On Jumper Connector - 8mm Single Color LED Strip Lights - Quantity 3</td><td>Superbrightleds.com</td><td>SBL-MA2P-8-2</td><td></td></tr><tr><td>4" Solderless Clamp-On Pigtail Adaptor - 8mm Single Color LED Strip Lights &ndash; Quantity 3</td><td>Superbrightleds.com</td><td>SBL-MA2P-8-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>6&rdquo; drawer handle</td><td>Amazon</td><td>ASIN: B07Z331P99</td><td>Any drawer handle should work.</td></tr><tr><td>6&rdquo; Drawer slides</td><td>Btibpse</td><td>UPC: 712243424979</td><td>Trim the soft close rubber stoppers on the drawer sliders.</td></tr><tr><td>8-32 x &frac12;&rdquo; Cap Nuts (x4)</td><td>Amazon</td><td>ASIN: B00HYLZB98</td><td>Attaches drawer slide bolts on outside of box. Brand not important. Nylon won't damage the acrylic. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic.</td></tr><tr><td>8-32 x &frac12;&rdquo; Nylon Bolts (x4)</td><td>Amazon</td><td>ASIN: B07KX9T7NF</td><td>To attach drawer slides. Brand not important. Any bolt or machine screw meeting the specifications works. Nylon won't damage the acrylic and allows you to cut the bolt flush with the nut. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic.</td></tr><tr><td>Acrylic Glue</td><td>SCIGRIP</td><td>Ean: 7844908489337</td><td>SCIGRIP Weld-On #4 Adhesive, Pint and Weld-On Applicator Bottle with Needle</td></tr><tr><td>Black Cable Ties - 10 Pack - 4 Inch Long&nbsp;</td><td>Superbrightleds.com</td><td>CT-B04-10</td><td></td></tr><tr><td>Camera L-Bracket</td><td>WLPREOE, Vikerer, Unbranded</td><td>ASIN: B09X46YKQZ</td><td>The bracket should be "reversed" from its intended configuration so that the camera is on the "outside" of the L. Some brackets come in two pieces and allow for this alternate configuration, some don't, you'll need one that can be flipped. Also should have 1/4" holes for attachment. WLPREOE, Vikerer, Unbranded. Amazon Serial Identification Number given as an example.</td></tr><tr><td>Canon T series camera for tethering option OR</td><td>Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc..</td><td>1894C002</td><td>The Canon Ti series cameras are a good option and can tether to a computer. Use with the 18-55mm standard kit lens. Used options are recommended from the Canon T5 to T7 (current model).</td></tr><tr><td>Custom Length Single Color LED Strip Light - Eco Series Tape Light - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Blue - 2 meters</td><td>Superbrightleds.com</td><td>STN-BBLU-B6A-08C1M-24V</td><td></td></tr><tr><td>Custom Length Single Color LED Strip Light - Eco Series Tape Light - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Green &ndash; 2 meters</td><td>Superbrightleds.com</td><td>STN-BGRE-B6A-08C1M-24V</td><td></td></tr><tr><td>Custom Length Single Color LED Strip Light - Eco Series Tape Light - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Natural White 4000K &ndash; 2 meters&nbsp;</td><td>Superbrightleds.com</td><td>STN-A40K80-B6A-08C1M-24V</td><td></td></tr><tr><td>Drill with &frac14;&rdquo;, 1/8&rdquo; drill bits</td><td>Black &amp; Decker</td><td>&lrm;BDCDD12PK</td><td>Brand not important.&nbsp;</td></tr><tr><td>Flat Black Spray Paint,&nbsp; 2X Ultra-Matte</td><td>Rustoleum</td><td>331182</td><td>Paint the interior of everything FLAT black. Brand not important.</td></tr><tr><td>Laser Cut Acrylic Walls</td><td>Big Blue Saw</td><td>www.bigbluesaw.com</td><td>Use the attached PDF, delete all cutouts in the top piece except desired hole for camera&nbsp;</td></tr><tr><td>Mean Well LED Switching Power Supply - LPV Series 20-100W Single Output LED Power Supply - 24V DC - 20 Watt&nbsp;</td><td>Superbrightleds.com

snelle kolonievormende eenheidstelling in 96-wells plaatformaat toegepast op het drosophila-microbioom

Fast Colony Forming Unit Counting in 96-Well Plate Format Applied to the Drosophila Microbiome

De darmen van dieren worden gekoloniseerd door commensale microben, die de ontwikkeling, gezondheid en het gedrag van de gastheer beïnvloeden. Nauwkeurige kwantificering van kolonisatie is essentieel voor het bestuderen van de complexe interacties tussen gastheer en microbe, zowel om de microbiële samenstelling te valideren als de effecten ervan te bestuderen. Drosophila melanogaster, dat een lage inheemse microbiële diversiteit heeft en economisch is om op te voeden met een gedefinieerde microbiële samenstelling, is naar voren gekomen als een modelorganisme voor het bestuderen van het darmmicrobioom. Het analyseren van het microbioom van een individueel organisme vereist identificatie van welke microbiële soorten aanwezig zijn en kwantificering van hun absolute overvloed. Dit artikel presenteert een methode voor de analyse van een groot aantal individuele vliegenmicrobiomen. De vliegen worden bereid in 96-well platen, waardoor de behandeling van een groot aantal monsters tegelijk mogelijk is. Microbiële abundantie wordt gekwantificeerd door tot 96 hele vlieghomogenaten op een enkele agarplaat op een reeks vlekken te leggen en vervolgens de kolonievormende eenheden (CFU's) te tellen die op elke plek groeien. Dit platingsysteem is gekoppeld aan een geautomatiseerd CFU-kwantificeringsplatform, dat fotografie van de platen, differentiatie van fluorescerende kolonies en geautomatiseerde telling van de kolonies met behulp van een ImageJ-plug-in omvat. Voordelen zijn dat (i) deze methode gevoelig genoeg is om verschillen tussen behandelingen te detecteren, (ii) de spotplating-methode net zo nauwkeurig is als traditionele platingmethoden, en (iii) het geautomatiseerde telproces nauwkeurig en sneller is dan handmatig tellen. De hier gepresenteerde workflow maakt high-throughput kwantificering van CFU's in een groot aantal replicaties mogelijk en kan worden toegepast op andere microbiologische studiesystemen, waaronder in vitro en andere modellen voor kleine dieren.

Deze methode kwantificeert microbiële abundantie met behulp van een 96-well plaatformaat om kolonievormende eenheden (CFU's) te vergulden en wordt toegepast op het Drosophila-microbioom in hele vlieghomogenaatmonsters. CFU's worden geteld met een geautomatiseerde beeldanalysesoftware die hier wordt geleverd.

Snelle kolonievormende eenheidstelling in 96-wells plaatformaat toegepast op het Drosophila-microbioom

The intestines of animals are colonized by commensal microbes, which impact host development, health, and behavior. Precise quantification of colonization ...

Het tellen van kolonievormende eenheden, of CFU's, is een standaardtechniek in de microbiologie, maar het is traag en het vereist veel agarplaten. Onze techniek biedt een honderdvoudig voordeel ten opzichte van traditionele CFU-telmethoden in beide tijd agarplaten. We hebben de methodologie toegepast om het darmmicrobioom van kleine diermodellen te meten, met name fruitvliegen.Dit protocol is een eenvoudige, snelle en geautomatiseerde manier om CFU's in gnotobiotische vliegen te kwantificeren. Dit protocol biedt een workflow met doe-het-zelf gefabriceerde instrumentatie om de CFU's te fotograferen en aangepaste software om het tellen ervan te automatiseren. Dit protocol kan worden gebruikt in elk microbiologisch experiment waar efficiëntere methoden voor plating en CFU-telling nuttig kunnen zijn.Het efficiënt hanteren van de vliegen en het spotten van de platen vereist handmatige behendigheid, dus dit moet worden geoefend. Het gebruik van de geautomatiseerde telsoftware vereist een oordeel over de drempel, dus de ontvangsten moeten worden vergeleken met handmatige tellingen om de beste parameters voor uw experiment te identificeren De procedure demonstreren zal Ren Dodge zijn, een onderzoeker uit mijn laboratorium die de techniek heeft ontwikkeld. Giet om te beginnen glazen kralen van 0,5 micron op de kraalmeetbak.Verdeel de kralen over de lade zodat alle putten vol en waterpas zijn. Borstel vervolgens overtollige kralen af in een conische buis. Plaats nu een semi-rokige PCR-plaat ondersteboven op de maatlade en lijn deze uit met de putjes door deze in de inkeping op de meetlade te plaatsen.Draai het vervolgens snel om om de kralen over te brengen. Verwijder overtollige kralen van het PCR-plaatoppervlak. Zorg ervoor dat alle putten kralen bevatten.Gebruik indien nodig een weegschep om kralen aan een enkele put toe te voegen. Bedek vervolgens de plaat met aluminiumfolie en autoclaaf. Voordat u de plaat gebruikt, voegt u 100 microliter PBS toe aan elke put onmiddellijk voordat u de vliegen toevoegt met behulp van de 96-kanaals pipetter.Voor het steriliseren van de verdoofde vliegen aan het oppervlak, brengt u vliegen over van de injectieflacon in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter met behulp van een kleine trechter. Spuit onmiddellijk een milliliter 70% ethanol in de buis, sluit de buis en meng door inversie gedurende 10 seconden. Zuig vervolgens de ethanol aan met een P-1000-pipet terwijl u geen vliegen aanzuigt.Sluit na de laatste PBS-wasbeurt de buis en tik hem een paar keer hard op de bank met de dopkant naar beneden, zodat de vliegen in de dop gaan. Na het openen van de buis, doseer vliegen in de putten met behulp van een tang en plaats een vlieg in elke put. Houd de vliegen verdoofd door de plaat tijdens het laden op ijs te houden.Verwijder verdwaalde kralen dicht bij de putten, omdat deze de folieafdichting kunnen verbreken en lekkage kunnen veroorzaken. Zorg ervoor dat de doffe kant van de afdichtingsfolie naar beneden op de plaat is gericht en dat de glanzende kant naar boven is gericht op de warmtesealer. Druk de heatsealer vijf seconden stevig aan en brand met de handapplicator om de folie vast te zetten.Homogeniseer de vliegen gedurende vijf minuten. Zorg ervoor dat de vliegen volledig gehomogeniseerd zijn en de oplossing gekleurd wordt. Om vloeistof uit de afdichtingsfolie te verwijderen, draait u de kraalplaat gedurende 30 seconden in een miniplaatspinner op 350 G.Verwijder de folie terwijl u de plaat vasthoudt om spattende druppels vlieghomogenaat te voorkomen.Plaats drie rechthoekige MRS agar groeischijven met hun deksels open in de bioveiligheidskast om minstens 10 minuten te drogen. Bereid twee verdunningsplaten voor door 100 microliter PBS toe te voegen aan elke put van een steriele 96-wellsplaat met behulp van een 96-kanaals pipetter. Plaats een rek met P-20-tips op de 96-kanaals pipetter.Maak een verdunning van 1:10 door 11,1 microliter homogenaat uit de monsterplaat te halen. Doseer het nu in de eerste verdunningsplaat met 100 microliter steriel PBS per putje. Houd de verdunningsplaat gedurende 10 seconden op de platenschudder bij 600 RPM.Meng opnieuw door minstens 10 keer op en neer te pipetteren. Breng 11,1 microliter over van de eerste verdunningsplaat naar de tweede verdunningsplaat en herhaal de mengstappen voor eventuele verdere verdunningen. Voor het spotten van platen laadt u twee microliter van elke put in de 96-kanaals pipetter.Laat de pijpenkop langzaam op de plaat zakken, vermijd steken in de agar en zorg ervoor dat alle vlekken zijn afgegeven. Controleer vervolgens of de vloeistofvlekken snel in de agar trekken en niet samen lopen. Herhaal het beplatingsproces voor de resterende verdunningsplaten zoals beschreven in het manuscript.Zodra de vloeistof volledig in de agar is opgenomen, keert u platen om en incubeert u ze totdat de kolonies de optimale grootte hebben bereikt. Organiseer de platen logisch en houd ze in een specifieke volgorde tijdens het fotograferen. Oriënteer ze zodat A1 in de linkerbovenhoek staat voor alle platen.Na het verwijderen van het plaatdeksel plaatst u de plaat op het podium met A1 in de juiste hoek georiënteerd. Stel je de platen voor. Breng de afbeeldingen over naar een computer en wijzig de naam ervan, inclusief de naam van het experiment, het mediatype, de verdunningsfactor en andere relevante details.Organiseer de afbeeldingen die moeten worden verwerkt voor kwantificering in een map. De bestandsnamen die de platen onderscheiden, worden kolomtitels voor elke reeks tellingen in de uitvoerspreadsheet. Maak submappen met de naam Bijgesneden en Ontvangstbewijzen in de map.Deze mappen ontvangen de uitvoerbestanden. Start nu de Croptacular-plug-in vanuit ImageJ en klik op OK om te beginnen met bijsnijden. Er verschijnt een dialoogvenster om de bronmap te kiezen.Klik op OK. Selecteer de bronmap en klik op Openen. Klik vervolgens op OK in het dialoogvenster om de doelmap te kiezen. Selecteer de doelmap en druk op Openen.Als de afbeelding al recht is, drukt u gewoon op Spatiebalk. Anders kunt u de afbeelding rechttrekken door een lijn te tekenen langs een rand die horizontaal moet worden. Teken de lijn zo vaak als nodig opnieuw als de afbeelding niet recht wordt weergegeven.Teken vervolgens een grensvak voor het telgebied en pas de grootte en verhouding aan totdat alle vlekken zich in hun cellen bevinden. Sleep de cursor buiten het grensvak om het raster te vernieuwen. Wanneer het raster er goed uitziet, drukt u op Spatiebalk.Aangezien de plug-in ervan uitgaat dat alle foto's identiek zijn uitgelijnd, moet u ervoor zorgen dat de volgende afbeelding automatisch in dezelfde hoek roteert als de eerste. Als dit juist is, drukt u op Spatiebalk om door te gaan. Anders zet u de afbeelding recht zoals voorheen.Het raster herinnert ook aan dezelfde positie als de vorige afbeelding. Pas indien nodig aan en druk op Spatiebalk. Start Count-On-It en selecteer Gridiron.Stel de drempelkolonie-intensiteit in op basis van een bovenste en een lagere pixelintensiteitswaarde. Maak de drempel zo streng mogelijk, terwijl u nog steeds alle kolonies selecteert. Klik op OK in het dialoogvenster Actie vereist wanneer de drempelwaarde voldoet en klik vervolgens op OK om door te gaan.Op de eerste afbeelding wordt de optie gegeven om door te gaan of terug te keren naar het setup-menu. Als u wilt doorgaan met het batchproces, klikt u op OK. Selecteer vervolgens een map om de tabel met ontvangstbewijzen en resultaten te bewaren. Gebruik de map Ontvangstbewijzen die eerder is gemaakt.Na de eerste afbeelding worden de volgende afbeeldingen standaard op dezelfde drempel geplaatst als de vorige instellingen. Klik op OK om deze instellingen te gebruiken of de instellingen aan te passen. Controleer de telbewijzen die door de software worden geproduceerd en corrigeer handmatig eventuele telfouten.De ImageJ-plug-in is statistisch nauwkeurig, maar er treden fouten op. Bewijs de ontvangsten om uitschieters te onderzoeken en mistellingen te identificeren. De software slaat de CFU-gegevens op als een CSV-bestand in dezelfde map als de ontvangstbewijzen.Voor vliegen gekoloniseerd met Lactobacillus plantarum was er een significante afname van bacteriën voor vliegen die ofwel dagelijks werden overgebracht naar steriel voedsel, dagelijks werden overgebracht, vier uur voor de analyse steriel voedsel werden bewaard of dagelijks werden overgedragen en vier uur voor de analyse steriele agar werden gehouden in vergelijking met vliegen die na inenting nooit werden overgebracht naar steriel voedsel. Vergelijkbare resultaten werden waargenomen bij Acetobacter indonesiensis-gevoede vliegen, waarbij overgedragen, post-overgedragen en geklaarde vliegen een significante vermindering van CFU's vertoonden, maar wassen had geen meetbaar effect, wat suggereert dat de vermindering van CFU's te wijten was aan de klaring van bacteriën uit de darm in plaats van de cuticula. De CFU-telling in spots met 2 tot 25 kolonies per spot vertoonde geen verschil in vergelijking met de traditionele methode.Spots met een gemiddelde van 35 kolonies vertoonden lagere CFU's dan de controlespreadplaten. Deze vermindering kan te wijten zijn aan kolonies die elkaar overlappen op dichte plekken. Op plaatfoto's was de kolonie-intensiteit 300% hoger dan de achtergrond.De Lactobacillus plantarum mCherry-positieve kolonies vertoonden 1.000% hogere rode intensiteit dan mCherry-negatieve kolonies. Acetobacter indonesiensis GFP-positieve kolonies vertoonden een 200% hogere groene intensiteit dan GFP-negatieve kolonies. De Count-On-It plugin voor ImageJ automatiseert CFU tellen van de plaat foto's.Kolonies worden nauwkeurig gedetecteerd, met vergelijkbare tellingen als handmatig tellen. Telbewijzen kunnen worden gebruikt om mistellingen te identificeren. Door groottedrempels en fluorescentiegolflengten te veranderen, kunnen verschillende koloniemorfologieën afzonderlijk worden geteld.Het is essentieel om ervoor te zorgen dat de plaat goed is afgesloten voordat de kraal parelt. Het is ook belangrijk om positieve controles te ontwerpen om uw metingen te kalibreren. We gebruiken deze techniek ook om in vitro populaties van bacteriën in 96-well platen te bestuderen, waardoor we gemengde gemeenschappen van bacteriën kunnen bestuderen.Deze techniek maakt high-throughput screeningbenaderingen mogelijk om darmkolonisatie en biologische variatie in kolonisatie te meten.

fast-colony-forming-unit-counting-96-well-plate-format-applied-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Om een ​​verband tussen de immuunrespons en gedrag te begrijpen, beschrijven we een methode om locomotorisch gedrag te meten...

Kwantitatieve meting van de immuunrespons en Sleep in<em&gt; Drosophila</em

Drosophila microbiota beïnvloedt de ontwikkeling, immuniteit en fysiologie van het dier. Deze video beschrijft een methode om bacteriën uit vliegen te kwantificeren door de kolonievormende eenheden van hele lichaamspreparaten te bepalen. Het aanbevolen protocol demonstreert de techniek met vliegen, gekweekt onder gnotobiotische omstandigheden met behulp van vier bacteriesoorten.

Colony Forming Units (CFUs) tellen: bacteriën uit vlieglichamen kwantificeren

Source: Dodge, R., et al. Fast Colony Forming Unit Counting in 96-Well Plate Format Applied to the Drosophila Microbiome. J. Vis. Exp. (2023)This video demonstrates the quantification of colony-forming units (CFUs) of gut-associated bacteria in Drosophila flies using a serial dilution and plating approach. Homogenized fly samples containing gut bacteria are serially diluted, plated on agar, and incubated to allow colony growth. Images of the plates are then analyzed using software to align,...

Quantification of Colony-Forming Units of Gut-Associated Bacteria in Drosophila Flies

In this video, we demonstrate a technique for measuring the E. coli bacterial load after injecting E. coli into the thorax of Drosophila melanogaster.

Measuring E. coli Bacterial Load in Drosophila melanogaster following E. coli Infection

Drosophila melanogaster is een uitstekend modelorganisme voor het bestuderen van aangeboren immuunsystemen en de fysiologische gevolgen van infectie en ziekte. Dit protocol beschrijft hoe robuuste en kwantitatief herhaalbare bacteriële infecties aan D. melanogaster kunnen worden toegediend, en hoe vervolgens de ernst van de infectie kan worden gemeten en de immuunrespons van de gastheer kan worden gekwantificeerd.

Systemische bacteriële infectie en afweer Phenotypes in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Een methode voor het kweken van Drosophila melanogaster onder axenic en gnotobiotische voorwaarden wordt gepresenteerd. Fly embryo's worden dechorionated in natriumhypochloriet, aseptisch in steriele voeding en grootgebracht in gesloten containers. Inenten van voeding en embryo's met bacteriën leidt tot gnotobiotische verenigingen, en bacteriële aanwezigheid wordt bevestigd door plating whole-body Drosophila homogenaten.

Het grootbrengen de fruitvlieg<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Onder Axenische en gnotobiotische voorwaarden

Gistgroei fenotypes worden nauwkeurig gemeten door middel van zeer parallelle time-lapse beeldvorming van geïmmobiliseerde cellen die uitgroeien tot microkolonnies. Tegelijkertijd kunnen stresstolerantie, eiwitexpressie en eiwitlokalisatie worden gemonitord, waardoor geïntegreerde datasets worden gegenereerd om te bestuderen hoe omgevings- en genetische verschillen, evenals genexpressie heterogeniteit tussen isogene cellen, de groei moduleren.

Live imaging met hoge doorvoer van microkolonnies om heterogeniteit in groei en genexpressie te meten

De microplate feeder assay biedt een economische, hoge doorvoermethode voor het kwantificeren van vloeibare voedselconsumptie in Drosophila. Een 3D-geprint apparaat verbindt een 96-well microplaat waarin vliegen zijn gehuisvest met een 1536-well microplaat waaruit vliegen een voedingsoplossing met een tracerkleurstof consumeren. De volumedaling van de oplossing wordt spectrofotometrisch gemeten.

Een high throughput microplate feeder assay voor kwantificering van consumptie in Drosophila

Caenorhabditis elegans is een krachtig model om de moleculaire determinanten te onderzoeken die de interacties tussen gastheer en microbioom aansturen. We presenteren een pijplijn met hoge doorvoer die de niveaus van darmmicrobioomkolonisatie bij één dier profileert, samen met belangrijke aspecten van de fysiologie van C. elegans.

Toepassing van flowvermimetrie voor kwantificering en analyse van het darmmicrobioom van Caenorhabditis elegans

De bepaling van kolonievormende eenheden (CFU) is de gouden standaardtechniek voor het kwantificeren van bacteriën, waaronder Mycobacterium tuberculosis, die weken nodig heeft om zichtbare kolonies te vormen. Hier beschrijven we een micro-CFU voor CFU-bepaling met verhoogde tijdsefficiëntie, lagere laboratoriumruimte en reagenskosten, en schaalbaarheid voor experimenten met gemiddelde en hoge doorvoer.

Microkolonievormende eenheidstest voor evaluatie van de werkzaamheid van vaccins tegen tuberculose

Cellijnen zijn nuttig bij studies naar intracellulaire organismen die niet buiten hun gastheercellen kunnen worden gekweekt. Hoewel met Wolbachia geïnfecteerde lijnen veel ontdekkingen mogelijk hebben gemaakt, kan de heterogeniteit binnen deze lijnen leiden tot variabele experimentele resultaten. We presenteren een protocol voor het genereren van eencellige klonen en continue culturen van met Wolbachia geïnfecteerde JW18-cellen.

Generatie van monoklonale culturen uit met Wolbachia geïnfecteerde Drosophila melanogaster JW18-cellijn

Leer een snelle methode voor kolonievormende eenheidstelling in 96-wells formaat toegepast op het Drosophila-microbioom. Deze geautomatiseerde techniek biedt een honderdvoudige tijdswinst voor microbiologisch onderzoek.

Snelle kolonievormende eenheidstelling in 96-wells plaatformaat toegepast op het Drosophila-microbioom

Meer video's verkennen