Name: Voorbereiding, kenmerken, toxiciteit en werkzaamheid Evaluatie van het nasale zelfgeassembleerde nano-emulsietumorvaccin in vitro en in vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Leer de voorbereiding en evaluatie van een neusvaccin met nano-emulsietechnologie voor tumortherapie. Dit protocol toont aan hoe onderzoekers de werkzaamheid en toxiciteit in vitro en in vivo kunnen beoordelen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door nr. 31670938, 32070924, 32000651 van het National Natural Science Foundation Program of China, nr. 2014jcyjA0107 en nr. 2019jcyjA-msxmx0159 van het Natural Science Foundation Project Program van Chongqing, nr. 2020XBK24 en nr. 2020XBK26 van de Army Medical University Special-projecten, en nr. 202090031021 en nr. 202090031035 van het National Innovation and Entrepreneurship Program voor studenten.

De dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Proefdierrichtlijn voor ethische beoordeling van dierenwelzijn (GB/T 35892-2018) en werden goedgekeurd door de Laboratoriumcommissie Dierenwelzijn en Ethiek van de Derde Militaire Medische Universiteit. De muizen werden geëuthanaseerd door een intraperitoneale injectie van 100 mg/kg 1% natriumpentobarbital.
1. Voorbereiding van de I-OVA NE
<ol><li>Meng 1 mg monofosforyllipide A (MPLA) met 100 μL DMSO, vortex gedurende 5 minuten, en laat het 4 uur bij kamertemperatuur (RT) volledig oplossen.</li>
	<li>Voeg Tween 80 en I-OVA kwantitatief toe en meng. OPMERKING: Tween 80 en I-OVA werden gemengd met een massaverhouding van 25:119.</li>
	<li>Voeg squaleen toe aan het mengsel bereid in stap 1.2 (7:3, Smix: squaleen).</li>
	<li>Voeg 100 μL MPLA-oplossing (10 mg/ml) toe aan het mengsel bereid in stap 1.3.</li>
	<li>Bereid het nano-emulsievaccin met behulp van energiezuinige emulgeringsmethoden19: voeg de gemengde oplossing toe aan waterdruppels op ongeveer 70% van het totale volume en roer voorzichtig om een transparant en gemakkelijk stromend mengsel te verkrijgen. OPMERKING: De BNE-controle (blanco emulsie) werd op dezelfde manier bereid, waarbij water werd vervangen door I-OVA.</li>
</ol>2. Fysisch-chemische karakterisering en stabiliteit
OPMERKING: Beoordeel de druppelgrootteverdeling, zeta-potentiaal en andere fysisch-chemische gegevens van het I-OVA NE-vaccin volgens de stappen 2.1-2.3; morfologische karakterisering van het I-OVA NE-vaccin uitvoeren volgens de stappen 2.4-2.7; en onderzoek de 3D-structuur van het I-OVA NE-vaccin volgens de stappen 2.8-2.9.
<ol><li>Meng 50 mg mucine-eiwit met 100 ml water voor injectie om een 0,05% mucine-oplossing te bereiden.</li>
	<li>Verdun 4 mg/ml I-ova ne 200-voudig met 0,05 mg/ml mucine-eiwit of gedeïoniseerd water.</li>
	<li>Observeer de deeltjesgroottes, zetapotentiaal, polydispersiteitsindex (PDI) en elektroforetische mobiliteit bij 25 °C met behulp van een nanoanalysator19.</li>
	<li>Verdun 10 μL I-OVA NE 200-voudig met 2 ml gedeïoniseerd water.</li>
	<li>Plaats 5 μL voorverdund I-OVA NE-vaccin (stap 2.4) op een met koolstof bekleed koperen rooster en bedek het gedurende 3 minuten met 10 μL 1% fosfotungstinezuur.</li>
	<li>Verwijder het overtollige fosfotungstic acid met filtreerpapier.</li>
	<li>Verkrijg afbeeldingen met TEM. Plaats een 50 μL verdund monster van 10 μL op een koolstofkoperrooster met 100 mazen en laat het gedurende 5 minuten op kamertemperatuur (RT) staan voordat 10 μL fosfotungstic acid (1%, pH 7,4) wordt toegevoegd. Onderzoek alle monsters met TEM bij een spanning van 120 kV.</li>
	<li>Karakteriseer de moleculaire morfologie van de I-OVA NEusing een hoge resolutie atoomkrachtmicroscoop. Verkrijg de kleurenbeelden van I-OVA NE onder de volgende omstandigheden: voor wolfraamsondes (krachtconstante: 0,06 N·m-1); scanbereik: 450 nm x 450 nm; Tikkende modus: beeldvormingsmodus; en scanmethode: puntsgewijs scannen bij RT.</li>
</ol>3. In vitro en in vivo toxiciteitstests
OPMERKING: De in vitro toxiciteit van het I-OVA NE-vaccin werd beoordeeld volgens de stappen 3.1-3.9 en de in vivo toxiciteit van het I-OVA NE-vaccin werd beoordeeld volgens de stappen 3.10-3.13.
<ol><li>Herleef menselijke BEAS-2B-epitheelcellen volgens de stappen 3.1.1-3.1.4 en kweek ze in een volledig groeimedium bij 37 °C in een CO 2-incubator van 5%. OPMERKING: Om het volledige groeimedium te bereiden, voegt u foetaal runderserum (FBS) en penicilline/streptomycine toe aan het RPMI-1640-medium in eindconcentraties van respectievelijk 10% en 1%.<ol><li>Zet het waterbad aan en stel de temperatuur in op 37 °C. Verwijder de celflacons bevroren in vloeibare stikstof en ontdooi snel in een waterbad van 37 °C.</li>
		<li>Na het ontdooien pipet u de cellen snel in een steriele centrifugebuis van 15 ml, voegt u 2 ml van het volledige groeimedium toe en centrifugeert u gedurende 5 minuten op 129 x g .</li>
		<li>Verwijder het supernatant, voeg 2 ml van het volledige groeimedium toe om de cellen te resuspenderen en centrifugeer gedurende 5 minuten op 129 x g.</li>
		<li>Verwijder het supernatant, voeg 6 ml volledig groeimedium toe om de cellen te resuspenderen en breng de cellen over in een T25-kweekkolf om de cellen bij 37 °C te kweken in een CO 2-incubator van 5%.</li>
	</ol></li>
	<li>Wanneer de celdichtheid 80% -90% bereikt, gooit u het kweekmedium weg en wast u de cellen tweemaal met 2 ml PBS. Voeg 1 ml 0,25% trypsine toe om de cellen gedurende 1-2 minuten te verteren. Wanneer afronding van de cellen wordt waargenomen, voeg dan onmiddellijk 4 ml van het volledige groeimedium toe om de trypsine te neutraliseren.</li>
	<li>Meng en zuig de monsters in een steriele centrifugebuis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten op 129 x g .</li>
	<li>Verwijder het supernatant en resuspensie van de cellen in 1 ml RPMI-1640 compleet medium. Gebruik 20 μL voor het tellen van de cellen en verdun de cellen tot 1 x 105 cellen/ml.</li>
	<li>Plaats de BEAS-2B-cellen met een dichtheid van 1 x 104 cellen/put in 96-putplaten in 100 μL RPMI-1640 compleet medium en pre-incubeer de platen gedurende 24 uur bij 37 °C in een 5% CO 2-incubator.</li>
	<li>Gooi het supernatant weg en voeg 100 μL I-OVA NE, 100 μL I-OVA+BNE (fysiek gemengd) en 100 μL I-OVA voorverdund met een volledig groeimedium toe in verschillende eindconcentraties (0,5 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 4 mg/ml, 8 mg/ml), met BNE als controle. Incubeer gedurende 24 uur bij 37 °C. OPMERKING: Voeg 100 μL volledig groeimedium toe aan de negatieve controlegroepen en 100 μL celsuspensie (1 x 105/ml) aan de positieve controlegroepen.</li>
	<li>Verwijder het medium en voeg 90 μL volledig groeimedium en 10 μL CCK-8-oplossing toe aan elk putje van de plaat.</li>
	<li>Incubeer de plaat gedurende 2 uur bij 37 °C in een 5% CO 2-incubator.</li>
	<li>Meet de absorptie van elke put bij 450 nm met behulp van een enzymgelabelde plaatlezer.</li>
	<li>Bereken de overlevingsratio van BEAS-2B-cellen zoals aangegeven in de volgende vergelijking: (OD450 monster− OD450 negatieve controle/OD450 positieve controle− OD450 negatieve controle) × 100%</li>
	<li>Verdeel willekeurig 6 weken oude C57BL / 6-muizen in vijf groepen (n = 5 in elke groep) en verdoof ze met 4% isofluraan voor inductie. Handhaaf anesthesie met 2% isofluraan. Gebruik neomycinesulfaatzalf op de ogen van de muizen om uitdroging te voorkomen.</li>
	<li>Gebruik pipetpunten van 10 μL om nasale immunisatie van de muizen uit te voeren met 10 μL / neusgat van I-OVA, I-OVA + BNE en IOVA NE bij 4 mg / ml gedurende alle 3 dagen. Gebruik BNE en PBS als experimentele controle. OPMERKING: Zorg voor thermische ondersteuning totdat het dier herstelt van de anesthesie.</li>
	<li>Euthanaseer alle muizen door een intraperitoneale injectie van 100 mg/kg 1% natriumpentobarbital op dag 4.</li>
	<li>Knip ongeveer 3 mm dikke monsters van neusweefsels met een schaar en verwijder de longweefsels.</li>
	<li>Fixeer de neusweefsels en het hele longweefsel in 4% paraformaldehyde gedurende 24 uur. Droog de weefsels uit door een seriële alcohol- en xyleengradiënt en sluit ze vervolgens in paraffine in. Snijd de afgewerkte wasblokken op een paraffinesnijder met een dikte van 4 μm.</li>
	<li>Bevlek de secties met hematoxyline en eosine (H &E). Observeer vervolgens de mucosale toxiciteit, waaronder hyperemie, oedeem, neutrofiele infiltratie en structurele schade in het neusslijmvlies en longweefsel, onder een microscoop (100x en 200x)7.</li>
</ol>4. In vitro cellulaire opname
<ol><li>Plaat BEAS-2B cellen met een dichtheid van 5 x 10 5 cellen/put in 12-well platen met coverslips in 2 ml van het volledige groeimedium en pre-incubeer de platen 's nachts bij 37 °C in een5 % CO2 incubator.</li>
	<li>Voeg 100 μL FITC-gelabelde I-OVA NE (zuiverheid: 98,3%, geproduceerd door het bedrijf, 4 mg / ml) of I-OVA (4 mg / ml) toe aan 900 μl celsuspensie en plaats bij 37 °C gedurende 90 minuten. OPMERKING: Bereid FITC-gelabelde I-OVA NE voor zoals beschreven in stap 4.1. Voeg 1 ml volledig groeimedium toe aan de controlegroepen.</li>
	<li>Was driemaal met 0,1 M PBS (1 ml/put) gedurende 30 minuten bij 37 °C na de behandeling.</li>
	<li>Bevestig deze monsters met 4% paraformaldehyde gedurende 20 minuten in het donker. Verwijder na fixatie het paraformaldehyde en was 3 keer met 0,1 M PBS (1 ml/put) gedurende 30 minuten bij 37 °C.</li>
	<li>Pre-incubeer de monsters met DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindool) in een eindconcentratie van 10 μg/ml gedurende 10 minuten in het donker en was vervolgens 5 keer met 0,1 M PBS (1 ml/put) gedurende 30 minuten bij 37 °C na de behandeling.</li>
	<li>Verkrijg de mobiele opname door CLSM met de volgende parameterinstellingen: Framegrootte: 512 px x 512 px, Scansnelheid: 8; Lijnstap: 1; Middeling: 2.</li>
</ol>5. In vivo vrijgave
<ol><li>Verdoof naaktmuizen met 4% isofluraangas en handhaaf de anesthesie op 2% isofluraan. Immuniseer naakte muizen intranasaal met 10 μL PE-gelabelde I-OVA bij 4 mg / ml of PE-gelabelde I-OVA NE bij 4 mg / ml in elk neusgat.</li>
	<li>Bij 0 h, 0,5 h, 1,5 h, 3, 6 h, 9 h, 12 h en 24 h, vangen alle muizen onder narcose door het IVIS-systeem.</li>
	<li>Voer een achtergrondscan uit onmiddellijk vóór intranasale toediening om een drempelwaarde te verkrijgen (Min = 1,06 x 106) om de verzamelde beelden op alle tijdstippen aan te passen.</li>
	<li>Klik op de Living Image-software om de reeks te starten en klik op Initialiseren om het IVIS-systeem te initialiseren</li>
	<li>Wanneer het wordt geïnitialiseerd, is het temperatuurstatuslampje in het IVIS-acquisitiebedieningspaneel rood. Wanneer het temperatuurstatuslampje groen wordt, kan beeldvorming worden uitgevoerd.</li>
	<li>Klik op Wizard Beeldvorming en kies vervolgens Fluorescentie in het dialoogvenster dat wordt weergegeven.</li>
	<li>Pas de volgende parameters aan: Belichtingstijd: auto sec, Binning: 8, F / Stop: 2, Gezichtsveld: D.</li>
	<li>Selecteer het excitatiefilter van 620 nm en het emissiefilter van 670 nm. Klik op Acquire Sequence om de afbeelding te verkrijgen.</li>
	<li>Verwerk de live beelden van alle muizen en de stralingsgegevens met Living Image software.<ol><li>Nadat u de afbeelding hebt verkregen, klikt u op ROI-hulpmiddelen in het gereedschapspalet, selecteert u Cirkel en maakt u een ROI-cirkel.</li>
		<li>Klik op ROI's meten om een kwantitatieve waarde voor het ROI-gebied te verkrijgen.</li>
	</ol></li>
</ol>6. In vivo antitumor werkzaamheid
<ol><li>Ververs en kweek de muislymfoom E.G7-OVA-cellen uit EL4 met een volledig groeimedium volgens de stappen 2.1.1-2.1.4. OPMERKING: Om E.G7-OVA cel compleet groeimedium te bereiden, meng RPMI 1640 medium met 2 mM L-glutamine aangepast om 1,5 g / L natriumbicarbonaat, 4,5 g / L glucose, 10 mM HEPES en 1,0 mM natriumpyruvaat te bevatten en aangevuld met 0,05 mM 2-mercaptoethanol en 0,4 mg / ml G418, 90%, en foetaal runderserum, 10%.</li>
	<li>Subcultuur de cellen in een verhouding van 1:2 wanneer de cellen een dichtheid bereiken tussen 1 x 106 cellen/ml en 1 x 107 cellen/ml.</li>
	<li>Evalueer het preventieve beschermende effect op muizen zoals beschreven in de stappen 6.3.1-6.3.4.<ol><li>Verdeel willekeurig 6 weken oude C57BL/6 muizen in vijf groepen (n = 8 in elke groep). Verdoof naaktmuizen met 4% isofluraangas en handhaaf anesthesie met 2% isofluraan. Scheer het achterste haar en neomycinesulfaatzalf gedeeltelijk op de ogen van de muizen om uitdroging te voorkomen.</li>
		<li>Immuniseer de muizen intranasaal met 10 μL van 1 mg / ml i-eicellen, BNE + I-OVA of I-OVA NE in elk neusgat, BNE (vier keer verdund met PBS), of een PBS-controle 3 keer met een interval van 7 dagen tussen elke immunisatie.</li>
		<li>Ent alle muizen hypodermisch in de rechtsback met 5 x 105 E. G7-OVA cellen op de 7e dag na de laatste immunisatie.</li>
		<li>Controleer op 0, 6, 9, 12, 15 en 18 dagen na de laatste immunisatie de tumorvolumes door twee assen van de tumor te meten met behulp van digitale remklauwen en registreer de 30-daagse (na de laatste immunisatie) overleving van de muizen.</li>
	</ol></li>
	<li>Evalueer het therapeutische beschermende effect op muizen na het enten van E.G7-OVA-cellen zoals beschreven in stappen 6.4.1-6.4.3. Voor de groepering en de behandeling van muizen wordt verwezen naar stap 6.3.1.<ol><li>Injecteer op dag 0 de C57BL/6-muizen subcutaan in de rechtsrug met E.G7-OVA-cellen (5 x 105 cellen/muis).</li>
		<li>Immuniseer na 0, 7 en 14 dagen na injectie alle muizen intranasaal geïmmuniseerd met 10 μL I-OVA, BNE + I-OVA, I-OVA NE (allemaal in concentraties van 1 mg / ml), BNE of PBS driemaal in elk neusgat.</li>
		<li>Controleer op 0, 6, 9, 12, 15 en 18 dagen na injectie het tumorvolume en registreer de 30-daagse overleving van de muizen. OPMERKING: Als het tumorvolume groter is dan 3.000 mm3, moeten de muizen om humane redenen worden geëuthanaseerd en zullen deze muizen als dood worden beschouwd in de overlevingscurve. Tumorvolume wordt berekend met een gewijzigde ellipsoïdale formule zoals aangegeven in de volgende vergelijking: Volume = π/6 x L x B2 waarbij L de tumorlengte vertegenwoordigt en W de tumorbreedte (lengte-eenheid: mm, volume-eenheid: mm3).</li>
	</ol></li>
</ol>7. Statistische analyse
<ol><li>Analyseer de verschillen in gegevens tussen de verschillende groepen met behulp van geschikte statistische software met eenrichtings-ANOVA, Tukey's meerdere vergelijkingen of een student's t-test. Gebruik de Kaplan-Meier-methode om de overlevingsresultaten te schatten en de groepen te vergelijken met log-rank statistieken. Druk alle resultaten uit als gemiddelde ± SD. De betekenis van P-waarden P < 0,05, P < 0,01 en P < 0,001 wordt weergegeven met respectievelijk *, ** en *** op de percelen.</li>
</ol>

<ol><li>Sung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cancer+statistics+2020%3A+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).</li>
<li>Mohammed, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficacy+and+effectiveness+of+the+COVID-19+vaccines+in+reducing+infection%2C+severity%2C+hospitalization%2C+and+mortality%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+%26+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">The efficacy and effectiveness of the COVID-19 vaccines in reducing infection, severity, hospitalization, and mortality: A systematic review.</a> Human Vaccines & Immunotherapeutics. 18 (1), 2027160(2022).</li>
<li>Tsung, K., Norton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+vaccine%2C+immunological+memory+and+cancer+cure%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+%26+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">In situ vaccine, immunological memory and cancer cure.</a> Human Vaccines & Immunotherapeutics. 12 (1), 117-119 (2016).</li>
<li>Abd-Aziz, N., Poh, C. L., Ding, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+peptide-based+vaccines+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Development of peptide-based vaccines for cancer.</a> Journal of Oncology. 2022, 9749363(2022).</li>
<li>Mochizuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+with+antigenic+peptides+complexed+with+beta-glucan+induces+potent+cytotoxic+T-lymphocyte+activity+in+combination+with+CpG-ODNs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Immunization with antigenic peptides complexed with beta-glucan induces potent cytotoxic T-lymphocyte activity in combination with CpG-ODNs.</a> Journal of Controlled Release. 220, 495-502 (2015).</li>
<li>Kalita, P., Tripathi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+advances+in+the+design+of+peptide-based+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Methodological advances in the design of peptide-based vaccines.</a> Drug Discovery Today. 27 (5), 1367-1380 (2022).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+self-assembled+epitope+peptide+nanoemulsion+vaccine+targeting+nasal+mucosal+epithelial+cell+for+reinvigorating+CD8%28%2B%29+T+cell+immune+activity+and+inhibiting+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">A novel self-assembled epitope peptide nanoemulsion vaccine targeting nasal mucosal epithelial cell for reinvigorating CD8(+) T cell immune activity and inhibiting tumor progression.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 183, 1891-1902 (2021).</li>
<li>Ren, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OVA-specific+CD8%2B+T+cells+do+not+express+granzyme+B+during+anterior+chamber+associated+immune+deviation%5BTitle%5D)+AND+%22Graefe%27s+Archive+for+Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">OVA-specific CD8+ T cells do not express granzyme B during anterior chamber associated immune deviation.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 244 (10), 1315-1321 (2006).</li>
<li>Suzuki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+hyaluronic+acid-coated+polymeric+micelles+for+nasal+vaccine+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+Science%22%5BJournal%5D)">Preparation of hyaluronic acid-coated polymeric micelles for nasal vaccine delivery.</a> Biomaterials Science. 10 (8), 1920-1928 (2022).</li>
<li>Georas, S. N., Rezaee, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+barrier+function%3A+at+the+front+line+of+asthma+immunology+and+allergic+airway+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Epithelial barrier function: at the front line of asthma immunology and allergic airway inflammation.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 509-520 (2014).</li>
<li>Lam, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nasal+omicron+vaccine+booster+elicits+potent+neutralizing+antibody+response+against+emerging+SARS-CoV-2+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Microbes+%26+Infections%22%5BJournal%5D)">A nasal omicron vaccine booster elicits potent neutralizing antibody response against emerging SARS-CoV-2 variants.</a> Emerging Microbes & Infections. 11 (1), 964-967 (2022).</li>
<li>Chai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+functional+recovery+of+rat+transected+spinal+cord+by+peptide-grafted+PNIPAM+based+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Improved functional recovery of rat transected spinal cord by peptide-grafted PNIPAM based hydrogel.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 210, 112220(2022).</li>
<li>Paiva Dos Santos, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+purification+and+characterization+of+an+elastin-like+polypeptide+containing+the+Ile-Lys-Val-Ala-Val+%28IKVAV%29+peptide+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Production, purification and characterization of an elastin-like polypeptide containing the Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) peptide for tissue engineering applications.</a> Journal of Biotechnology. 298, 35-44 (2019).</li>
<li>Okur, A. C., Erkoc, P., Kizilel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cancer+cells+via+tumor-homing+peptide+CREKA+functional+PEG+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Targeting cancer cells via tumor-homing peptide CREKA functional PEG nanoparticles.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 147, 191-200 (2016).</li>
<li>Makidon, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-clinical+evaluation+of+a+novel+nanoemulsion-based+hepatitis+B+mucosal+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pre-clinical evaluation of a novel nanoemulsion-based hepatitis B mucosal vaccine.</a> PLoS One. 3 (8), 2954(2008).</li>
<li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oil-in-ionic+liquid+nanoemulsion-based+intranasal+delivery+system+for+influenza+split-virus+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Oil-in-ionic liquid nanoemulsion-based intranasal delivery system for influenza split-virus vaccine.</a> Journal of Controlled Release. 346, 380-391 (2022).</li>
<li>O'Konek, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+nanoemulsion+vaccine+confers+long-lasting+immunomodulation+and+sustained+unresponsiveness+in+a+murine+model+of+milk+allergy%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Intranasal nanoemulsion vaccine confers long-lasting immunomodulation and sustained unresponsiveness in a murine model of milk allergy.</a> Allergy. 75 (4), 872-881 (2020).</li>
<li>Ahmed, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+nanoemulsion+vaccine+induces+mucosal+Interleukin-17+responses+and+confers+protection+upon+Mycobacterium+tuberculosis+challenge+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">A novel nanoemulsion vaccine induces mucosal Interleukin-17 responses and confers protection upon Mycobacterium tuberculosis challenge in mice.</a> Vaccine. 35 (37), 4983-4989 (2017).</li>
<li>Sun, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+systemic+and+mucosal+immunity+against+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+infection+by+a+novel+nanoemulsion+adjuvant+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated-macrophage-membrane-coated+nanoparticles+for+improved+photodynamic+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated-macrophage-membrane-coated nanoparticles for improved photodynamic immunotherapy.</a> Nano Letters. 21 (13), 5522-5531 (2021).</li>
<li>Prasanna, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+nanoscale+drug+delivery+and+the+future+of+nano-vaccine+development+for+leishmaniasis+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Current status of nanoscale drug delivery and the future of nano-vaccine development for leishmaniasis - A review.</a> Biomedicine & Pharmacotherapy. 141, 111920(2021).</li>
<li>George, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+defects+on+plate-shaped+silver+nanoparticles+contribute+to+its+hazard+potential+in+a+fish+gill+cell+line+and+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Surface defects on plate-shaped silver nanoparticles contribute to its hazard potential in a fish gill cell line and zebrafish embryos.</a> ACS Nano. 6 (5), 3745-3759 (2012).</li>
<li>Jafari Eskandari, M., Gostariani, R., Asadi Asadabad, M. Transmission Electron Microscopy of Nanomaterials. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJafari+Eskandari%2C+M+%22Electron+Crystallography%22">Electron Crystallography</a>. Singh, D., Condurache-Bota, S. , IntechOpen. London, UK. (2020).</li>
<li>Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+nanoindentation+method+on+collagen+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils.</a> Materials. 15 (7), 2477(2022).</li>
<li>Zielinska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+nanoparticles%3A+Production%2C+characterization%2C+toxicology+and+ecotoxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Polymeric nanoparticles: Production, characterization, toxicology and ecotoxicology.</a> Molecules. 25 (16), 3731(2020).</li>
<li>Doncom, K. E. B., Blackman, L. D., Wright, D. B., Gibson, M. I., O'Reilly, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispersity+effects+in+polymer+self-assemblies%3A+A+matter+of+hierarchical+control%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Dispersity effects in polymer self-assemblies: A matter of hierarchical control.</a> Chemical Society Reviews. 46 (14), 4119-4134 (2017).</li>
<li>Pei, M., Li, H., Zhu, Y., Lu, J., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+evidence+of+oncofetal+antigen+and+TLR-9+agonist+co-delivery+by+alginate+nanovaccines+for+liver+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+Science%22%5BJournal%5D)">In vitro evidence of oncofetal antigen and TLR-9 agonist co-delivery by alginate nanovaccines for liver cancer immunotherapy.</a> Biomaterials Science. 10 (11), 2865-2876 (2022).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titanium+dioxide+nanoparticles+induced+reactive+oxygen+species+%28ROS%29+related+changes+of+metabolomics+signatures+in+human+normal+bronchial+epithelial+%28BEAS-2B%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Titanium dioxide nanoparticles induced reactive oxygen species (ROS) related changes of metabolomics signatures in human normal bronchial epithelial (BEAS-2B) cells.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 444, 116020(2022).</li>
<li>Kumar, V., Sharma, N., Maitra, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+toxicity+assessment+of+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22International+Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo toxicity assessment of nanoparticles.</a> International Nano Letters. 7 (4), 243-256 (2017).</li>
<li>Tong, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunopotentiator%2C+ophiopogonin+D%2C+encapsulated+in+a+nanoemulsion+as+a+robust+adjuvant+to+improve+vaccine+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy.</a> Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).</li>
<li>Elliott, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+microscopy%3A+Principles+and+modern+practices%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Confocal microscopy: Principles and modern practices.</a> Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68(2020).</li>
<li>Huang, Y., Zou, Y., Lin, L., Zheng, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ginsenoside+Rg1+activates+dendritic+cells+and+acts+as+a+vaccine+adjuvant+inducing+protective+cellular+responses+against+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ginsenoside Rg1 activates dendritic cells and acts as a vaccine adjuvant inducing protective cellular responses against lymphomas.</a> DNA and Cell Biology. 36 (12), 1168-1177 (2017).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen bekende concurrerende financiële belangen of persoonlijke relaties hebben die van invloed lijken te zijn geweest op het werk dat in dit artikel wordt gerapporteerd.

Nanovaccins gefunctionaliseerd met immunocytenmembranen hebben grote voordelen bij ziektegerichte therapie en de bijwerkingen worden geminimaliseerd door eigenschappen zoals uniek tumortropisme, de identificatie van specifieke doelen, langdurige circulatie, verbeterde intercellulaire interacties en lage systemische toxiciteit. Ze kunnen ook gemakkelijk worden geïntegreerd met andere behandelingsmodules om kankers coöperatief te behandelen16,20. Wenselijke eigensc...

Als een van de meest kritieke innovaties op het gebied van de volksgezondheid spelen vaccins een sleutelrol in de strijd tegen de wereldwijde last van menselijke ziekten1. Op dit moment worden bijvoorbeeld meer dan 120 kandidaat-vaccins voor COVID-19-ziekten getest, waarvan sommige in veel landen zijn goedgekeurd2. Recente rapporten stellen dat kankervaccins de voortgang van klinische kankerbehandelingen effectief hebben verbeterd omdat ze het immuunsysteem van kankerpatiënten sturen om antigenen te herkennen als lichaamsvreemd3. Bovendien kunnen meerdere T-cel epitopen binnen of buiten tumorcellen worden gebruikt om peptidevaccins te ontwerpen, die voordelen hebben aangetoond bij de behandeling van gemetastaseerde kankers vanwege het ontbreken van de significante toxiciteit geassocieerd met radiotherapie en chemotherapie 4,5. Sinds het midden van de jaren 1990 zijn preklinische en klinische proeven voor tumorbehandeling voornamelijk uitgevoerd met behulp van antigeenpeptidevaccins, maar weinig vaccins vertonen een adequaat therapeutisch effect op kankerpatiënten6. Bovendien hebben kankervaccins met peptide-epitopen een slechte immunogeniciteit en onvoldoende leveringsefficiëntie, wat te wijten kan zijn aan de snelle afbraak van extracellulaire peptiden die snel diffunderen vanaf de plaats van toediening, wat leidt tot onvoldoende antigeenopname door immuuncellen7. Daarom is het noodzakelijk om deze obstakels te overwinnen met vaccinafgiftetechnologie.
OVA 257-264, het MHC klasse I-bindende257-264 epitoop uitgedrukt als een fusie-eiwit, is een veelgebruikt model epitoop8. Bovendien is OVA257-264 cruciaal voor de adaptieve immuunrespons tegen tumoren, die afhankelijk is van de cytotoxische T-lymfocytenrespons (CTL). Het wordt gemedieerd door antigeenspecifieke CD8 + T-cellen in de tumor, die worden geïnduceerd door het OVA257-264-peptide . Het wordt gekenmerkt door onvoldoende granzyme B, dat wordt vrijgegeven door cytotoxische T-cellen, wat leidt tot de apoptose van doelcellen8. Vrije toediening van OVA257-264-peptiden kan echter weinig CTL-activiteit induceren omdat de opname van deze antigenen plaatsvindt in niet-specifieke cellen in plaats van antigeen-presenterende cellen (APC's). Het tekort aan geschikte immuunstimulatie resulteert in CTL-activiteit5. Daarom vereist de inductie van effectieve CTL-activiteit aanzienlijke vooruitgang.
Vanwege de barrière van epitheelcellen en de continue afscheiding van slijm, worden vaccinantigenen snel verwijderd uit het neusslijm 9,10. Het ontwikkelen van een efficiënte vaccinvector die door het slijmvliesweefsel kan gaan, is cruciaal omdat de antigeen-presenterende cellen zich onder het mucosale epitheel9 bevinden. Intranasale injectie van vaccins induceert theoretisch mucosale immuniteit om mucosale infectie te bestrijden11. Bovendien is nasale toediening een effectieve en veilige toedieningsmethode voor vaccins vanwege het gemak, het vermijden van darmtoediening en verbeterde patiëntcompliancy7. Daarom is nasale toediening een goed toedieningsmiddel voor het nieuwe peptide epitoop nanovaccin.
Verschillende synthetische biomaterialen zijn ontworpen om epitopen van cel-weefsel en cel-cel interacties te combineren. Bepaalde bioactieve eiwitten, zoals Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV), zijn geïntroduceerd als onderdeel van de structuur van de hydrogel om bioactiviteitte verlenen 12. Dit peptide draagt waarschijnlijk bij aan celaanhechting, migratie en uitgroei13 en bindt integrinen α 3β1 en α6β1 om te interageren met verschillende kankerceltypen. IKVAV is een celadhesiepeptide afgeleid van het laminine keldermembraaneiwit α1-keten dat oorspronkelijk werd gebruikt om de neurale micro-omgeving te modelleren en de neuronale differentiatiete veroorzaken 14. Daarom is het vinden van een efficiënt leveringsmiddel voor dit nieuwe vaccin belangrijk voor ziektebestrijding.
Recent gerapporteerde emulsiesystemen, zoals W805EC en MF59, zijn ook samengesteld voor de toediening van de neusholte van geïnactiveerd influenzavaccin of recombinant hepatitis B-oppervlakteantigeen en geïllustreerd om zowel mucosale als systemische immuniteit te activeren15. Nano-emulsies (NE's) hebben de voordelen van eenvoudige toediening en gemakkelijke co-vorming met effectieve adjuvantia in vergelijking met deeltjesslijmvliesafgiftesystemen16. Van nano-emulsievaccins is gemeld dat ze het allergische fenotype op een duurzame manier veranderen die verschilt van traditionele desensibilisatie, wat resulteert in langdurige onderdrukkende effecten17. Anderen meldden dat nano-emulsies in combinatie met Mtb-specifieke immunodominante antigenen krachtige mucosale celresponsen konden induceren en significante bescherming konden bieden18. Daarom werd een nieuw intranasaal zelfgeassembleerd nanovaccin met het synthetische peptide IKVAV-OVA 257-264 (I-OVA, het peptide bestaande uit IKVAV gebonden aan OVA257-264) ontworpen. Het is belangrijk om dit nieuwe nanovaccin systematisch te beoordelen.
Het doel van dit protocol is om systematisch de fysisch-chemische kenmerken, toxiciteit en stabiliteit van het nanovaccin te evalueren, te detecteren of de opname van antigeen en beschermende en therapeutische effecten worden versterkt met behulp van technische middelen, en de belangrijkste experimentele inhoud uit te werken. In deze studie hebben we een reeks protocollen opgesteld om de fysisch-chemische kenmerken en stabiliteit te bestuderen, de omvang van de toxiciteit van de I-OVA NE voor BEAS-2B-cellen door CCK-8 te bepalen en het antigeen-presenterende vermogen van BEAS-2B-cellen voor het vaccin te observeren met behulp van confocale microscopie, de afgifteprofielen van dit nieuwe nanovaccin in vivo en in vitro te evalueren, en detecteer het beschermende en therapeutische effect van dit vaccin met behulp van een E.G7-OVA tumordragend muismodel.

<table><tbody><tr><td>96-well plates</td><td>Corning Incorporated, USA</td><td>CLS3922</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad 6.0 microplate reader</td><td>Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA</td><td>&nbsp;Bio-Rad 6.0</td><td></td></tr><tr><td>CCK-8 kits</td><td>Dojindo, Japan</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810 R</td><td>Eppendorf, Germany&nbsp;</td><td>5811000398</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>fetal bovine serum (FBS)</td><td>Hyclone (Life Technology, USA)</td><td>SH30088.03</td><td></td></tr><tr><td>FITC-labeled I-OVA</td><td>Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>HF 90/240 Incubator</td><td>Heal Force, Switzerland</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>HPLC&nbsp;</td><td>Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd.</td><td>E2695</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Microscope</td><td>Nikon,Japan</td><td>DSZ5000X</td><td></td></tr><tr><td>IPC-208</td><td>Chong Qing University, China</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>IVIS system&nbsp;</td><td>Caliper Life Science Limited Company</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>JEM-1230 TEM</td><td>JEOL Limited Company of Japan</td><td>1230 TEM</td><td></td></tr><tr><td>Malvern NANO ZS</td><td>Malvern Instruments Ltd., UK</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>MPLA</td><td>&nbsp;Invivogen Lit. Co.</td><td>tlrl-mpla</td><td></td></tr><tr><td>Neomycin Sulfate Ointment</td><td>Shanghai CP General Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td>H31022262</td><td></td></tr><tr><td>OVA257&ndash;264</td><td>Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>Hyclone (Life Technology, USA)</td><td>SH30809.01</td><td></td></tr><tr><td>Synthetic peptide (I-OVA) conjugation of IKVAV-PA</td><td>Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM800 laser scanning confocal fluorescence microscope</td><td>Zeiss, Germany</td><td>Zeiss LSM800</td><td></td></tr></tbody></table>

voorbereiding, kenmerken, toxiciteit en werkzaamheid evaluatie van het nasale zelfgeassembleerde nano-emulsietumorvaccin in vitro en in vivo

Preparation, Characteristics, Toxicity, and Efficacy Evaluation of the Nasal Self-Assembled Nanoemulsion Tumor Vaccine In Vitro and In Vivo

Epitooppeptiden hebben wijdverspreide aandacht getrokken op het gebied van tumorvaccins vanwege hun veiligheid, hoge specificiteit en handige productie; in het bijzonder kunnen sommige MHC I-beperkte epitopen effectieve cytotoxische T-lymfocytenactiviteit induceren om tumorcellen te verwijderen. Bovendien is nasale toediening een effectieve en veilige toedieningstechniek voor tumorvaccins vanwege het gemak en de verbeterde therapietrouw van de patiënt. Epitopeptiden zijn echter niet geschikt voor nasale bevalling vanwege hun slechte immunogeniciteit en gebrek aan leveringsefficiëntie. Nano-emulsies (NEs) zijn thermodynamisch stabiele systemen die kunnen worden geladen met antigenen en rechtstreeks op het neusslijmvliesoppervlak kunnen worden afgeleverd. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) is het kernpentapeptide van laminine, een integrinebindend peptide dat tot expressie wordt gebracht door menselijke respiratoire epitheelcellen. In deze studie werd een intranasaal zelfgeassembleerd epitooppeptide NE-tumorvaccin met het synthetische peptide IKVAV-OVA257-264 (I-OVA ) bereid met een laagenergetische emulgeringsmethode. De combinatie van IKVAV en OVA257-264 kan de opname van antigeen door nasale mucosale epitheelcellen verbeteren. Hier stellen we een protocol op om de fysisch-chemische kenmerken te bestuderen door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), atoomkrachtmicroscopie (AFM) en dynamische lichtverstrooiing (DLS); stabiliteit in aanwezigheid van mucine-eiwit; toxiciteit door onderzoek naar de levensvatbaarheid van de cellen van BEAS-2B-cellen en de neus- en longweefsels van C57BL/6-muizen; cellulaire opname door confocale laserscanmicroscopie (CLSM); vrijgaveprofielen door kleine dieren in vivo in beeld te brengen; en het beschermende en therapeutische effect van het vaccin door gebruik te maken van een E.G7 tumordragend model. We verwachten dat het protocol technische en theoretische aanwijzingen zal bieden voor de toekomstige ontwikkeling van nieuwe T-cel epitoop peptide mucosale vaccins.

Volgens het protocol voltooiden we de voorbereiding en in vitro en in vivo experimentele evaluatie van de nasale tumornanovaccinafgifte. TEM, AFM en DLS zijn effectieve middelen voor de beoordeling van de basiskenmerken van het oppervlaktezetapotentiaal en de deeltjesgrootte van het nanovaccin (figuur 1). BEAS-2B-epitheelcellen zijn een nuttig screeningsmodel voor het in vitro toxiciteitsonderzoek van nasale vaccins (figuur 2A). De mic...

Hier presenteren we gedetailleerde methoden voor de bereiding en evaluatie van het nasale zelfgeassembleerde nano-emulsietumorvaccin in vitro en in vivo.

Voorbereiding, kenmerken, toxiciteit en werkzaamheid Evaluatie van het nasale zelfgeassembleerde nano-emulsietumorvaccin in vitro en in vivo

Epitope peptides have attracted widespread attention in the field of tumor vaccines because of their safety, high specificity, and convenient production; ...

Nieuw nano-emulsievaccin heeft grote voordelen bij ziektetactiektherapie. Deze set-effecten worden geminimaliseerd door eigenschappen zoals uniek tumor chopisme, de identificatie van specifieke tactieken en de lage systemische toxiciteit. We verwachten dat het protocol technische en theoretische aanwijzingen zal bieden voor de toekomstige ontwikkeling van nieuwe T-cel ectype peptide mucosale vaccins.Begin met het mengen van een milligram monofosforollipide A met 100 microliter DMSO. Vortex gedurende vijf minuten en laat het vier uur oplossen bij kamertemperatuur. Voeg kwantitatief TWEEN 80 en I-OVA toe.Meng de componenten en voeg squaleen toe. Voeg vervolgens 100 microliter MPLA-oplossing toe aan het bereide mengsel. Om het nano-emulsievaccin te bereiden, voegt u de gemengde oplossing toe aan waterdruppels op ongeveer 70% van het totale volume en roert u voorzichtig om een transparant en gemakkelijk stromend mengsel te verkrijgen.Voor in vitro assays, begin met het doen herleven van de BEAS2B epitheelcellen. Zet het waterbad aan en stel de temperatuur in op 37 graden Celsius. Ontdooi de bevroren celflacons snel in een waterbad, getemperd op 37 graden Celsius.Na het ontdooien pipet u de cellen snel in een steriele centrifugebuis van 15 milliliter en voegt u twee milliliter van het volledige groeimedium toe. Centrifugeer de buis gedurende vijf minuten op 129 G. Verwijder de supinatant en resuspensie van de cellen in twee milliliter van het volledige groeimedium.Nadat u de cellen opnieuw hebt gecentrifugeerd, verwijdert u de supinatant en voegt u zes milliliter volledig groeimedium toe om de cellen te resuspenderen. Breng de cellen vervolgens over in een T25-kweekkolf en incuber bij 37 graden Celsius in een 5% kooldioxide-incubator. Zodra de celdichtheid 80% tot 90% bereikt, gooit u het kweekmedium weg en wast u de cellen tweemaal met twee milliliter PBS.Voeg een milliliter van 0,25% tripsin toe om de cellen gedurende één tot twee minuten te verteren. Wanneer afronding van de cellen wordt waargenomen, voegt u onmiddellijk vier milliliter van het volledige groeimedium toe om de trypsine te neutraliseren. Meng en zuig de monsters op in een steriele centrifugebuis van 15 milliliter.Centrifugeer de monsters gedurende vijf minuten op 129 G. Verwijder de supinatant en resuspensie de cellen in één milliliter RPMI 1640 compleet medium. Gebruik 20 microliter van de celsuspensie voor het tellen van de cellen en verdun de cellen tot één maal 10 tot de vijfde cel per milliliter.Vervolgens worden de BEAS2B-cellen met een dichtheid van één maal 10 tot de vierde cellen per put in 96 putplaten in 100 microliter RPMI 1640 compleet medium geplaatst en worden de platen gedurende 24 uur voorgeïncubeerd zoals eerder is aangetoond. Aan het einde van de incubatie gooit u de supinatant weg en voegt u 100 microliter RPMI 1640 toe aan elke put van de 96-putplaat. Voeg 100 microliter I-OVA nano-emulsie, I-OVA gemengd met BNE en I-OVA vooraf verdund met een compleet groeimedium in verschillende eindconcentraties met BNE als controle toe en incubeer gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius.Zodra de incubatie is voltooid, verwijdert u het medium en brengt u de plaat over op een donkere plaats. Voeg 90 microliter compleet groeimedium en 10 microliter CCK8-oplossing toe aan elke put van de plaat. Incubeer de plaat gedurende twee uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.Meet de absorptie van elke put op 450 nanometer met behulp van een enzymgelabelde plaatlezer. Gebruik 10 microliter pipetpunten om nasale immunisatie van de muizen uit te voeren met I-OVA, I-OVA plus BNE en I-OVA NE gedurende drie dagen. Gebruik BNE en PBA als experimentele controle.Knip daarna ongeveer drie millimeter dikke monsters van neusweefsels met een schaar en plaats ze in 4% paraformaldehyde. Verwijder de longweefsels en fixeer de neus- en hele longweefsels in 4% paraformaldehyde gedurende 24 uur. TEM en AFM worden gebruikt voor de beoordeling van basiskenmerken van het oppervlaktezetapotentiaal en de deeltjesgrootte van het nanovaccin.Deeltjesgroottes, polydispersiteitsindexen, zetapotentialen en elektroforesemobiliteit van I-OVA NE in musinstabiliteitsanalyses worden getoond. De relatieve levensvatbaarheid van BEAS2B-cellen is meer dan 80% in culturen die gedurende 24 uur worden blootgesteld aan verschillende peptideconcentraties van I-OVA, BNE + I-OVA en I-OVA NE. De I-OVA EN-groep had geen duidelijke mucosale toxiciteit, weefselbeschadiging, bloeding of infiltratie van ontstekingscellen.De epitheliale BEAS2B-cellen vingen meer FITC-gelabeld I-OVA NE op dan die van de wateroplossing. Het effect met aanhoudende afgifte van I-OVA NE in vitro werd geanalyseerd met behulp van het IV-IS-systeem. I-OVA NE-vaccin had een effect met aanhoudende afgifte in vergelijking met de waterige oplossing van I-OVA.In de I-OVA NE-groep is het percentage overlevingstijd hoger in vergelijking met andere groepen en was het tumorvolume aanzienlijk kleiner, wat suggereert dat het een beter preventief beschermingseffect heeft dan de andere groepen. In het therapeutische model was de mediane overlevingstijd significant verschillend tussen verschillende groepen. Het tumorvolume van de I-OVA NE-groep was significant kleiner dan dat van de I-OVA-groep.Het gelijkmatig roeren van het mengsel is belangrijk in deze procedure. Anders vermindert het de efficiëntie van nanovaccins.

preparation-characteristics-toxicity-efficacy-evaluation-nasal-self

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates the production of nanoemulsion tumor vaccines. The stable oil reservoir depots carrying synthetic peptides and adjuvants are produced by low-energy nanoemulsion, offering significant promise for tumor immunotherapy.

Preparation of a Nanoemulsion Adjuvant Vaccine

We beschrijven beeldvorming van het hele dier en op flowcytometrie gebaseerde technieken voor het bewaken van de uitbreiding van antigeenspecifieke CD8+ T-cellen als reactie op immunisatie met nanodeeltjes in een muizenmodel voor vaccinatie.

Whole-dierlijke Imaging en Flowcytometrische technieken voor analyse van antigeen-specifieke CD8 + T cel reacties na Nanoparticle Vaccinatie

Het slechte begrip van de in vivo prestaties van nanomedicijnen belemmert hun klinische translatie. Procedures om het in vivo gedrag van kanker nanomedicijnen op systemisch, weefsel-, enkelcellig en subcellulair niveau te evalueren bij tumordragende immuuncompetente muizen worden hier beschreven. Deze aanpak kan onderzoekers helpen om veelbelovende kanker nanomedicijnen te identificeren voor klinische translatie.

A Comprehensive Procedure voor het evalueren<em&gt; In Vivo</em&gt; Prestaties of Cancer Nanomedicines

Experimentele procedures voor de verdere winning van lymfatische weefsels voor het testen van lymfoïde dendritische cel activatie worden beschreven na behandeling van een immuniteitsverhoging nanomateriaal.

Immunostimulerende Agent evaluatie: Lymfoïde weefsel extractie en injectie Route-afhankelijke dendritische cel activeren

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde workflow voor de generatie en ex vivo karakterisering van oncolytische virussen voor expressie van immunomodulators, met behulp van mazelen virussen bispecifieke T cel engagers codering als een voorbeeld. Toepassing en aanpassing aan andere vector platforms en transgenen zal de ontwikkeling van nieuwe immunovirotherapeutics voor klinische vertaling versnellen.

Paramyxovirussen voor Tumor-gerichte immunomodulatie: ontwerp en evaluatie Ex Vivo

Er wordt een standaardprotocol beschreven om de antitumoractiviteit en bijbehorende toxiciteit van IL-1α te bestuderen in een syngene muismodel van HNSCC.

Evaluatie van de in vivo antitumoractiviteit van polyanhydride IL-1α nanodeeltjes

Dit manuscript beschrijft hoe in vivo immunogeniciteit van tumorcel-afgeleide extracellulaire blaasjes (EV's) kunnen worden beoordeeld met behulp van flowcytometrie. EV's afgeleid van tumoren die door behandeling geïnduceerde immunogene celdood ondergaan, lijken bijzonder relevant in tumorimmunosurveillance. Dit protocol is een voorbeeld van de beoordeling van door oxaliplatine geïnduceerde immunostimulerende tumor-EV's, maar kan worden aangepast aan verschillende instellingen.

In vivo Immunogeniciteitsscreening van tumor-afgeleide extracellulaire blaasjes door flowcytometrie van milt-T-cellen

Hier wordt een eenvoudig protocol gepresenteerd voor het produceren van mRNA-nanodeeltjes op basis van poly (bèta-aminoester) polymeren, eenvoudig op maat te maken door het ingekapselde mRNA te veranderen. De workflow voor het synthetiseren van de polymeren, de nanodeeltjes en hun in vitro essentiële karakterisering worden ook beschreven. Een proof-of-concept met betrekking tot immunisatie wordt ook toegevoegd.

Synthese en karakterisering van mRNA-geladen poly (bèta-aminoesters) nanodeeltjes voor vaccinatiedoeleinden

Het protocol presenteert gedetailleerde methoden om te evalueren of de nano-emulsie ophiopogonine D adjuvans effectieve cellulaire immuunresponsen bevordert.

In vitro Cellulaire activiteit Evaluatie van het nano-emulsievaccin Adjuvans Ophiopogonine D

Het huidige protocol bereidt en evalueert de fysieke eigenschappen, immuunrespons en in vivo beschermend effect van een nieuw nano-emulsie-adjuvans vaccin.

Evaluatie van de immuunrespons van een nano-emulsie-adjuvansvaccin tegen methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) -infectie

In dit protocol hebben we een kationisch nano-emulsie-ingekapseld retinoïnezuur (RA) ontwikkeld dat kan worden gebruikt als adjuvans om antigeenspecifieke systemische en mucosale reacties te bevorderen. Door de door de FDA goedgekeurde RA aan de nano-emulsie toe te voegen, werd antigeenspecifiek sIgA gepromoot in de vagina en dunne darm na intramusculaire injectie van de nano-emulsie.

Kationisch nano-emulsie-ingekapseld retinoïnezuur als adjuvans ter bevordering van OVA-specifieke systemische en mucosale reacties

Leer de voorbereiding en evaluatie van een neusvaccin met nano-emulsietechnologie voor tumortherapie. Dit protocol toont aan hoe onderzoekers de werkzaamheid en toxiciteit in vitro en in vivo kunnen beoordelen.

Voorbereiding, kenmerken, toxiciteit en werkzaamheid Evaluatie van het nasale zelfgeassembleerde nano-emulsietumorvaccin in vitro en in vivo (Video) | JoVE Journal

Voorbereiding, kenmerken, toxiciteit en werkzaamheid Evaluatie van het nasale zelfgeassembleerde nano-emulsietumorvaccin in vitro en in vivo

Meer video's verkennen