Voorbereiding, kenmerken, toxiciteit en werkzaamheid Evaluatie van het nasale zelfgeassembleerde nano-emulsietumorvaccin in vitro en in vivo

Nieuw nano-emulsievaccin heeft grote voordelen bij ziektetactiektherapie. Deze set-effecten worden geminimaliseerd door eigenschappen zoals uniek tumor chopisme, de identificatie van specifieke tactieken en de lage systemische toxiciteit. We verwachten dat het protocol technische en theoretische aanwijzingen zal bieden voor de toekomstige ontwikkeling van nieuwe T-cel ectype peptide mucosale vaccins.

Begin met het mengen van een milligram monofosforollipide A met 100 microliter DMSO. Vortex gedurende vijf minuten en laat het vier uur oplossen bij kamertemperatuur. Voeg kwantitatief TWEEN 80 en I-OVA toe.

Meng de componenten en voeg squaleen toe. Voeg vervolgens 100 microliter MPLA-oplossing toe aan het bereide mengsel. Om het nano-emulsievaccin te bereiden, voegt u de gemengde oplossing toe aan waterdruppels op ongeveer 70% van het totale volume en roert u voorzichtig om een transparant en gemakkelijk stromend mengsel te verkrijgen.

Voor in vitro assays, begin met het doen herleven van de BEAS2B epitheelcellen. Zet het waterbad aan en stel de temperatuur in op 37 graden Celsius. Ontdooi de bevroren celflacons snel in een waterbad, getemperd op 37 graden Celsius.

Na het ontdooien pipet u de cellen snel in een steriele centrifugebuis van 15 milliliter en voegt u twee milliliter van het volledige groeimedium toe. Centrifugeer de buis gedurende vijf minuten op 129 G. Verwijder de supinatant en resuspensie van de cellen in twee milliliter van het volledige groeimedium.

Nadat u de cellen opnieuw hebt gecentrifugeerd, verwijdert u de supinatant en voegt u zes milliliter volledig groeimedium toe om de cellen te resuspenderen. Breng de cellen vervolgens over in een T25-kweekkolf en incuber bij 37 graden Celsius in een 5% kooldioxide-incubator. Zodra de celdichtheid 80% tot 90% bereikt, gooit u het kweekmedium weg en wast u de cellen tweemaal met twee milliliter PBS.

Voeg een milliliter van 0,25% tripsin toe om de cellen gedurende één tot twee minuten te verteren. Wanneer afronding van de cellen wordt waargenomen, voegt u onmiddellijk vier milliliter van het volledige groeimedium toe om de trypsine te neutraliseren. Meng en zuig de monsters op in een steriele centrifugebuis van 15 milliliter.

Centrifugeer de monsters gedurende vijf minuten op 129 G. Verwijder de supinatant en resuspensie de cellen in één milliliter RPMI 1640 compleet medium. Gebruik 20 microliter van de celsuspensie voor het tellen van de cellen en verdun de cellen tot één maal 10 tot de vijfde cel per milliliter.

Vervolgens worden de BEAS2B-cellen met een dichtheid van één maal 10 tot de vierde cellen per put in 96 putplaten in 100 microliter RPMI 1640 compleet medium geplaatst en worden de platen gedurende 24 uur voorgeïncubeerd zoals eerder is aangetoond. Aan het einde van de incubatie gooit u de supinatant weg en voegt u 100 microliter RPMI 1640 toe aan elke put van de 96-putplaat. Voeg 100 microliter I-OVA nano-emulsie, I-OVA gemengd met BNE en I-OVA vooraf verdund met een compleet groeimedium in verschillende eindconcentraties met BNE als controle toe en incubeer gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius.

Zodra de incubatie is voltooid, verwijdert u het medium en brengt u de plaat over op een donkere plaats. Voeg 90 microliter compleet groeimedium en 10 microliter CCK8-oplossing toe aan elke put van de plaat. Incubeer de plaat gedurende twee uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.

Meet de absorptie van elke put op 450 nanometer met behulp van een enzymgelabelde plaatlezer. Gebruik 10 microliter pipetpunten om nasale immunisatie van de muizen uit te voeren met I-OVA, I-OVA plus BNE en I-OVA NE gedurende drie dagen. Gebruik BNE en PBA als experimentele controle.

Knip daarna ongeveer drie millimeter dikke monsters van neusweefsels met een schaar en plaats ze in 4% paraformaldehyde. Verwijder de longweefsels en fixeer de neus- en hele longweefsels in 4% paraformaldehyde gedurende 24 uur. TEM en AFM worden gebruikt voor de beoordeling van basiskenmerken van het oppervlaktezetapotentiaal en de deeltjesgrootte van het nanovaccin.

Deeltjesgroottes, polydispersiteitsindexen, zetapotentialen en elektroforesemobiliteit van I-OVA NE in musinstabiliteitsanalyses worden getoond. De relatieve levensvatbaarheid van BEAS2B-cellen is meer dan 80% in culturen die gedurende 24 uur worden blootgesteld aan verschillende peptideconcentraties van I-OVA, BNE + I-OVA en I-OVA NE. De I-OVA EN-groep had geen duidelijke mucosale toxiciteit, weefselbeschadiging, bloeding of infiltratie van ontstekingscellen.

De epitheliale BEAS2B-cellen vingen meer FITC-gelabeld I-OVA NE op dan die van de wateroplossing. Het effect met aanhoudende afgifte van I-OVA NE in vitro werd geanalyseerd met behulp van het IV-IS-systeem. I-OVA NE-vaccin had een effect met aanhoudende afgifte in vergelijking met de waterige oplossing van I-OVA.

In de I-OVA NE-groep is het percentage overlevingstijd hoger in vergelijking met andere groepen en was het tumorvolume aanzienlijk kleiner, wat suggereert dat het een beter preventief beschermingseffect heeft dan de andere groepen. In het therapeutische model was de mediane overlevingstijd significant verschillend tussen verschillende groepen. Het tumorvolume van de I-OVA NE-groep was significant kleiner dan dat van de I-OVA-groep.

Het gelijkmatig roeren van het mengsel is belangrijk in deze procedure. Anders vermindert het de efficiëntie van nanovaccins.