Een flowcytometrie-gebaseerde celoppervlakeiwitbindingstest voor het beoordelen van selectiviteit en specificiteit van een antikanker aptamer

Dit protocol zal onderzoekers die nieuw zijn in het werken met aptamers helpen om ze in hun projecten te kunnen gebruiken en ook om de individuele kleine stappen te begrijpen die nodig zijn om het protocol te voltooien. Aptameren zijn zeer veelzijdig en dit protocol laat zien hoe gemakkelijk en eenvoudig ze zijn in een immunofenotyperingstest. Aptameren kunnen worden gebruikt voor zowel diagnostische als therapeutische toepassingen.

Dit protocol is de eerste stap die wordt ondernomen om hun specificiteit en gevoeligheid te bevestigen. Hoewel deze specifieke test kleuring van één celoppervlakreceptor aantoont, kunnen aptameren heel gemakkelijk worden gebruikt voor multiparametrische flowcytometrie, wat een hoog niveau van fenotypische kennis oplevert. De belangrijke aspecten van het werken met aptameren zijn ervoor te zorgen dat ze correct worden gevouwen voor gebruik, en ook dat de buffer en de ionische sterkteomstandigheden hetzelfde zijn als toen ze werden geselecteerd.

Nadat u de media in de kolf hebt verzameld en weggegooid, voegt u drie milliliter PBS toe en verspreidt u deze over de cellen. Na het toevoegen van een milliliter van 0,25% Trypsin-EDTA aan elke kolf, incubeer gedurende vijf tot 10 minuten bij 37 graden Celsius en visualiseer de loslating van cellen onder een microscoop. Voeg vervolgens een milliliter volledig medium toe aan de cellen en pipetteer de cellen op en neer om een enkele celsuspensie te maken.

Pipetteer de cellen in een geschikte buis en centrifugeer gedurende vijf minuten op 200 G. Nadat u het supernatant hebt weggegooid, resuspenseert u de cellen in één milliliter vers medium en telt u de cellen met behulp van trypanblauwe kleuring door een bepaald volume celsuspensie te verdunnen met trypanblauw. Verdeel ongeveer 15 microliter van het mengsel tussen een hemocytometer en een afdekglas om de cellen te tellen.

Verzamel het vereiste aantal cellen en zorg ervoor dat er honderdduizend cellen per testmonster zijn. Incubeer vervolgens de cellen bij 37 graden Celsius gedurende twee uur om de stabilisatie van het eiwit van belang op het celmembraan mogelijk te maken na enzymatische onthechting. Na de incubatie van twee uur centrifugeer je de cellen gedurende vijf minuten bij 500 G.

Nadat u het supernatant hebt weggegooid, resuspenseert u de cellen in 500 microliter blokkerende buffer. Incubeer de cellen op vier graden Celsius gedurende 30 minuten met intermitterend mengen. Tijdens deze incubatie van 30 minuten voert u aptamervouwing uit door tweemaal de concentraties aptameren te bereiden zoals beschreven in het manuscript.

Meng en incubeer vervolgens de aptameren met de thermocycler-machine volgens de vereiste vouwomstandigheden, terwijl u ervoor zorgt dat de aptameren tegen licht worden beschermd. Na de incubatie van 30 minuten, centrifugeer de cellen zoals eerder aangetoond en verwijder het supernatant. Voeg vervolgens een milliliter wasbuffer toe en centrifugeer de cellen opnieuw.

Na het verwijderen van het supernatant, resuspenseren de cellen in een geschikt volume van de bindingsbuffer. Pipetteer vervolgens 50 microliter van de geresuspendeerde cellen in elke put van een ijskoude 96 goed zwarte plaat. Pipetteer vervolgens 50 microliter van de aptameren op een volume cellen van 50 microliter, meng en incubeer in duisternis bij vier graden Celsius gedurende 30 minuten.

Na het centrifugeren en verwijderen van het supernatant, resuspenseer de pellet voorzichtig in wasbuffer en centrifugeer opnieuw op 500 G gedurende vijf minuten. Resuspenseer vervolgens in 100 microliter wasbuffer voor flowcytometrische analyse terwijl u de wasstap tweemaal herhaalt. Schakel eerst de flowcytometer in en vervolgens de computer.

Open vervolgens de flowcytometrie-analysesoftware, log in op het programma en voer onder het tabblad cytometer vloeistof opstarten uit. Als u een nieuw experiment wilt maken, klikt u op het tabblad Experiment op nieuwe map en geeft u het mapslash-experiment de juiste naam. Klik op de nieuwe map om deze te markeren.

Klik vervolgens op het tabblad Experiment opnieuw op nieuw experiment en geef het experiment de juiste naam. Als u het eerste monsterslash-exemplaar wilt toevoegen, klikt u op het tabblad Experiment op nieuw exemplaar en geeft u het specimen de juiste naam. Als u een buismonster wilt toevoegen, markeert u het monster en klikt u onder het tabblad Experiment op nieuwe buis.

Voeg vervolgens het juiste aantal buizen en naam toe. Als u de vereiste grafieken wilt voorbereiden, opent u onder een werkbladtabblad een nieuw werkblad. Zodra het nieuwe werkbladvenster verschijnt, maakt u een puntvlekgrafiek van zijverstrooiing versus voorwaartse spreiding om de populatie van belang te selecteren.

Maak een puntvlekgrafiek van voorwaartse spreidingshoogte versus voorwaartse spreidingsgebied om de enkele celpopulatie te selecteren. Bereid vervolgens een histogram voor van het aantal gebeurtenissen tegen de fluorofoor van belang. Zorg ervoor dat het acquisitiedashboard voor het besturen van de monsteracquisitie, inspecteur en cytometer om spanningsparameters aan te passen, evenals het werkblad met alle grafieken, open is voordat u flowcytometrie start.

Voer eerst de onbehandelde cellen uit. Zorg ervoor dat de pijl die naar de buis wijst groen is. Als deze pijl niet groen is, klikt u op de pijl om deze groen te maken.

Breng met behulp van een uppipet elk monster over van de 96 putzwarte plaat naar een flowcytometriebuis. Kies op het acquisitiedashboard een geschikt aantal gebeurtenissen dat u wilt vastleggen, wijzig het debiet in laag en klik op Gegevens verkrijgen. Pas de spanning aan voor de FSC- en SCC-parameters en zorg ervoor dat de celpopulatie gecentraliseerd is binnen de dot plot en dat er geen cellen een van beide assen van de grafiek raken om te voorkomen dat de cellen van belang verloren gaan.

Definieer de eerste poort door de populatie van belang in een voor- en zijwaarts verspreid dichtheidsperceel te identificeren en te selecteren, terwijl het puin, dat de populatie vormt met het laagste voorwaartse verspreidingssignaal, wordt uitgesloten. Definieer de tweede poort door doubletcelpopulaties uit te sluiten, omdat doubletcellen de resultaten en conclusies aanzienlijk beïnvloeden. Verhoog de acquisitiesnelheid naar gemiddeld of hoog om de monsters sneller te analyseren, maar overschrijd niet meer dan 200 tot 300 gebeurtenissen per seconde.

Klik vervolgens op recordgegevens. Nadat u de spanning en gating hebt aangepast en de gegevens hebt vastgelegd, haalt u het monster eruit en klikt u op Volgende buis. Voeg het volgende monster in en herhaal de registratiegegevens voor alle controle- en testmonsters.

Zodra alle gegevens zijn verzameld, wast u de flowcytometer door drie buizen van 50% bleekmiddel, FACSRinse en ultrapuur water te laten lopen, elk gedurende vijf minuten met een hoge stroomsnelheid. Klik vervolgens in het vervolgkeuzemenu cytometer op fluidics afsluiten. Exporteer het resultaat als fsc-bestanden naar een USB-station om over te zetten.

Analyseer ze met behulp van de analysesoftware door op de nieuwe knop te drukken om een nieuw document en venster te maken om de analyse af te handelen en sleep de voorbeeldbestanden naar het nieuwe venster. Dubbelklik om het niet-gekleurde monster te openen. Om de eencellige populatie te gateen, kiest u de P1-populatie en dubbelklikt u op de P1-populatie om een FSCH versus FSCA-grafiek te maken.

Dubbelklik op de gated enkele cellen om een histogram van gebeurtenissen tegen het gebruikte fluorochroom te maken. Selecteer in het oorspronkelijke venster P1 en enkele cellen en sleep ze naar alle monsters zodat alle monsters nu dezelfde gating bevatten. Klik vervolgens op de knop lay-outeditor om het lay-outvenster te openen en sleep twee voorbeelden over elkaar om een overlay-histogram te maken.

In EpCAM-positieve MDA-MB-231-cellen toont het overlappen van de histogrammen die cellen vertegenwoordigen die zijn behandeld met TEPP en TENN aan dat de met TEPP behandelde cellen naar rechts zijn verschoven, vergeleken met de met TENN behandelde cellen, wat aantoont dat de binding van het TEPP-aptamer optreedt aan het eiwit van belang. Bij negatieve controle weerspiegelen HEK 293T-cellen die histogrammen van TEPP en TENN overlappen geen verschuiving die aangeeft dat in EpCAM-expressiecellen TEPP de EpCAM-aptamer is die aan zijn receptor is bevestigd. En bovendien werd er geen binding waargenomen in EpCAM-negatieve cellen, wat de selectiviteit en specificiteit van het ontwikkelde aptamer bevestigt.

Zorg ervoor dat de aptameren worden beschermd tegen licht, dat de aptameren en cellen op de plaat worden gemengd en dat de juiste spanningen op de flowcytometer worden ingesteld. Dit is sterk afhankelijk van toekomstige toepassingen voor de aptameren. We zijn bijvoorbeeld gericht op medicijnafgifte.

Dus de volgende stap voor ons zou zijn om te beoordelen of de aptameren worden geïnternaliseerd met behulp van fluorescerende microscopie. Dit protocol heeft aangetoond hoe gemakkelijk het is voor aptameren om monoklonale en polyklonale antilichamen te vervangen in immunofenotyperingstests.