Een minimaal invasieve, nauwkeurige en efficiënte techniek voor intrathymische injectie bij muizen

Het protocol biedt een nauwkeurig, veilig en efficiënt niet-chirurgisch alternatief voor traditionele chirurgische en blinde injectiemethoden. Het is ook de meest nauwkeurige injectietechniek voor atrofie thymus bij oudere of immunodeficiënte muizen. Het belangrijkste voordeel is een minimaal stressvolle injectieprocedure die zeer veilig en nauwkeurig is, maar ook snel, waardoor grootschalige experimenten mogelijk zijn zonder gegevenscompromittering door chirurgische stressgerelateerde immunosuppressie.

Het handhaven van de uitlijning van de naald en transducer terwijl deze door de borstwand wordt geschoven, vergt enige oefening. We raden daarom aan om samen te werken met een ervaren interventieradioloog om injecties uit te voeren of training te geven. Shaina Anuncio, een technicus van mijn laboratorium, zal helpen om de procedure te demonstreren.

Breng om te beginnen een dunne laag ontharingscrème aan op het voorste borstgebied van de muizen gedurende minder dan een minuut om de vacht te verwijderen. Gebruik een natte papieren handdoek om de crème en losse vacht te verwijderen. Bevestig de juiste verdovingsdiepte door niet te reageren op de achterpootknel.

Breng oogheelkundige zalf aan op beide ogen om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen. Plaats één muis tegelijk in rugligging op het verwarmde platform van het echografiestation voor kleine dieren met de neuskegel op zijn plaats. Bevestig de muis aan het podium met medische plakband aan de achter- en voorpoten.

Desinfecteer de bontvrije bovenste thoraxhuid met behulp van een chloorhexidinegluconaatapplicator. Activeer de lineaire sonde met de hoogste frequentie die beschikbaar is. Meestal is de sonde met de hoogste ruimtelijke resolutie voor de grootte van het dier dat wordt afgebeeld.

Activeer de sonde door op de bijbehorende knop te tikken na het opstartscherm. Om de ultrasone instellingen voor beeldvorming en injectie te optimaliseren, past u de diepte van het gezichtsveld aan op een geschikte grootte voor het doeldier door de verticaal georiënteerde schuifregelaars aan de rechterkant van het scherm aan te passen. Pas de grijsschaalversterking aan door de knop langs de horizontale balk aan de onderkant van het scherm te schuiven.

Pas vervolgens de focuszone aan het verwachte niveau van de thymus aan. Breng ongeveer één milliliter ultrasone gel aan op het oppervlak van de transducer terwijl deze rechtop staat, rustend in de houder van het echoapparaat of in de handen van een assistent. Om een klein steriel veld naast het verwarmde platform te bereiden, leegt u een steriele sondedeksel, elastiek, steriele handschoenen en steriele ultrasone gel op het steriele veld.

Trek vervolgens de steriele handschoenen aan. Plaats de steriele sondeklep voorzichtig over de ultrasone transducer en gel. Om de steriliteit te behouden, raakt u alleen de steriele hoes aan.

Schuif de steriele rubberen band over het sondedeksel om deze op zijn plaats te houden. Plaats twee tot drie milliliter steriele ultrasone gel op de transducer. Plaats de ultrasone gel-topped probe verticaal op het gedesinfecteerde deel van de voorste borstwand van de muis voor de eerste beeldvorming, met behoud van steriliteit.

Bekijk en optimaliseer het echografiebeeld zoals eerder gedemonstreerd. Om de voorste borst van de muis in een dwarsvlak te scannen, houdt u de transducer verticaal en beweegt u deze op en neer van de nek naar de buik in een penseelachtige of veegbeweging. Met het hart gecentreerd in het gezichtsveld, veegt u de transducer iets naar de nek.

Let op de twee ronde gepaarde zwarte structuren aan weerszijden van de bovenste borst. Lokaliseer met behulp van de ultrasone sonde het breedste deel van de thymus, wat meestal de ideale doelplaats voor injectie is. Anticipeer op een horizontaal naaldtraject op de gekozen locatie en noteer waar de belangrijkste bloedvaten zich op deze locatie bevinden.

Deze vaten moeten tijdens de injectie worden vermeden. De bloedvaten zullen hypoechoïsche pulsatiele structuren zijn. Als u het niet zeker weet, activeert u de dopplermodus in kleur door op de kleurknop op het scherm te tikken om te controleren op stroming in de vaten.

Houd de transducer in de ene hand en een 30-gauge insulinenaald met 10 microliter injectaat in de andere. Om het injectieproces te starten, verplaatst u de transducer lateraal, zodat de thymus uit het midden in het ultrasone gezichtsveld ligt. Zorg ervoor dat de andere kant van het gezichtsveld voornamelijk bestaat uit ultrasone gel en niets anders.

Plaats de punt van de naald in de gel onder de transducer en beweeg de naald langzaam totdat deze naast het huidoppervlak wordt gevisualiseerd. Terwijl u de naald continu in beeld brengt onder echografie, steekt u de naald in de thymusklier met een percutaan traject weg van de bloedvaten. Gebruik een kruis thymus horizontaal traject om de naaldpunt in de thymuskwab te plaatsen die contralateraal is voor de ingangsplaats.

Zodra de naaldpunt zich in het gewenste deel van de thymus bevindt, injecteert u snel de inhoud van de 30-gauge spuit met behulp van echografische visualisatie. Om de spuit te stabiliseren tijdens het inbrengen en injecteren van de naald, houdt u de spuit tussen de duim en de derde vinger en bedient u de zuiger van de spuit met de wijsvinger. Verwijder de naald nadat alle inhoud is gedeponeerd.

Bij jonge muizen was het identificeren van de thymusklier eenvoudig vanwege de grote omvang van de klier. Het was uitdagender bij oudere of immunodeficiënte muizen. Het was echter nog steeds zeer haalbaar met moderne echoapparatuur.

Succesvolle injectie werd opgemerkt wanneer de naald geen kritieke structuren doorkruiste, zoals het hart, de aorta of een van de inferieure vena cavae. De naaldpunt werd tijdens de injectie op de doellocatie gevisualiseerd, wat de intrathymische afzetting bevestigde. De intrathymische locatie van de injectie werd bevestigd met Luciferine als injectaat in luciferase transgene muizen.

Deze werden onmiddellijk geëvalueerd met bioluminescentiebeeldvorming, die de juiste locatie van de injectie bevestigde zonder het dier op te offeren. Als alternatief werd Trypan Blue geïnjecteerd als een visuele marker van de injectieplaats en de nauwkeurigheid van de injectie met behulp van ex vivo met obductie. Onze groep heeft deze techniek gebruikt voor verschillende grote studies, waaronder onderzoek naar kankerimmunotherapie, gebaseerd op de injectie van genetisch gemodificeerde voorlopercellen, en om de thymusfunctie bij immunodeficiënte muizen te verbeteren.