Murine fecale isolatie en microbiota transplantatie

Hier hebben we een protocol beschreven om anderen te begeleiden bij het onderzoeken van de mechanismen van dysbiose bij ziekte, van het verzamelen van fecale monsters tot het gebruik van de Zwitserse rolmethode om veranderingen in de darm te bestuderen. Om te beginnen, besproei de borst en zijkanten van de geëuthanaseerde muis met 70% ethanol en open voorzichtig de huid en peritoneale holte om het maagdarmkanaal bloot te leggen. Isoleer de blindedarm en gebruik een steriele chirurgische schaar om deze doormidden te knippen.

Stel de blindedarm kort bloot en snijd 0,5 centimeter proximaal van het ileum en 0,5 centimeter distaal op de kruising met de dikke darm. Breng de geïsoleerde blindedarm over op een steriele petrischaal. Gebruik een steriele spatel om de cecale inhoud over te brengen in steriele buizen en bewaar de aliquots in een vriezer van 80 graden Celsius.

Suspensie verse of eerder bevroren fecale pellets opnieuw in steriele zoutoplossing in een verhouding van 1 tot 20 en vortex totdat ze gehomogeniseerd zijn. Laat het homogenaat door een nylonfilter met 30 micrometer poriën gaan om grote deeltjes te verwijderen. Centrifugeer gedurende vijf minuten op 79G en verzamel het supernatant om te gebruiken voor transplantatie.

Orale maagsonde 100 microliter van de slurry per kiemvrije ontvangende muis gedurende drie opeenvolgende dagen, gevolgd door een maagsonde om de drie dagen gedurende twee weken. Plaats de muis voorzichtig in beperkingen op de voorverwarmde muishouder en laat de staart buiten. Plak de bovenkant voorzichtig af zonder erin te knijpen om de muis niet te belasten.

Laat de muis in de houder rusten en plaats hem drie tot vijf minuten op het machineplatform van de staartmanchet, bedekt met een vel om te acclimatiseren. Verzamel ten minste drie rondes systolische drukmetingen met behulp van staartmanchetplethysmografie en gemiddelde van de metingen van alle rondes voor een gemiddelde systolische druk voor elk dier. Aseptisch verzamelen van cecale inhoud van de geëuthanaseerde muis.

Om de darmen en andere weefsels te oogsten, lokaliseert u het weefsel in de muis en snijdt u ze met een schaar om de rol van de darmmicrobiota in de cardiometabole gezondheid te onderzoeken. Ontleed op de eerste dag de muizendarm van de anale kant naar de maagzijde. En plaats het geheel van het geïsoleerde maagdarmkanaal in een petrischaaltje met PBS.

Trek voorzichtig het proximale uiteinde van het maaguiteinde en verwijder het omliggende vet en bindweefsel met de hand. Isoleer de dunne darm en maak een Z-type zigzag met elke lengte. Snijd vervolgens om de twaalfvingerige darm, het jejunum en het ileum te verkrijgen.

Isoleer de dikke darm door het gedeelte van de darm onder de blindedarm te snijden. Snijd de twaalfvingerige darm, het jejunum, het ileum en de dikke darm. Gebruik een spuit en een naald met een balpunt om de darm voorzichtig door te spoelen en te wassen met PBS zonder de darm te scheuren.

Plaats de darm op filterpapier en label het papier met de naam van de sectie en vervolgens P in de linkerbovenhoek voor proximaal of D voor distaal in de linkerbenedenhoek. Knip de darm in de lengterichting af met een schaar met de balpunt. Open de darm op het filterpapier en was met meer PBS als dat nodig is.

Sandwich de darm tussen twee filterpapiertjes en nieten het filterpapier op vier punten of hoeken in de buurt van de darm. Week in 10% formaline neutrale bufferoplossing en schud met behulp van een platform rocker bij vijf rpm 's nachts bij kamertemperatuur. Verwarm op dag twee de bereide 2% agarose in gedestilleerd water met een roerstaaf in een bekerglas bedekt met aluminiumfolie.

Om de weefsels op te halen, stript u het bovenste filterpapier en rolt u de darm van de proximale kant zodat de proximale kant eerst naar binnen gaat en rolt u naar binnen zodat het lumen ook binnen op de dia is. Pin met een 30-gauge naald of twee als dat nodig is. Zuig een milliliter agarose op met behulp van wegwerp graduele transferpipetten en giet de agarose op een gerold darmgedeelte op een plat oppervlak terwijl luchtbellen in de weefsels worden vermeden.

Nadat de agarose is afgekoeld en stolt, gebruik je een scheermesje om de extra agarose rond het weefselgedeelte te trimmen. Plaats ten slotte de darmsecties in weefselverwerkings- of inbeddingscassettes en week ze in 70% ethanol bij vier graden Celsius. De schatting van de biodiversiteit van soorten in het cecale gehalte verkregen van muizen op normale zoutdiëten en zoutrijke diëten wordt hier getoond.

Veranderingen in de darmmicrobiota als reactie op het hoge zoutgehalte omvatten een afname van de bacteriële biodiversiteit. Niet-metrische multidimensionale schaling laat zien dat de bacteriën van normale zout- en zoutrijke dieetmuizen afzonderlijke clusters vormen. Een hoog zoutgehalte wordt geassocieerd met een verhoogde verhouding tussen firmicutes en bacteroidetes.

Fecale microbiotatransplantatie van muizen met een hoog zoutgehalte maakt kiemvrije muizen vatbaar voor angiotensine II-geïnduceerde hypertensie. Het overbrengen van door zout geïnduceerde dysbiotische darmmicrobiota was geassocieerd met een significant verhoogde systolische druk bij kiemvrije muizen in vergelijking met muizen die normale zoutdarmmicrobiota kregen. De representatieve afbeeldingen tonen apolipoproteïne A-I-kleuring in ilia verkregen van muizen die hyperlipidemie hadden zonder of met proteïnurie.

Dit protocol stemt stappen om succesvolle FMT te bereiken af op belangrijke experimentele overwegingen voor zowel menselijke als knaagdierdonoren.