Name: Hersenventrikelmicro-injecties van lipopolysaccharide in larvale zebravissen om neuro-inflammatie en neurotoxiciteit te beoordelen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-23T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Leer hersenventrikelmicro-injecties van lipopolysaccharide in larvale Danio rerio om neuro-inflammatie en neurotoxiciteit te beoordelen. Deze methode maakt in vivo beeldvorming en snelle evaluatie van anti-neuro-inflammatoire geneesmiddelen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door subsidies van het Science and Technology Development Fund (FDCT) van Macao SAR (Ref. No. FDCT0058/2019/A1 en 0016/2019/AKP), Onderzoekscommissie, Universiteit van Macau (MYRG2020-00183-ICMS en CPG2022-00023-ICMS) en National Natural Science Foundation of China (nr. 81803398).

AB wild-type zebravis en transgene zebravislijnen elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP en mpo:EGFP werden verkregen van het Institute of Chinese Medical Sciences (ICMS). Ethische goedkeuring (UMARE-030-2017) voor de dierproeven werd verleend door de Animal Research Ethics Committee, University of Macau, en het protocol volgt de richtlijnen voor institutionele dierverzorging.
1. Zebravis embryo en larvale veehouderij
<ol><li>Genereer zebravisembryo's (200-300 embryo's per paring) door natuurlijke paarsgewijze paring zoals eerder gemeld28.</li>
	<li>Bereid eierwater (E3) middelgrote bouillon (60×) door 34,8 g NaCl, 1,6 g KCl, 5,8 g CaCl2·2H 2 O en 9,78 g MgCl 2·6H2 O inddH2O op te lossen tot een eindvolume van 2 L en stel de pH in op 7,2 met NaOHen HCl. Om de bedrijfsconcentratie van het E3-medium (1×) te bereiden, verdunt u de bouillon 60 maal in ddH2O. Bewaren bij 28,5 °C wanneer deze niet in gebruik is.</li>
	<li>Gebruik een plastic transferpipet om de zebravisembryo's over te brengen naar een schaal met E3-medium. Kweek de embryo's bij 28,5 °C in een couveuse en volg hun ontwikkeling en gezondheid. Verwijder dode embryo's en vervang onreine E3 medium door vers medium per dag.</li>
	<li>Gebruik voor zebravisbeeldvormingsexperimenten een plastic transferpipet om 0-2 uur na de bevruchting (hpf) embryo's (ongeveer 200 eieren) te verzamelen in ongeveer 15 ml 1× E3-medium dat 0,003% N-fenylthiourea (PTU) bevat. OPMERKING: PTU kan de vorming van melanoforen remmen tijdens embryogenese29. Behandeling van embryo's met PTU tijdens embryogenese kan de signaaldetectie in microscopie of expressie van fluorescentie verbeteren30.</li>
	<li>Onderhoud de zebravisembryo's onder de bovenstaande omstandigheden totdat embryo's het gewenste ontwikkelingslarvestadium bereiken.</li>
</ol>2. Voorbereiden op micro-injectie
<ol><li>Bereid u voor op de injectie door glazen haarvaten te trekken met behulp van een micropipettetrekker (zie Materiaaltabel), volgens het vijfstappenprotocol voor het trekken van glazen capillaire buisjes (tabel 1).</li>
	<li>Open de punt van de naald (dunne glazen haarvaten [3,5 inch] met gloeidraad, OD 1,14 mm) onder een hoek met behulp van een tang (figuur 2A).</li>
	<li>Vul de naald met 0,1 ml minerale olie om ervoor te zorgen dat er geen bubbels zijn.</li>
	<li>Verwijder de schroefdop van de stalen naald van het microinjectieapparaat. Lijn het glazen naaldgat uit met de stalen naald en draai vervolgens de schroefdop vast. Monteer het geladen naaldmicro-injectieapparaat in een micromanipulator (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Pas de positie van het microinjectieapparaat aan, zodat de micromanipulator het apparaat flexibel onder de microscoop kan verplaatsen. Ontlaad een bepaald volume paraffineolie om de stalen naald in de capillaire glazen buis te laten komen.</li>
	<li>Laat de injectieoplossing (zoals 1× PBS of 5 mg/ml LPS) op een glazen schuif gesteriliseerd met 70% ethanol vallen en stel het microinjectieapparaat zo in dat de punt in de vloeistofdruppel wordt ingebracht. Laad ~2 μL injectie-oplossing in de naald.</li>
	<li>Stel de micromanipulator (fijnafstellingsinstellingen van omhoog, omlaag, links en rechts) zo in dat de naaldpunt van het microinjectieapparaat zich in hetzelfde gezichtsveld bevindt als de larven bij hoge vergroting (figuur 2B).</li>
</ol>3. Zebravis monteren voor micro-injecties
OPMERKING: Zebravis hersenontwikkeling vindt plaats binnen 3 dpf en rijpt op 5 dpf met een goed ontwikkeld centraal zenuwstelsel31,32. Daarom zijn 5 dpf-larven al geschikt voor het bestuderen van LPS-gemedieerde neuronale schade en gedrags- en ontstekingsreacties.
<ol><li>Injecteer de zebravislarven binnen ongeveer 30 minuten na het bereiken van het stadium van interesse, om de consistentie van de injectietiming te behouden.</li>
	<li>Om de zebravislarven te verdoven, combineert u tricaine met schoon aquariumwater (eindconcentratie van 0,02% w / v tricaine).</li>
	<li>Smelt een oplossing van 2% agarose in ddH2O met behulp van een magnetron. Giet de gesmolten agarose in een plastic schaal. De 2% agarose-gecoate plastic schaal kan maximaal 2 weken bij 4 °C worden bewaard.</li>
	<li>Gebruik een plastic transferpipet om verdoofde larven naar het midden van de 2% agarose-gecoate plastic schaal te transporteren. Oriënteer de gemonteerde larven met de hersenkant naar boven voor toegang tot de naald.</li>
</ol>4. Injecteren van de hersenkamer
<ol><li>Pas de vergroting van de microscoop aan zodat de hersenventrikelstructuur van zebravissen duidelijk wordt weergegeven in het gezichtsveld (figuur 2B).</li>
	<li>Plaats de naald voorzichtig boven het hersentectum (figuur 2C).</li>
	<li>Prik de huid van de hersenen van de zebravis met de naaldpunt langzaam door met behulp van de micromanipulator.</li>
	<li>Druk op het voetpedaal om 1 nL 1x PBS of verschillende concentraties LPS (1,0, 2,5 en 5,0 mg/ml) uit te werpen (zie materiaaltabel). Succesvolle ventrikelinjectiebeelden waarbij hersenventrikel werd geïnjecteerd met 1 nL van 1% Evans blauwe kleurstof (verdund in PBS) worden als voorbeeld getoond (figuur 2D). Breng de larven onmiddellijk na de injectie over naar het schone E3-medium. Verzamel na 24 uur de larven voor microscopische beeldvorming, locomotiefgedragstest en bepaling van andere indicatoren.</li>
</ol>5. Beeldvorming
<ol><li>Bereid 1,5% low-melt agarose-oplossing in E3-medium en verwarm het in een magnetron om een heldere vloeistof te vormen.</li>
	<li>Gebruik een schone plastic transferpipet om de larven naar een glazen glijbaan te transporteren en verwijder zoveel mogelijk water.</li>
	<li>Gebruik een plastic transferpipet om een druppel van 1,5% low-melt agarose aan de larven toe te voegen. OPMERKING: Koel de low-melt agarose in de pipet een tijdje voordat u deze toevoegt om de larven niet te verwonden.</li>
	<li>Gebruik een naald van een spuit van 1 ml om de larven te oriënteren. Wacht tot de agarose afkoelt en stolt voordat u begint met beeldvorming.</li>
	<li>Observeer en fotografeer het neurongebied in de hele hersenen van Tg (ETvmat2: EGFP) en Tg (elavl3: mCherry) zebravissen, evenals de rekrutering van neutrofielen in de hersenen van Tg (mpo: EGFP) zebravissen onder een fluorescentie stereomicroscoop (zie Materiaaltabel). OPMERKING: Fluorescentiemicroscoopinstellingen die worden gebruikt voor beeldvorming worden hieronder weergegeven. Tg (ETvmat2: EGFP) zebravis hersenen (excitatie golflengte: 450-490 nm, emissie golflengte: 500-550 nm, visuele vergroting: 100x); Tg(elavl3:mCherry) zebravis hersenen (excitatie golflengte: 541-551 nm, emissie golflengte: 590 nm, visuele vergroting: 100x); Tg(mpo:EFGP) zebravis hersenen (excitatie golflengte: 450-490 nm, emissie golflengte: 500-550 nm, visuele vergroting: 63x).</li>
	<li>Meet en analyseer de fluorescentie-intensiteit en -lengte van het Ra-neurongebied in Tg (ETvmat2: EGFP) zebravissen en de fluorescentie-intensiteit van Tg (elavl3: mCherry) zebravishersenneuronen met behulp van ImageJ-software. Tel handmatig de neutrofielen in het hersengebied van Tg (mpo: EFGP) zebravissen.</li>
</ol>6. Bepaling van genexpressiemarkers
<ol><li>Ga 24 uur na LPS-hersenventrikelinjectie verder met de bepaling van genexpressiemarkers. Verdoof hiervoor zebravislarven met 0,02% tricaïne (zoals vermeld in stap 3.2).</li>
	<li>Gebruik twee spuiten van 1 ml om de kopgedeelten van de larven (40 larven per groep) te scheiden zonder de oog- en dooierzakgebieden (figuur 2E).</li>
	<li>Extraheer RNA uit de larvale kopgedeelten.<ol><li>Homogeniseer voor RNA-extractie het kopgedeelte met 200 μL RNA-extractiereagens (zie Materiaaltabel) met behulp van een weefselslijper (zie Materiaaltabel) bij een rotatiesnelheid van 11.000 tpm gedurende 5 s.</li>
		<li>Voer RNA-extractie uit met behulp van de chloroform-isopropanol-methode. Voeg hiervoor 40 μL chloroform toe, schud de buizen krachtig en incubeer ze bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Centrifugeer de monsters bij 12.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C.</li>
		<li>Breng de waterige fase over in een verse buis (ongeveer 100 μL) en voeg 100 μL isopropanol toe. Incubeer gedurende 10 minuten en centrifugeer vervolgens bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant.</li>
		<li>Voeg 200 μL 75% ethanol toe om de RNA-pellet te wassen. Vortex de monsters kort en centrifugeer vervolgens bij 7500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en was de RNA-pellet opnieuw.</li>
		<li>Droog de RNA-pellet gedurende 5-10 minuten aan de lucht en voeg vervolgens 30 μL RNase-vrij water toe om de RNA-pellet op te lossen. Controleer de zuiverheid (absorptieverhouding bij 260 nm en 280 nm) en de integriteit van RNA met behulp van een microvolumespectrofotometer (zie Materiaaltabel).</li>
	</ol></li>
	<li>Synthetiseer cDNA uit het RNA dat in stap 6.3 is geëxtraheerd, met behulp van reverse transcriptase met willekeurige primers (zie Materiaaltabel).<ol><li>Voeg 1 μL willekeurige primers, 1 μL dNTPs, 1 μg RNA en gedestilleerd water (totaal volume tot 12 μL) toe aan een nucleasevrije buis. Verwarm het mengsel gedurende 5 minuten tot 65 °C en koel snel af op ijs.</li>
		<li>Voeg 1 μL 0,1 M DTT, 1 μL RNase-remmer, 4 μL 5× eerstestrengbuffer en 1 μL M-MLV reverse transcriptase (totaal volume: 20 μL) toe aan de buis. Meng voorzichtig en incubeer de buis bij 25 °C gedurende 2 min, gevolgd door 42 °C gedurende 50 minuten. Activeer de reactie door gedurende 15 minuten op 70 °C te verwarmen.</li>
	</ol></li>
	<li>Voer real-time PCR uit op een qPCR-systeem (zie Tabel van materialen) met behulp van een in de handel verkrijgbare RT-qPCR-kit (zie Tabel van materialen) om de expressie van de doelgenen (IL-1β, IL-6 en TNF-α) te bepalen. Het reactiemengsel (20 μL) bevatte 10 μL SYBR groen, 0,4 μL ROX referentiekleurstof, 0,8 μL elk van de voor- en achteruit primers, 6 μL ddH2O en 2 μL template cDNA (1 μg). Voer PCR-versterking uit onder de omstandigheden: 95 °C gedurende 30 s, gevolgd door 40 cycli van 95 °C gedurende 5 s en 60 °C gedurende 34 s, en met een dissociatiefase van 95 °C gedurende 15 s, 60 °C gedurende 60 s en 95 °C gedurende 15 s.</li>
	<li>Normaliseer de mRNA-niveaus van de doelgenen naar die van een huishoudgen, rekfactor 1 α (Ef1α). Bereken de expressieniveaus voor elk doelgen met behulp van de 2−ΔΔCT-methode33. De primersequenties van elk gen worden beschreven in tabel 2.</li>
	<li>Homogeniseer voor de bepaling van stikstofmonoxide het hoofdgedeelte (verkregen in stap 6.2) in 100 μL koud PBS met behulp van een weefselslijper. Centrifugeer de resulterende PBS- en hoofdgedeeltesuspensie bij 12.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Verzamel de lysaten en voer nitrietconcentratietest34 uit met behulp van een in de handel verkrijgbare kit (zie materiaaltabel).</li>
</ol>7. Zebravis locomotief gedragstest
<ol><li>Breng na 24 uur na LPS-hersenventrikelinjectie de zebravislarven individueel over naar de putten van een vierkante microplaat met 96 putten. Voeg 300 μL E3-medium toe aan elke put en incubeer vervolgens de larven gedurende 4 uur om aan de testplaat te acclimatiseren.</li>
	<li>Breng de met larven geladen microplaat over naar de volgdoos van zebravissen (zie Materiaaltabel). Schakel de lichtbron in en incubeer de larven vervolgens gedurende 30 minuten in de testbox om de omgeving te acclimatiseren.</li>
	<li>Monitor en registreer het gedrag van de zebravis met behulp van een geautomatiseerd videovolgsysteem. Noteer 12 sessies (elk 5 min, totaal 1 uur) voor elke zebravis. Definieer de totale afstand (bestaat uit inactieve, kleine en grote afstanden) als de afstand (in mm) die elke vis heeft verplaatst tijdens een volgperiode van 60 minuten.</li>
</ol>8. Statistische analyse
<ol><li>Statistische analyses uitvoeren met behulp van standaard analysesoftware (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Voer statistische analyse uit van verschillen tussen twee groepen met behulp van gewone eenrichtings-ANOVA. Bereken de correlatiecoëfficiënt van Pearson om de sterkte van correlaties te beoordelen. P < 0,05 werd in alle analyses als significant beschouwd.</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerend financieel belang te hebben.

Een toenemende hoeveelheid epidemiologische en experimentele gegevens impliceert chronische bacteriële en virale infecties als mogelijke risicofactoren voor neurodegeneratieve ziekten36. De infectie veroorzaakt de activering van ontstekingsprocessen en immuunresponsen van de gastheer37. Zelfs als de reactie fungeert als een verdedigingsmechanisme, is overactiveerde ontsteking schadelijk voor neurogenese en staat de ontstekingsomgeving de overleving van pasgeboren neuronen n...

Neuro-inflammatie is beschreven als een cruciale anti-neurogene factor die betrokken is bij de pathogenese van verschillende neurodegeneratieve ziekten van het centrale zenuwstelsel (CZS)1. Na pathologische beledigingen kan neuro-inflammatie leiden tot verschillende nadelige gevolgen, waaronder remming van neurogenese en inductie van neuronale celdood 2,3. In het proces dat ten grondslag ligt aan de respons op ontstekingsinductie, worden meerdere inflammatoire cytokines (zoals TNF-α, IL-1β en IL-6) uitgescheiden in de extracellulaire ruimte en fungeren als cruciale componenten in neurondood en de onderdrukking van neurogenese 4,5,6.
Micro-injectie van ontstekingsmediatoren (zoals IL-1β, L-arginine en endotoxinen) in de hersenen kan neuronale celreductie en neuro-inflammatie veroorzaken 7,8,9. Lipopolysaccharide (LPS, figuur 1), een pathogeen endotoxine dat aanwezig is in de celwand van Gram-negatieve bacteriën, kan neuro-inflammatie induceren, neurodegeneratie verergeren en neurogenese bij dieren verminderen10. LPS-injectie rechtstreeks in het CZS van de muizenhersenen verhoogde niveaus van stikstofmonoxide, pro-inflammatoire cytokines en andere regulatoren11. Bovendien kan stereotaxische injectie van LPS in de lokale hersenomgeving overmatige productie van neurotoxische moleculen induceren, wat resulteert in een verminderde neuronale functie en de daaropvolgende ontwikkeling van neurodegeneratieve ziekten 10,12,13,14,15. Op het gebied van de neurowetenschappen zijn live en tijdsverloop microscopische waarnemingen van cellulaire en biologische processen in levende organismen cruciaal voor het begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan pathogenese en farmacologische werking16. Live beeldvorming van muismodellen van neuro-inflammatie en neurotoxiciteit wordt echter fundamenteel beperkt door de beperkte optische penetratiediepte van microscopie, die functionele beeldvorming en live observatie van ontwikkelingsprocessen uitsluit 17,18,19. Daarom is de ontwikkeling van alternatieve neuro-inflammatiemodellen van groot belang om de studie van pathologische ontwikkeling en het mechanisme dat ten grondslag ligt aan neuro-inflammatie en neurodegeneratie door live beeldvorming te vergemakkelijken.
Zebravis (Danio rerio) is naar voren gekomen als een veelbelovend model om neuro-inflammatie en neurodegeneratie te bestuderen vanwege zijn evolutionair geconserveerde aangeboren immuunsysteem, optische transparantie, grote embryokoppelingsgrootte, genetische tractie en geschiktheid voor in vivo beeldvorming 19,20,21,22,23 . Eerdere protocollen hebben ofwel lps rechtstreeks geïnjecteerd in de dooier en achterhersenentrik van larvale zebravissen zonder mechanistische beoordeling, of eenvoudig LPS toegevoegd aan viswater (kweekmedium) om een dodelijke systemische immuunrespons te induceren 24,25,26,27. Hierin hebben we een protocol ontwikkeld voor micro-injectie van LPS in de hersenventrikels, om een aangeboren immuunrespons of neurotoxiciteit te activeren in de 5 dagen na de bevruchting (dpf) zebravislarven. Deze respons wordt aangetoond door neuronaal celverlies, bewegingsvermogenstekort, verhoogde afgifte van stikstofmonoxide, activering van inflammatoire genexpressie en rekrutering van neutrofielen in de hersenen van zebravissen 24 uur na injectie.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6361</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, lage geleertemperatuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>Drummond Nanoject III Programmeerbare Nanoliter Injector</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-207</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentie stereo microscopen</td><td>Leica</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism software</td><td>GraphPad Software</td><td>Ver. 7.04</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysacchariden van Escherichia coli O111:B4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3024</td><td></td></tr><tr><td>Manuele micromanipulator</td><td>World Precision Instruments</td><td>M3301</td><td></td></tr><tr><td>Mineraal olie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Mx3005P qPCR systeem</td><td>Agilent Technologies</td><td>Mx3005P</td><td></td></tr><tr><td>Nanovue plus spectrofotometer</td><td>Biochrom</td><td>80-2140-46</td><td></td></tr><tr><td>Nitriet concentratie assay kit</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>S0021M</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat-gebufferde zoutoplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Programmeerbare Horizontale Pipet Puller</td><td>World Precision Instruments</td><td>PMP-102</td><td></td></tr><tr><td>PTU (N-Fenylthioureum)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Willekeurige primers</td><td>Takara</td><td>3802</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Reverse Transcriptase</td><td>Invitrogen</td><td>18064014</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Premix Ex Taq II kit</td><td>Accurate Biology</td><td>AG11701</td><td></td></tr><tr><td>De 3e Gen Tgrinder</td><td>Tiangen</td><td>OSE-Y30</td><td></td></tr><tr><td>Dunwandige glazen capillairen (4&rdquo;) met filament, OD 1,5 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine (3-amino benzoëzuur ethylester)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>TRNzol Universeel reagens</td><td>Tiangen</td><td>DP424</td><td></td></tr><tr><td>Zebravis tracking box</td><td>ViewPoint Behavior Technology</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

hersenventrikelmicro-injecties van lipopolysaccharide in larvale zebravissen om neuro-inflammatie en neurotoxiciteit te beoordelen

Brain Ventricular Microinjections of Lipopolysaccharide into Larval Zebrafish to Assess Neuroinflammation and Neurotoxicity

Neuro-inflammatie is een belangrijke speler bij verschillende neurologische aandoeningen, waaronder neurodegeneratieve ziekten. Daarom is het van groot belang om alternatieve in vivo neuro-inflammatiemodellen te onderzoeken en te ontwikkelen om de rol van neuro-inflammatie bij neurodegeneratie te begrijpen. In deze studie werd een larvaal zebravismodel van neuro-inflammatie gemedieerd door ventriculaire microinjectie van lipopolysaccharide (LPS) ontwikkeld en gevalideerd. De transgene zebravislijnen elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP en mpo:EGFP werden gebruikt voor real-time kwantificering van de levensvatbaarheid van hersenneuronen door fluorescentie live imaging geïntegreerd met fluorescentie intensiteitsanalyse. Het locomotorische gedrag van zebravislarven werd automatisch vastgelegd met behulp van een videotrackingrecorder. Het gehalte aan stikstofmonoxide (NO) en de mRNA-expressieniveaus van inflammatoire cytokines, waaronder interleukine-6 (IL-6), interleukine-1β (IL-1β) en menselijke tumornecrosefactor α (TNF-α) werden onderzocht om de LPS-geïnduceerde immuunrespons in de larvale zebraviskop te beoordelen. Na 24 uur na de hersenventrikelinjectie van LPS werden verlies van neuronen en locomotiedeficiëntie waargenomen bij zebravislarven. Bovendien verhoogde LPS-geïnduceerde neuro-inflammatie de NO-afgifte en de mRNA-expressie van IL-6, IL-1β en TNF-α in het hoofd van 6 dagen na de bevruchting (dpf) zebravislarven, en resulteerde in de rekrutering van neutrofielen in de hersenen van zebravissen. In deze studie werd injectie van zebravissen met LPS in een concentratie van 2,5-5 mg/ml bij 5 dpf bepaald als de optimale conditie voor deze farmacologische neuro-inflammatietest. Dit protocol presenteert een nieuwe, snelle en efficiënte methodologie voor micro-injectie van LPS in de hersenen om LPS-gemedieerde neuro-inflammatie en neurotoxiciteit in een zebravislarve te induceren, wat nuttig is voor het bestuderen van neuro-inflammatie en ook kan worden gebruikt als een high-throughput in vivo screening assay voor geneesmiddelen.

De hier beschreven workflow presenteert een nieuwe, snelle en efficiënte methodologie voor het induceren van LPS-gemedieerde neuro-inflammatie en neurotoxiciteit bij zebravislarven. In dit beschreven protocol werden 5 dpf zebravissen geïnjecteerd met LPS (figuur 1) in hersenventrikels met behulp van een micro-injector (figuur 2A-C). Succesvolle injectie in de hersenkamer werd geverifieerd met behulp van 1% Evans blauwe vlek (<st...

Dit protocol demonstreert de micro-injectie van lipopolysaccharide in het ventriculaire gebied van de hersenen in een zebravislarvemodel om de resulterende neuro-inflammatoire respons en neurotoxiciteit te bestuderen.

Hersenventrikelmicro-injecties van lipopolysaccharide in larvale zebravissen om neuro-inflammatie en neurotoxiciteit te beoordelen

Neuroinflammation is a key player in various neurological disorders, including neurodegenerative diseases. Therefore, it is of great interest to research ...

Neuro-inflammatie is een belangrijke speler bij verschillende neurologische aandoeningen. Daarom is het van groot belang om alternatieve in vivo neuro-inflammatiemodellen te onderzoeken en te ontwikkelen om studies van pathologische ontwikkeling te vergemakkelijken. De hier beschreven techniek is een uitstekend hulpmiddel om pathologische veranderingen in de hersenen beter te begrijpen via in vivo beeldvorming en voor het snel en efficiënt evalueren van mogelijke anti-neuro-inflammatoire geneesmiddelen.Bereid je voor op de injectie door glazen haarvaten te trekken met behulp van een micropipettetrekker volgens het vijfstappenprotocol voor het trekken van glazen capillaire buisjes. Open de punt van de naald in een hoek tot de juiste grootte met behulp van een tang. Vul de naald met 0,1 milliliter minerale olie om ervoor te zorgen dat er geen bubbels zijn.Verwijder de schroefdop van de stalen naald van het microinjectieapparaat. Lijn het glazen naaldgat uit met de stalen naald en draai vervolgens de schroefdop vast. Monteer het geladen naaldmicro-injectieapparaat in een micromanipulator.Pas de positie van het microinjectieapparaat aan, zodat de micromanipulator het apparaat flexibel onder de microscoop kan verplaatsen. Ontlaad een geschikt volume paraffineolie dat nodig is om de stalen naald in de capillaire glazen buis te laten komen. Laat de injectieoplossing bestaande uit PBS of lipopolysaccharide op een glazen schuif gesteriliseerd met 70% ethanol vallen en pas het microinjectieapparaat aan zodat de punt in de vloeistofdruppel wordt ingebracht.Laad ongeveer twee microliter injectieoplossing in de naald. Stel de micromanipulator zo in dat de naaldpunt van het microinjectieapparaat zich in hetzelfde gezichtsveld bevindt als de larven bij hoge vergroting. Smelt een oplossing van 2% agarose in dubbel gedestilleerd water met behulp van een magnetron.Giet de gesmolten agarose in een plastic schaal. Gebruik een plastic transferpipet om de verdoofde larven naar het midden van een 2% agarose-gecoate plastic schaal te transporteren. Oriënteer de gemonteerde larven met de hersenkant naar boven voor toegang tot de naald.Pas de vergroting van de microscoop aan zodat de hersenventrikelstructuur van zebravissen duidelijk wordt weergegeven in het gezichtsveld. Plaats de naald voorzichtig boven het hersentectum. Reinig het hersengebied met 70% ethanol en prik de huid van de hersenen van de zebravis langzaam door met de naaldpunt met behulp van de micromanipulator.Druk op het voetpedaal om één nanoliter 1X PBS of verschillende concentraties lipopolysaccharide uit te werpen. Breng de larven onmiddellijk na de injectie over naar een schoon E3-medium. Verzamel na 24 uur de larven voor microscopische beeldvorming, locomotiefgedragstest en bepaling van andere indicatoren.Bereid 1,5% low-melt agarose-oplossing in E3-medium en verwarm het in een magnetron om een heldere vloeistof te vormen. Gebruik een schone plastic transferpipet om de larven naar een glazen glijbaan te transporteren en verwijder zoveel mogelijk water. Gebruik een plastic transferpipet om een druppel van 1,5% low-melt agarose aan de larven toe te voegen.Gebruik een naald van een milliliterspuit om de larven te oriënteren. Wacht tot de agarose afkoelt en stolt voordat u begint met beeldvorming. Ga 24 uur na lipopolysaccharide hersenventrikelinjectie verder met het bepalen van genexpressiemarkers.Gebruik twee spuiten van één milliliter om de kopgedeelten van de larven te scheiden zonder het oog en de dooierzakgebieden. Homogeniseer het hoofdgedeelte met 200 microliter RNA-extractiereagens met behulp van een weefselslijper met 11.000 rotaties per minuut gedurende vijf seconden en voer vervolgens RNA-extractie uit met behulp van de chloroform-isopropanolmethode. Droog de RNA-pellet vijf tot 10 minuten aan de lucht en voeg vervolgens 30 microliter RNAse-vrij water toe om de RNA-pellet op te lossen.Synthetiseer cDNA met behulp van reverse transcriptase met willekeurige primers zoals beschreven in het tekstmanuscript. Voer vervolgens real-time PCR uit op een qPCR-systeem met behulp van een in de handel verkrijgbare RT-qPCR-kit om de expressie van de doelgenen te bepalen. Breng 24 uur na lipopolysaccharide hersenventrikelinjectie de zebravislarven individueel over naar de putten van een vierkante microplaat met 96 putten.Voeg 300 microliter E3-medium toe aan elke put en incubeer vervolgens de larven gedurende vier uur om te acclimatiseren aan de testplaat. Breng de door larven geladen microplaat over naar de volgdoos van de zebravis. Schakel de lichtbron in en incubeer de larven in de testbox gedurende 30 minuten om te acclimatiseren aan de omgeving.Monitor en registreer het gedrag van de zebravis met behulp van een geautomatiseerd videovolgsysteem. Neem 12 sessies van elk vijf minuten op voor individuele zebravislarven en definieer de totale afstand zoals beschreven in het tekstmanuscript. Na behandeling gedurende 24 uur veroorzaakte één tot vijf milligram per milliliter lipopolysaccharide ventriculaire herseninjectie een significant verlies van RA-neuronen in de hersenen van TgEtvmat2: GFP larvale zebravissen in vergelijking met de controle- en schijngroepen.De transgene lijn elavl3:mCherry zebravis vertoonde significante veranderingen in de fluorescentie geïntegreerde dichtheid van larvale hersenneuronen wanneer geïnjecteerd met 2,5 tot vijf milligram per milliliter lipopolysaccharide, terwijl de één milligram per milliliter lipopolysaccharide-injectie geen effect vertoonde. Verder veroorzaakte vijf milligram per milliliter lipopolysaccharide een voortbewegingstekort en verminderde de totale afstand van zebravisbeweging gedurende een volgperiode van 60 minuten. De lachgasproductie en mRNA-expressie van pro-inflammatoire cytokines in de kop van zebravislarven waren verhoogd op 2,5 tot vijf milligram per milliliter lipopolysaccharidebehandeling in vergelijking met de expressie in de controle- en schijngroepen.De injectie van één tot vijf milligram per milliliter lipopolysaccharide toonde de rekrutering van neutrofielen in de larvale zebravishersenen, wat resulteerde in een significante toename van het aantal neutrofielen in het Tgmpo: eGFP zebravisbreingebied. De openingsgrootte van naalden en de hoeveelheid injectiekracht voor micro-injectie samen met de hoofdscheiding van de ogen en het lichaam van zebravissen is cruciaal voor deze procedure.

brain-ventricular-microinjections-lipopolysaccharide-into-larval

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

De snelle ontwikkeling, de kleine oppervlakte en de transparantie van de zebravis zijn enorme voordelen voor de studie van aangeboren immuunsysteem controle op...

Niet-invasieve beeldvorming van gedissemineerde candidiasis in de zebravis Larven

This video demonstrates a method to quantify fungal infection in zebrafish larvae. Fungal spores are microinjected into the larval hindbrain ventricle, and the larvae are incubated to allow infection development. Infected larvae are harvested at defined intervals, and infection progress is assessed by enumerating colony-forming units.

A Technique to Quantify Fungal Infection in Zebrafish Larvae

The video demonstrates a zebrafish wounding and entrapment device technique for observing fluorescently labeled fungal pathogen infection in zebrafish larvae. Initial infection attracts macrophages, and as infection persists, neutrophil recruitment progresses at the injection site.

A zWEDGI Technique to Visualize Fungal Pathogen-Infected Zebrafish Larvae

The video demonstrates the microinjection of lipopolysaccharides (LPS) into the brains of zebrafish larvae to induce neuroinflammation. The larvae are positioned on an agarose-lined dish, the needle is inserted into the brain ventricles, and the LPS is injected. The injected LPS triggers an immune response that leads to neuroinflammation.

Inducing Neuroinflammation in Zebrafish Larvae with a Lipopolysaccharide Injection

Hier presenteren we een protocol voor de generatie en beeldvorming van een gelokaliseerde bacteriële infectie in het oticum van de zebravis.

Niet-invasieve beeldvorming van de aangeboren immuunrespons in een zebravis larven Model van<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infectie

Dit protocol beschrijft de synthese, karakterisering en injectie van monomeer amyloid-β42 peptiden voor het genereren van amyloïde toxiciteit in volwassen zebrafish om een model van de ziekte van Alzheimer, gevolgd door histologische analyses en detectie van samenvoegingen.

Modelleren van Amyloid-β42 toxiciteit en neurodegeneratie in volwassen Zebrafish hersenen

We presenteren een protocol om te isoleren van neuronen, macrofagen en microglia van larvale zebrafish hersenen onder fysiologische en pathologische omstandigheden. Op isolatie, wordt RNA gewonnen uit deze cellen te analyseren hun genexpressie profiel. Dit protocol voorziet voor de verzameling van kwalitatief hoogwaardige RNA downstream analyse zoals qPCR en transcriptomics uitvoeren.

Isolatie en RNA extractie van neuronen, macrofagen en Microglia van larvale Zebrafish hersenen

Hier presenteren we een protocol om hersenletsel te kwantificeren, bewegings tekorten en neuroinflammation na bloeden in de hersenen in zebravis larven, in de context van de menselijke intracerebrale bloeding (ICH).

Met behulp van zebravis larven om de pathologische gevolgen van hemorragische beroerte studie

Hier beschrijven we de synthese van door drugs geladen liposomen en hun micro-injectie in larve zebravissen met als doel de levering van geneesmiddelen aan macrofaagcellen te richten.

Targeting Drugs aan Larvale Zebrafish Macrofagen door injecterendrug-loaded Liposomen

Om te modelleren hoe ontstekingssignalen de neuroontwikkeling beïnvloeden bij genetisch gevoelige organismen, presenteren we een protocol voor het microinjecteren van IL-6 in het kanaal van Cuvier (de algemene kardinaalader) van zebravislarven, waardoor gecontroleerde inductie van ontsteking en beoordeling van de ontwikkelingsimpact in de context van tubereuze sclerosecomplex (TSC) mogelijk is.

Micro-injectie van interleukine-6 in de bloedbaan van TSC-zebravislarven om neuropsychiatrische aandoeningsachtige gedragingen te bestuderen

Leer hersenventrikelmicro-injecties van lipopolysaccharide in larvale Danio rerio om neuro-inflammatie en neurotoxiciteit te beoordelen. Deze methode maakt in vivo beeldvorming en snelle evaluatie van anti-neuro-inflammatoire geneesmiddelen mogelijk.

Hersenventrikelmicro-injecties van lipopolysaccharide in larvale zebravissen om neuro-inflammatie en neurotoxiciteit te beoordelen (Video) | JoVE Journal

Hersenventrikelmicro-injecties van lipopolysaccharide in larvale zebravissen om neuro-inflammatie en neurotoxiciteit te beoordelen

Meer video's verkennen