Name: Knaagdiermodel van intestinale ischemie-reperfusieschade via occlusie van de superieure mesenteriale slagader (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T14:05:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Leer een chirurgisch knaagdiermodel voor intestinale ischemie-reperfusieschade via occlusie van de superieure mesenteriale slagader. Deze methode helpt onderzoekers de pathofysiologie van darmischemie te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Financiering voor dit project werd verstrekt door de afdeling Intramuraal Onderzoek van het National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health.
We willen Dr. James Hawkins bedanken voor zijn mentorschap en steun. We danken ook Drs. Mihai Oltean en Robert Linford voor hun hulp bij het lokaliseren van de superieure mesenteriale slagader. We willen onze dank betuigen aan Drs. Patricia Carvalho Obeid Ellrich, Claudio Correa Natalini en George Howell III voor het beschikbaar stellen van hun expertise tijdens de ontwikkeling van dit protocol. Tot slot willen we Stephen Wincovitch bedanken voor zijn hulp bij het verwerven van de prachtige microfoto's in dit artikel en Dr. Alicia Olivier voor haar hulp bij het labelen en weergeven van de definitieve cijfers.

De hier beschreven procedures zijn goedgekeurd door het National Heart, Lung and Blood Institute Animal Care and Use Committee van de National Institutes of Health en voldoen aan het beleid dat is uiteengezet in het beleid van de Public Health Service inzake humane zorg en gebruik van proefdieren, de Animal Welfare Act en de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.
1. Chirurgische opstelling
<ol><li>Volg aseptische procedures. Trek een masker aan, haarbedekking en schone jumpsuit/laboratoriumjas/chirurgische scrubs.</li>
	<li>Bereid de volgende gesteriliseerde materialen voor: chirurgische instrumenten (zie Materiaaltabel), warme zoutoplossing, wattenstaafjes, gaas, chirurgische nietjes, chirurgische afdeklakens en handschoenen. Zorg ook voor chirurgische tape, die niet gesteriliseerd hoeft te worden. Steriliseer de materialen met autoclaaf- of ethyleenoxidesterilisatietechnieken.</li>
	<li>Plaats een verwarmde circulerende waterdeken in het operatiegebied en bedek deze met een steriele handdoek of draperie.</li>
	<li>Gebruik een precisie-isofluraanverdamper, medische perslucht (21% O2) en een Bain niet-rebreathing-circuit met een neuskegel die is ontworpen voor muizen om chirurgische anesthesie te bieden.</li>
</ol>2. Voorbereiding van dieren
<ol><li>Verdoof de muis in een inductiekamer door 2%-4% isofluraan toe te dienen met 21% O2 medische lucht met een snelheid van 0,5 l/min voor elke liter kamervolume. OPMERKING: Het verdient de voorkeur om voor dit specifieke model 21% O2 medische lucht te gebruiken in plaats van 100% O2 , omdat verzadiging van het bloed met O2 de IRI kan verstoren.</li>
	<li>Haal de muis uit de kamer en verplaats deze naar een schoon oppervlak dat gescheiden is van het operatiegebied. Voorzie het van een neuskegel die 1,5% isofluraan levert met 21% O2 medische lucht.</li>
	<li>Injecteer 1 mg/kg buprenorfine subcutaan in het dorsale cervicothoracale gebied.</li>
	<li>Injecteer 200-600 IE/kg heparine intraperitoneaal om trombusvorming tijdens de occlusieperiode te voorkomen.</li>
	<li>Breng oogzalf aan op de ogen om schade aan het hoornvlies te voorkomen.</li>
	<li>Verwijder haar van de ventrale buik met behulp van een tondeuse.</li>
	<li>Beweeg de muis op de verwarmde waterdeken in het operatiegebied. Nogmaals, monteer het met een neuskegel die 1,5% isofluraan met 21% O2 medische lucht levert om een chirurgisch anesthesievlak te bereiken.</li>
	<li>Plaats de muis in dorsale lighouding en bevestig de ledematen aan de tafel met chirurgische tape.</li>
	<li>Controleer de lichaamstemperatuur van het dier rectaal met behulp van een knaagdierspecifieke thermometer. Houd de lichaamstemperatuur gedurende de gehele operatie op 36,5 ± 0,5 °C.</li>
	<li>Desinfecteer de ventrale buik met steriel gaas gedrenkt in chloorhexidine-scrub of povidon-jodiumscrub, gevolgd door 70% alcohol. Herhaal deze reeks drie keer, afwisselend tussen de scrub en de alcohol. Elke keer moet een nieuwe set scrubs en alcoholgaasjes worden gebruikt.<ol><li>Breng de scrub en alcohol in een cirkelvormige beweging aan, beginnend met kleine cirkels in het midden van de operatieplaats en geleidelijk naar de randen toe werkend door de cirkels te vergroten. Gooi het gaasje weg zodra de rand van de operatieplaats is bereikt. Schrob niet achterwaarts van rand naar midden.</li>
	</ol></li>
	<li>Voer een teenknijptest (pedaalreflex) uit om er zeker van te zijn dat het dier volledig verdoofd is.</li>
	<li>Trek steriele handschoenen aan. Drapeer de operatieplaats aseptisch.</li>
</ol>3. Chirurgie en ischemie
<ol><li>Maak een 3-5 cm ventrale middellijn abdominale incisie in de huid met behulp van een #15 scalpelmesje, ontleed het los van de onderliggende spierfascia en reflecteer het lateraal. Vervolg de incisie door de buikwand langs de linea alba met behulp van een micro-ontleedschaar of een veerbelaste microschaar en plaats een retractor op zijn plaats.</li>
	<li>Plaats steriele gaasjes bevochtigd met warme steriele zoutoplossing rond het operatiegebied.</li>
	<li>Verwijder de dunne darm uit de buikholte, draai deze craniaal en naar links van het dier en plaats deze op de bevochtigde kussentjes. Plaats nog een bevochtigd gaasje over de weefsels om uitdroging te voorkomen. Druppel regelmatig warme steriele zoutoplossing op het gaas om de weefsels vochtig te houden.</li>
	<li>Isoleer de SMA, die zich ventraal bevindt ten opzichte van de inferieure vena cava, caudaal ten opzichte van de coeliakie-slagader en craniaal ten opzichte van de nierslagader. OPMERKING: Figuur 1 toont de locatie van de SMA waar deze tijdens de operatie is geïsoleerd. De SMA ligt normaal gesproken ventraal ten opzichte van de inferieure vena cava en strekt zich uit naar rechts. Wanneer de darmen tijdens de operatie worden geëxterioriseerd en naar links worden geklapt, ligt de SMA links van de inferieure vena cava.</li>
	<li>Plaats een atraumatische microvasculaire clip over de basis van de SMA, waar deze zich vertakt van de abdominale aorta, en zorg ervoor dat de clip de superieure mesenteriale ader niet afsluit.</li>
	<li>Controleer ischemie van de dunne darm door de kleurverandering van roze naar lichtwit en het verlies van mesenteriale pulsatie op te merken.</li>
	<li>Breng de ingewanden terug naar hun oorspronkelijke positie in de buikholte voor de duur van de ischemische periode. Verwijder het oprolmechanisme en bedek de incisie met vochtig gaas. Voeg regelmatig warme steriele zoutoplossing toe aan het gaas om uitdroging te voorkomen en de lichaamstemperatuur op peil te houden.</li>
	<li>Na een periode van 45 minuten ischemie (waarvan het begin wordt gemarkeerd door de eerste toepassing van de clip), verwijdert u de afsluitende clip. Controleer het herstel van de bloedstroom door een mesenteriale pulsatie en een rode kleur te observeren.</li>
	<li>Breng warme steriele zoutoplossing intraperitoneaal aan vlak voor de definitieve sluiting om de juiste hydratatie te behouden.</li>
	<li>Sluit de buikspieren met een 6-0 polyglactine 910 hechtdraad. Dien bupivacaïne (tot 2 mg/kg) toe langs de incisielijn van de spier voor pijnverlichting. Sluit de huid met chirurgische nietjes of wondclips.</li>
</ol>4. Herstel en reperfusie
<ol><li>Breng de muis terug naar een warme kamer of kooi op een circulerende waterdeken, handwarmer of een andere geschikte warmtebron. Lever 21% O2 bij een debiet van 0,5 l/min voor elke liter kamervolume. Laat de muis hier 90 minuten bijkomen. Controleer de muis elke 5-10 minuten op tekenen van pijn of angst, zoals een gebogen houding, loensen en onwil om te bewegen.</li>
</ol>5. Euthanasie en bloedafname
<ol><li>Aan het einde van de herstelperiode van 90 minuten brengt u de muis terug naar de inductiekamer en dient u 2%-4% isofluraan met 21%O2 toe met een snelheid van 0,5 l/min kamervolume om volledige anesthesie opnieuw te induceren.</li>
	<li>Breng het dier terug naar het operatiegebied en plaats het met een neuskegel die 2%-4% isofluraan met 21%O2 toedient om diepe anesthesie te bereiken. OPMERKING: CO2 is geen geschikte euthanasiemethode voor deze procedure, omdat het fysiologische veranderingen teweegbrengt die ischemisch letsel of weefselanalyten kunnen verstoren13.</li>
	<li>Open de incisie in de ventrale middellijn opnieuw en voer een terminale bloeding uit door zoveel mogelijk bloed uit de abdominale vena cava te verzamelen met behulp van een naald en spuit van 23 G. Verwacht tussen de 0,3-0,5 ml bloed te verzamelen (minder bij muizen die IRI hebben ondergaan, meer bij muizen die een schijnlaparotomie hebben ondergaan). OPMERKING: Het doel van de terminale bloeding is om te helpen bij humane euthanasie en om bloed te verzamelen en te bewaren voor toekomstige tests (d.w.z. serumchemie, PCR, ELISA).</li>
	<li>Na bloedafname wordt de abdominale aorta doorgesneden om volledige bloedvergieten mogelijk te maken.</li>
	<li>Voer cervicale dislocatie of thoracotomie uit als secundaire maatregel om een succesvolle euthanasie te garanderen.</li>
</ol>6. Weefselbewerking voor histologie
<ol><li>Verzamel na euthanasie de gewenste weefsels. Zorg ervoor dat de weefselverwerking snel wordt uitgevoerd, aangezien autolyse onmiddellijk na de dood begint 14,15.<ol><li>Darmen: Verzamel de gehele lengte van de dunne darm en dikke darm. Gooi de blindedarm weg.</li>
		<li>Lever: Verzamel de linker laterale, linker mediane en rechter mediane kwabben.</li>
		<li>Nieren: Verzamel beide nieren. Volgens afspraak wordt de linkernier in de lengterichting doorgesneden en de rechter als dwarsdoorsnede op het moment van obductie. OPMERKING: De dikke darm, lever en nieren kunnen worden gebruikt voor het beoordelen van multi-orgaanfalen of andere systemische effecten van IRI. De dunne darm wordt gebruikt om de primaire verwonding te beoordelen. Het is niet nodig om afzonderlijke delen van de leverkwab en de nieren bij te houden, aangezien elk orgaan als één eenheid wordt geanalyseerd en gescoord. De darmsegmenten moeten echter gescheiden worden gehouden en vervolgens afzonderlijk worden gelabeld en gescoord.</li>
	</ol></li>
	<li>Verdeel de darm in vier secties: twaalfvingerige darm, jejunum, ileum en dikke darm. Zorg ervoor dat de drie dunne darmsegmenten even lang zijn. Doe dit door de dunne darm in een "Z"-vorm te vouwen, waarbij de bovenste lijn de twaalfvingerige darm is, de middelste lijn het jejunum en de onderste lijn het ileum. Het is belangrijk om het proximale versus het distale uiteinde bij te houden.</li>
	<li>Spoel het lumen van de darmsegmenten met zoutoplossing met behulp van een spuit van 10 ml met een angiokatheter van 20 G.</li>
	<li>Voordat u secties maakt, legt u elk darmsegment plat met de luminale kant naar boven gericht. Gebruik een spuit van 3 ml die is bevestigd met een naald van 27 G en breng royaal 10% gebufferde formaline druppelsgewijs aan om de gehele lengte van het slijmvlies te bedekken. Rol vervolgens elk darmsegment afzonderlijk en plaats het in afzonderlijke, gelabelde weefselcassettes.<ol><li>Om te rollen, legt u elk segment plat met de luminale kant naar boven en rolt u vervolgens in de omtrek rond een tandenstoker. Het proximale gedeelte moet het binnenste deel van de rol vormen. Het lumen moet naar binnen/midden gericht zijn. Probeer zo voorzichtig mogelijk te rollen om te voorkomen dat de villi worden samengedrukt.</li>
		<li>Bij het rollen moet de darm eruitzien als een Zwitsers broodje. Plaats de Swiss Roll-spiraal met de voorkant naar boven in de cassette.</li>
	</ol></li>
	<li>Plaats de tissues in gelabelde injectieflacons gevuld met 10% gebufferde formaline om ze op kamertemperatuur te fixeren. Te veel fixeren is beter dan te weinig fixeren. De injectieflacons moeten groot zijn met veel formaline - minstens 20x meer fixeermiddel dan weefsel.<ol><li>Darmen: Plaats de vier cassettes samen in een monsterbeker. Fix voor 24-48 uur.</li>
		<li>Lever: Plaats de leverkwabben samen in een conische buis van 50 ml. Fix voor 24-48 uur.</li>
		<li>Nieren: Plaats de nieren samen in een conische buis van 50 ml. Fix voor 48-72 uur. OPMERKING: Niet-getrimde nieren hebben meer tijd nodig om te repareren dan getrimde nieren. Om de fixatietijd te verkorten tot 24-48 uur, kunnen de nieren langs het middenvlak, longitudinaal (linkernier) en transversaal (rechternier) worden doorgesneden en in cassettes worden geplaatst voordat ze in de formaline worden afgezet.</li>
	</ol></li>
	<li>Nadat de weefsels gedurende de aangegeven tijd in formaline zijn gefixeerd, spoelt u ze af met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) of gedestilleerd water en brengen ze over naar gelabelde injectieflacons gevuld met 70% EtOH. Het weefsel kan voor onbepaalde tijd bij kamertemperatuur in de EtOH worden bewaard in afwachting van histologie.<ol><li>Darmen: Plaats de vier cassettes samen in een monsterbeker.</li>
		<li>Lever: Plaats de leverkwabben samen in een conische buis van 50 ml.</li>
		<li>Nieren: Plaats de nieren samen in een conische buis van 50 ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Als u klaar bent, laat u de weefsels op objectglaasjes verwerken met behulp van hematoxyline- en eosine (H&E)-kleuring. Snijd de formaline-gefixeerde weefsels bij en sluit ze vervolgens in paraffine in. Monteer secties van vijf micron op de glaasjes en beits ze met H&E.</li>
</ol>7. Weefsel scoren
<ol><li>Het scoren van weefsel moet bij voorkeur worden uitgevoerd door ervaren personeel dat blind is voor de monstergroepen.</li>
	<li>Intestinale ischemie wordt gescoord met behulp van het Chiu/Park-scoresysteem17.</li>
	<li>Nierschade wordt gescoord met behulp van het Jablonski-scoresysteem18,19.</li>
	<li>Leverschade wordt gescoord met behulp van het Suzuki-scoresysteem20,21. OPMERKING: Er zijn momenteel veel scoresystemen in gebruik voor het beoordelen van weefselschade in knaagdiermodellen van intestinale IRI. De scoresystemen die in dit onderzoek zijn gebruikt, zijn geselecteerd om willekeurige schattingen te minimaliseren en om opzettelijke kwalitatieve beoordeling te maximaliseren (tabel 1).</li>
</ol>

<ol><li>Mallick, I. H., Yang, W., Winslet, M. C., Seifalian, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia-reperfusion+injury+of+the+intestine+and+protective+strategies+against+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Diseases+and+Sciences%22%5BJournal%5D)">Ischemia-reperfusion injury of the intestine and protective strategies against injury.</a> Digestive Diseases and Sciences. 49, 1359-1377 (2004).</li>
<li>Minguet, G., Joris, J., Lamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preconditioning+and+protection+against+ischaemia-reperfusion+in+non-cardiac+organs%3A+a+place+for+volatile+anaesthetics%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Anaesthesiology%22%5BJournal%5D)">Preconditioning and protection against ischaemia-reperfusion in non-cardiac organs: a place for volatile anaesthetics.</a> European Journal of Anaesthesiology. 24 (9), 733-745 (2007).</li>
<li>Cowled, P., Fitridge, R. Pathophysiology of reperfusion injury. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCowled%2C+P+%22Mechanisms+of+Vascular+Disease%3A+A+Reference+Book+for+Vascular+Specialists%22">Mechanisms of Vascular Disease: A Reference Book for Vascular Specialists</a>. , University of Adelaide Press. 331-350 (2011).</li>
<li>Grootjans, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+intestinal+ischemia-reperfusion-induced+inflammation+characterized%3A+Experiences+from+a+new+translational+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Human intestinal ischemia-reperfusion-induced inflammation characterized: Experiences from a new translational model.</a> The American Journal of Pathology. 176 (5), 2283-2291 (2010).</li>
<li>Sharp, C. R., Rozanski, E. A., Finn, E., Borrego, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pattern+of+mortality+in+dogs+with+gastric+dilatation+and+volvulus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Emergency+and+Critical+Care%22%5BJournal%5D)">The pattern of mortality in dogs with gastric dilatation and volvulus.</a> Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 30 (2), 232-238 (2020).</li>
<li>Tinker, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+study+of+equine+colic+incidence+and+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Veterinary+Journal%22%5BJournal%5D)">Prospective study of equine colic incidence and mortality.</a> Equine Veterinary Journal. 29 (6), 448-453 (1997).</li>
<li>McMichael, M., Moore, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia-reperfusion+injury+pathophysiology%2C+part+I%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Emergency+and+Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Ischemia-reperfusion injury pathophysiology, part I.</a> Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 14 (4), 231-241 (2004).</li>
<li>Kaneene, J. B., Ross, W. A., Miller, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Michigan+equine+monitoring+system.+II.+Frequencies+and+impact+of+selected+health+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Preventive+Veterinary+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Michigan equine monitoring system. II. Frequencies and impact of selected health problems.</a> Preventive Veterinary Medicine. 29 (4), 277-292 (1997).</li>
<li>Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+ischemia-reperfusion-induced+intestinal+injury%3A+Progress+and+promise+for+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: Progress and promise for translational research.</a> American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 308 (2), 63-75 (2015).</li>
<li>Kim, M., Park, S. W., Kim, M., D'Agati, V. D., Lee, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+post-conditioning+protects+against+intestinal+ischemia-reperfusion+injury+and+multiorgan+dysfunction+via+transforming+growth+factor-%CE%B21+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Isoflurane post-conditioning protects against intestinal ischemia-reperfusion injury and multiorgan dysfunction via transforming growth factor-β1 generation.</a> Annals of Surgery. 255 (3), 492-503 (2012).</li>
<li>García, E. M. S. N., Taylor, J. H., Cenizo, N., Vaquero, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beneficial+effects+of+intra-arterial+and+intravenous+prostaglandin+E1+in+intestinal+ischaemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Interactive+Cardiovascular+and+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Beneficial effects of intra-arterial and intravenous prostaglandin E1 in intestinal ischaemia-reperfusion injury.</a> Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 18 (4), 466-474 (2014).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sevoflurane+protects+against+intestinal+ischemia-reperfusion+injury+partly+by+phosphatidylinositol+3+kinases%2FAkt+pathway+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Sevoflurane protects against intestinal ischemia-reperfusion injury partly by phosphatidylinositol 3 kinases/Akt pathway in rats.</a> Surgery. 157 (5), 924-933 (2015).</li>
<li>Shomer, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+rodent+euthanasia+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Review of rodent euthanasia methods.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 59 (3), 242-253 (2020).</li>
<li>Diagnostic Necropsy and Tissue Harvest in Rodents. Lab Animal Research. Journal of Visualized Experiments. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/v/10294/diagnostic-necropsy-and-tissue-harvest">https://www.jove.com/v/10294/diagnostic-necropsy-and-tissue-harvest</a> (2023).</li>
<li>Scudamore, C. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aScudamore%2C+CL+%22A+Practical+Guide+to+the+Histology+of+the+Mouse%22">A Practical Guide to the Histology of the Mouse</a>. , John Wiley and Sons. (2014).</li>
<li>Scicchitano, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preliminary+comparison+of+quantity%2C+quality%2C+and+microarray+performance+of+RNA+extracted+from+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded%2C+and+unfixed+frozen+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Preliminary comparison of quantity, quality, and microarray performance of RNA extracted from formalin-fixed, paraffin-embedded, and unfixed frozen tissue samples.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 54 (11), 1229-1237 (2006).</li>
<li>Quaedackers, J. S. L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+methods+for+grading+histologic+injury+following+ischemia%2Freperfusion+of+the+small+bowel%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">An evaluation of methods for grading histologic injury following ischemia/reperfusion of the small bowel.</a> Transplantation Proceedings. 32 (6), 1307-1310 (2000).</li>
<li>Jablonski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+model+for+assessment+of+renal+recovery+from+warm+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">An experimental model for assessment of renal recovery from warm ischemia.</a> Transplantation. 35 (3), 198-204 (1983).</li>
<li>Du, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen-rich+saline+attenuates+acute+kidney+injury+after+liver+transplantation+via+activating+p53-mediated+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Hydrogen-rich saline attenuates acute kidney injury after liver transplantation via activating p53-mediated autophagy.</a> Transplantation. 100 (3), 563-570 (2016).</li>
<li>Suzuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beneficial+effect+of+a+prostaglandin+12+analog+on+ischemic+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">The beneficial effect of a prostaglandin 12 analog on ischemic rat liver.</a> Transplantation. 52 (6), 978-983 (1991).</li>
<li>Behrends, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+hyperglycemia+worsens+hepatic+ischemia%2Freperfusion+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastrointestinal+Surgery%22%5BJournal%5D)">Acute hyperglycemia worsens hepatic ischemia/reperfusion injury in rats.</a> Journal of Gastrointestinal Surgery. 14 (3), 528-535 (2010).</li>
<li>Cook, M. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCook%2C+MJ+%22The+Anatomy+of+the+Laboratory+Mouse%22">The Anatomy of the Laboratory Mouse</a>. , Elsevier. (1965).</li>
<li>Premen, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+collateral+circulation+in+the+vascularly+occluded+feline+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Importance of collateral circulation in the vascularly occluded feline intestine.</a> Gastroenterology. 92 (5), 1215-1219 (1987).</li>
<li>Park, P. O., Haglund, U., Bulkley, G. B., Falt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sequence+of+development+of+intestinal+tissue+injury+after+strangulation+ischemia+and+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">The sequence of development of intestinal tissue injury after strangulation ischemia and reperfusion.</a> Surgery. 107 (5), 574-580 (1990).</li>
<li>Guzmán-de La Garza, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+patterns+of+intestinal+response+to+injury+after+arterial%2C+venous+or+arteriovenous+occlusion+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Different patterns of intestinal response to injury after arterial, venous or arteriovenous occlusion in rats.</a> World Journal of Gastroenterology. 15 (31), 3901-3907 (2009).</li>
<li>Chang, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+morphological+changes+of+the+gut+barrier+during+the+restitution+process+after+hemorrhagic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Functional and morphological changes of the gut barrier during the restitution process after hemorrhagic shock.</a> World Journal of Gastroenterology. 11 (35), 5485-5491 (2005).</li>
<li>Illyes, G., Hamar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+morphological+alterations+in+a+small+intestinal+ischaemia%2Freperfusion+model+of+the+anesthetized+rat.+A+light+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">Sequence of morphological alterations in a small intestinal ischaemia/reperfusion model of the anesthetized rat. A light microscopy study.</a> International Journal of Experimental Pathology. 73 (2), 161-172 (1992).</li>
<li>Wilding, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benefits+of+21%25+oxygen+compared+with+100%25+oxygen+for+delivery+of+isoflurane+to+mice+%28Mus+musculus%29+and+rats+%28Rattus+norvegicus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Benefits of 21% oxygen compared with 100% oxygen for delivery of isoflurane to mice (Mus musculus) and rats (Rattus norvegicus).</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (2), 148-154 (2017).</li>
<li>Ding, R., Zhao, D., Guo, R., Zhang, Z., Ma, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+with+unfractionated+heparin+attenuates+coagulation+and+inflammation+in+endotoxemic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Treatment with unfractionated heparin attenuates coagulation and inflammation in endotoxemic mice.</a> Thrombosis Research. 128 (6), 160-165 (2011).</li>
<li>Hayes, J. K., Havaleshko, D. M., Plachinta, R. V., Rich, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+pretreatment+supports+hemodynamics+and+leukocyte+rolling+velocities+in+rat+mesentery+during+lipopolysaccharide-induced+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesia+and+Analgesia%22%5BJournal%5D)">Isoflurane pretreatment supports hemodynamics and leukocyte rolling velocities in rat mesentery during lipopolysaccharide-induced inflammation.</a> Anesthesia and Analgesia. 98 (4), 999-1006 (2004).</li>
<li>Miller, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+cytokine-lnduced+neutrophil+accumulation+in+rat+mesenteric+venules+in+vivo+by+general+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Suppression of cytokine-lnduced neutrophil accumulation in rat mesenteric venules in vivo by general anesthesia.</a> International Journal of Microcirculation. 16 (3), 147-154 (1996).</li>
<li>Kim, M., Park, S. W., Kim, M., D'Agati, V. D., Lee, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+activates+intestinal+sphingosine+kinase+to+protect+against+bilateral+nephrectomy-induced+liver+and+intestine+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Isoflurane activates intestinal sphingosine kinase to protect against bilateral nephrectomy-induced liver and intestine dysfunction.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 300 (1), 167-176 (2011).</li>
<li>Megison, S. M., Horton, J. W., Chao, H., Walker, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+for+intestinal+ischemia+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">A new model for intestinal ischemia in the rat.</a> The Journal of Surgical Research. 49 (2), 168-173 (1990).</li>
<li>Gubernatorova, E. O., Perez-Chanona, E., Koroleva, E. P., Jobin, C., Tumanov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+of+intestinal+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Murine model of intestinal ischemia-reperfusion injury.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), 53881(2016).</li>
<li>Trompeter, M., Brazda, T., Remy, C. T., Vestring, T., Reimer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-occlusive+mesenteric+ischemia%3A+Etiology%2C+diagnosis%2C+and+interventional+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22European+Radiology%22%5BJournal%5D)">Non-occlusive mesenteric ischemia: Etiology, diagnosis, and interventional therapy.</a> European Radiology. 12 (5), 1179-1187 (2002).</li>
<li>Kozar, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superior+mesenteric+artery+occlusion+models+shock-induced+gut+ischemia-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Superior mesenteric artery occlusion models shock-induced gut ischemia-reperfusion.</a> The Journal of Surgical Research. 116 (1), 145-150 (2004).</li>
</ol>

De auteurs van dit artikel hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Ondanks het wijdverbreide gebruik van dit intestinale IRI-model, is het niet zonder beperkingen. Enige occlusie van alleen de basis van de SMA blokkeert bijvoorbeeld de bloedtoevoer naar de darm niet volledig. Dit is waarschijnlijk te wijten aan een uitgebreide collaterale circulatie in het mesenterium, die bloed kan trekken uit naburige takken van de abdominale aorta. In één onderzoek bij katten verminderde SMA-occlusie de bloedstroom met 35% in de proximale twaalfvingerige darm, 61% in de distale twaalfvingerige darm, 71% in het jejunum en ileum en 63% in de proximale dikke darm. De bloedstroom was niet verminderd in het midden en het distale colon, die een groot deel van hun circulatie ontvangen van de inferieure mesenteriale slagader23. Bij knaagdieren worden het jejunum en ileum het vaakst genoemd als de darmsegmenten die de meest significante weefselbeschadiging oplopen na SMA-occlusie9.
In de literatuur is een breed scala aan ischemietijden na SMA-occlusie genoemd, van 1 tot 90 minuten of meer. Verschillende ischemische tijden resulteren in verschillende niveaus van reperfusieschade; Park et al. observeerden reperfusieschade wanneer het ischemische interval tussen 40 en 60 minuten lag, maar niet wanneer het ischemische interval korter of langer was24. Dergelijke resultaten suggereren dat kortere tijden niet genoeg ischemie produceren om reperfusieschade te veroorzaken, terwijl langere tijden het weefsel zo ernstig beschadigen dat het onmogelijk is om de reperfusieschade die volgt aan te tonen. Bovendien brengen langere ischemische tijden het risico op verhoogde mortaliteit met zich mee. Zoals te zien is in onze studie, stierf 50% (3/6) van de eerste muizen die 60 minuten ischemie ondergingen na slechts 90 minuten reperfusie. Het verkorten van de ischemietijd tot 45 minuten verlaagde de mortaliteit tot 20% (1/5) zonder de scores voor weefselbeschadiging te veranderen. Op basis van onze studie lijkt het erop dat het ideale venster van ischemische schade kan worden bereikt door SMA-occlusie gedurende ongeveer 45 minuten.
Een andere variabele is de reperfusietijd vóór weefselafname. Net als bij ischemietijden variëren de reperfusietijden sterk tussen onderzoeken, van 60 minuten tot meer dan 24 uur. Verschillende artikelen hebben gemeld dat het darmslijmvlies maximale morfologische schade oploopt na 2 tot 3 uur reperfusie, met volledig herstel na 24 uur 25,26,27. Het verzamelen van weefsel vóór dit venster van 2 tot 3 uur loopt het risico dat de volledige omvang van het reperfusieletsel niet wordt vastgelegd, terwijl weefsels die dichter bij 24 uur zijn geoogst, al met het herstelproces zijn begonnen. We kozen aanvankelijk voor een reperfusietijd van 120 minuten, maar schakelden toen over op 90 minuten in een poging de sterfte te verlagen. Deze verandering veranderde niets aan de resultaten van weefselletsel, wat suggereert dat een afwijking van 30 minuten van het venster van 2 tot 3 uur acceptabel is.
Zuurstofconcentratie is ook een belangrijke variabele in de ontwikkeling van IRI. Wilding et al. ontdekten dat, in vergelijking met muizen die 21% O2 kregen, degenen die verdoofd waren met isofluraan toegediend met 100% O2 een mismatch tussen ventilatie en perfusie ondervonden als gevolg van atelectase. In hetzelfde onderzoek ontwikkelden ratten die 100% O2 kregen, acute respiratoire acidose en verhoogde gemiddelde arteriële druk28. Dergelijke fysiologische veranderingen kunnen het beste worden vermeden bij het induceren van een blessure zoals IRI, waarbij een aantal systemische factoren een rol spelen. 21% O2 lijkt dus geschikter dan 100 % O2 als draaggas voor isofluraanafgifte.
Het gebruik van heparine in dit protocol staat ter discussie. Van heparine is bekend dat het antistollings- en ontstekingsremmende effecten heeft29. We ontdekten dat het veranderen van 60 min ischemie en 120 min reperfusie naar 45 min ischemie en 90 min reperfusie met 400 IE/kg heparine de microscopische darmbeschadiging niet veranderde, maar wel de mortaliteit verlaagde. Een mogelijke verklaring is dat heparine fatale trombo-embolie voorkwam aan verre organen zoals de longen en de hersenen, maar we vonden hier geen bewijs voor bij autopsie door grof of microscopisch onderzoek van de eerste twee muizen die stierven. Het gebruik van kortere ischemie- en reperfusietijden zonder heparine kan net zo effectief zijn bij het verminderen van de mortaliteit. Als dat het geval zou zijn, zou het verstandig zijn om af te zien van het gebruik van heparine om interferentie met IRI tot een minimum te beperken. Het opnemen van heparine in het protocol kan echter geschikt zijn voor diegenen die chirurgische oorzaken van IRI willen modelleren, aangezien chirurgische patiënten vaak heparine perioperatief krijgen.
Van isofluraan is aangetoond dat het weefselbeschermende effecten heeft in gevallen van darmontsteking en ischemie, en het gebruik ervan kan interfereren met een klinisch relevant IRI-model 30,31,32. Organofluorinhalatiemiddelen (d.w.z. isofluraan, sevofluraan) zijn echter veelgebruikte anesthetica in zowel de diergeneeskunde als de menselijke geneeskunde. Bovendien is de duur van de anesthesie die nodig is voor dit protocol langer dan 120 minuten, en dus is een inhalatiemiddel geschikter dan een korter werkende injecteerbare vloeistof die opnieuw moet worden gedoseerd.
Er waren geen microscopisch kleine laesies aanwezig in de proximale dikke darm, lever of nier. Het gebrek aan microscopische veranderingen was misschien te wijten aan de relatief korte reperfusietijd van 90 tot 120 minuten. Bovendien heeft de proximale dikke darm een bloedtoevoer vanuit de inferieure mesenteriale slagader. Het ontbreken van zichtbare schade sluit echter niet uit dat er sprake is van systemisch letsel. Reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) is waarschijnlijk een betere methodologie om systemische schade aan te tonen door inflammatoire cytokines zoals TNF-α te meten.
In de loop der jaren zijn er verschillende variaties van dit intestinale IRI-model ontwikkeld. In 1990 toonden Megison et al. aan dat het afsluiten van collaterale vaten naast de SMA een meer consistente vermindering van de mesenteriale bloedstroom veroorzaakte, maar een toename van hetsterftecijfer. Een recenter onderzoek toonde aan dat, in plaats van de SMA aan de basis af te sluiten, het afbinden van de perifere en collaterale takken om ischemie in het distale ileum te induceren, reproduceerbaar letsel opleverde zonder mortaliteit34. Occlusie van de lokale arteriële vertakkingen zorgt voor maximale ischemie en kan het probleem aanpakken van multifocale, segmentale verminderingen van de bloedstroom die worden waargenomen bij het afbinden van de SMA net aan de basis. Hoewel deze alternatieve methode voor het modelleren van intestinale IRI van toepassing is op onderzoek naar de lokale weefseleffecten van intestinale IRI, is het onbekend of het de systemische ontsteking en multi-orgaanfalen die in verband kunnen worden gebracht met darmbeschadiging nauwkeurig kan modelleren.
SMA-occlusie is geen geschikt model voor alle soorten intestinale IRI. Niet-occlusieve mesenteriale ischemie wordt bijvoorbeeld gekenmerkt door splanchnische hypoperfusie als gevolg van een verminderd hartminuutvolume. Daarom zou deze techniek niet optimaal zijn om intestinale IRI te bestuderen die wordt veroorzaakt door een hartinfarct, congestief hartfalen, aorta-insufficiëntie of nier- ofleverziekte. Kozar et al. meldden dat SMA-occlusie echter een klinisch relevant model is voor darm-IRI geïnduceerd door shock36. Hoewel minder economisch, kan het gebruik van andere soorten, zoals varkens, voordelen hebben ten opzichte van knaagdieren voor het modelleren van bepaalde darmletselaandoeningen. Een uitgebreide review van Gonzalez et al. in 2014 beschrijft diermodellen die momenteel worden gebruikt voor het onderzoeken van intestinale IRI9.
Ondanks zijn beperkingen blijft de techniek van het afsluiten van de SMA aan de basis een van de meest gebruikte knaagdiermodellen van intestinale ischemie9. Omdat er maar één vaatklem en een basisopstelling nodig is, is de operatie zelf vrij eenvoudig. Het levert ook reproduceerbare schade op, zoals blijkt uit de hier gepresenteerde gegevens. SMA-occlusie bij knaagdieren kan occlusieve oorzaken van intestinale IRI op betrouwbare wijze modelleren en kan praktische toepassing hebben in zowel de diergeneeskunde als de menselijke geneeskunde. Daarom is het belangrijk dat de procedures die we hier hebben geschetst, consequent worden uitgevoerd.

Ischemie-reperfusieletsel (IRI) kan in elk orgaan voorkomen en omvat twee opeenvolgende componenten. Een aanvankelijke stopzetting van de bloedstroom zorgt ervoor dat aangetaste weefsels ischemisch worden en vervolgens veroorzaakt reperfusie verdere celbeschadiging. De schade door de reperfusie is vaak groter dan die veroorzaakt door ischemie1. De pathofysiologie van IRI omvat een complexe cascade van gebeurtenissen, waarvan de meest opvallende de vorming van vrije radicalen is bij de herintroductie van zuurstof, die optreedt tijdens reperfusie2. Activatie van de ontstekingscellen en cytokines speelt ook een rol2. In gevallen van intestinale IRI kan bacteriële translocatie in de bloedbaan na endotheelbeschadiging leiden tot systemisch inflammatoir responssyndroom2. Als de schade als gevolg van IRI ernstig genoeg is, kunnen de resulterende systemische effecten leiden tot multi-orgaanfalen3.
Gevallen van intestinale IRI worden geassocieerd met hoge morbiditeit en mortaliteit 4,5,6. Intestinale IRI wordt in verband gebracht met veel pathologische aandoeningen en chirurgische ingrepen in zowel de diergeneeskunde als de menselijke geneeskunde. In de diergeneeskunde zijn dieren bijzonder vatbaar voor intestinale IRI-aandoeningen, zoals maagdilatatie volvulus (GDV), mesenteriale torsie en koliek 7,8. Bij mensen is IRI een groot en vaak voorkomend probleem bij abdominale aorta-aneurysmachirurgie, beknelde hernia's, acute mesenteriale ischemie, volvulus, trauma, shock, neonatale necrotiserende enterocolitis en resectie of transplantatie van de dunne darm9.
De meeste in vivo knaagdierstudies van intestinale IRI omvatten occlusie van de basis van de superieure mesenteriale slagader (SMA), de tak van de abdominale aorta die bloed levert aan het grootste deel van de dunne darm en het proximale deel van de dikke darm 10,11,12. Ondanks het wijdverbreide gebruik en de relatieve eenvoud van dit model, is er geen gedetailleerd protocol gepubliceerd met behulp van inhalatie-anesthesie in 21% O2 medische lucht. Het ontbreken van een standaardprotocol vormt een probleem voor onderzoekers die niet bekend zijn met de procedure en verhindert consistentie tussen studies. We demonstreren de stappen die nodig zijn om het chirurgische model van intestinale IRI uit te voeren in 8-14 weken oude mannelijke en vrouwelijke Zwitserse Webster-muizen. Dit model van intestinale IRI levert reproduceerbare schade op, zoals aangetoond door consistente histopathologie.

<table><tbody><tr><td>Adson forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-5236</td><td>Chirurgisch instrument</td></tr><tr><td>Alm retractor</td><td>Roboz</td><td>RS-6510</td><td>Chirurgisch instrument</td></tr><tr><td>Anesthesieapparaat</td><td>Datex-Ohmeda</td><td>Aestiva 5</td><td></td></tr><tr><td>Anesthesie: isofluraan</td><td>Baxter Healthcare Corporation</td><td>NDC 10019-360-40</td><td>Dosis: 1-4%, INH</td></tr><tr><td>Angiocath 20 g&nbsp; x 2</td><td>Smiths Medical</td><td>5057</td><td>Darmen spoelen met zoutoplossing en formaline</td></tr><tr><td>Atraumatische microvasculaire clip</td><td>Teleflex</td><td>065100</td><td>Chirurgisch instrument</td></tr><tr><td>Gebufferde formaline 10%</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-245684</td><td>Weefselfixatie</td></tr><tr><td>Bupivicaine 0,25%</td><td>Hospira, Inc.</td><td>NDC 0409-1160-18</td><td>Dosis: tot 2 mg/kg druppelsgewijs</td></tr><tr><td>Buprenorfine</td><td>Par Pharmaceutical</td><td>NDC 42023-179-05</td><td>Dosis: 1 mg/kg, SQ</td></tr><tr><td>Chlorhexidine scrub 2%</td><td>Vet One</td><td>510083</td><td>Chirurgische voorbereiding</td></tr><tr><td>Circulerende waterdeken</td><td>Cincinnati Sub Zero</td><td>Blanketrol 2</td><td>Lijfstemperatuur handhaven</td></tr><tr><td>Klippers - Wahl BravMini, Paarse haarclippers</td><td>Lambert Vet Supply</td><td>008WA-41590-0438</td><td>Chirurgische voorbereiding</td></tr><tr><td>Conische buizen 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Weefselfixatie en -opslag</td></tr><tr><td>Droogig ijs</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>PCR weefselmonsters</td></tr><tr><td>EtOH 200 proof</td><td>The Warner-Graham Company</td><td>64-17-5</td><td>Weefselopslag</td></tr><tr><td>Heparine (optioneel)</td><td>Meitheal Pharmaceuticals</td><td>NDC 71288-402-11</td><td>Dosis: 200-600 IU/kg</td></tr><tr><td>Inductiekamer</td><td>VetEquip</td><td>941456</td><td></td></tr><tr><td>Indus Instruments THM100 Rodent Monitor</td><td>Indus Instruments</td><td>N/A</td><td>Voor het monitoren van de lichaamstemperatuur van knaagdieren tijdens een operatie</td></tr><tr><td>Isopropyl Alcohol 70%</td><td>Humco</td><td>NDC 0395-4202-28</td><td>Voor het schrobben van de chirurgische plek</td></tr><tr><td>Microcentrifugebuisjes: 0,6mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-121</td><td>PCR weefselmonsters. 8 per muis, terminale bloedafname, serumopslag</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Neuskoker</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Kan zelfgemaakt worden met een spuitbuis of buis met luchtbelletjes</td></tr><tr><td>O2 medisch lucht 21%</td><td>Roberts Oxygen</td><td>N/A</td><td>Snelheid: 0,5 L/min voor elke L kamervolume</td></tr><tr><td>Oogzalf</td><td>Akorn, Inc.</td><td>NDC 17478-062-35</td><td>Chirurgische voorbereiding</td></tr><tr><td>PBS pH 7,4 (1x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010-031</td><td>Voor het spoelen van weefsel en het maken van 70% EtOH</td></tr><tr><td>Specimenbekers</td><td>Cardinal Healthcare</td><td>C13005</td><td>Voor het houden van weefselcassettes in formaline</td></tr><tr><td>Steriele Castroviejo-naaldhouder</td><td>Roboz</td><td>RS-6412</td><td>Chirurgisch instrument</td></tr><tr><td>Steriele wattenstaafjes</td><td>Medline</td><td>BXTA50002Z</td><td></td></tr><tr><td>Steriele gaasjes</td><td>Medline</td><td>PRM21423Z</td><td></td></tr><tr><td>Steriele microdissectiescharen</td><td>Roboz</td><td>RS-5980</td><td>Chirurgisch instrument</td></tr><tr><td>Steriele micro dissectieveercharen</td><td>Roboz</td><td>RS-5693</td><td>Chirurgisch instrument</td></tr><tr><td>Steriele microtang</td><td>Roboz</td><td>RS-5264</td><td>Chirurgisch instrument</td></tr><tr><td>Steriele zoutoplossing (0,9%)</td><td>Braun</td><td>R5201-01</td><td>Moet worden opgewarmd</td></tr><tr><td>Steriele scalpelmes #15</td><td>Cardinal Health (Allegiance)</td><td>32295-015</td><td>Chirurgisch instrument</td></tr><tr><td>Steriele scalpelhandgreep</td><td>Roboz</td><td>RS-9843</td><td>Chirurgisch instrument</td></tr><tr><td>Steriele chirurgische doek</td><td>Medline</td><td>DYNJSD1092</td><td></td></tr><tr><td>Steriele chirurgische handschoenen</td><td>Medline</td><td>MSG2270</td><td></td></tr><tr><td>Steriele chirurgische stapler</td><td>Roboz</td><td>RS-9260</td><td>Chirurgisch instrument</td></tr><tr><td>Steriele chirurgische hechtingen</td><td>Roboz</td><td>RS-9262</td><td>Sluiting van de buikwand</td></tr><tr><td>Steriele hechting: Vicryl (polyglactine 910) 6-0, 27" Taper RB-1 Naald</td><td>Ethicon</td><td>J212G</td><td>Sluiten van de buikspier</td></tr><tr><td>Chirurgisch tape</td><td>Medline</td><td>MMM15271Z</td><td>Muis vastzetten in dorsale recumbancy</td></tr><tr><td>Spuit 10 ml x 2</td><td>Medline</td><td>SYR110010</td><td>Darmen spoelen met zoutoplossing en formaline</td></tr><tr><td>Weefselcassettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-665</td><td>Gerolde darmsegmenten. 4 per muis.</td></tr><tr><td>Handdoek of deken</td><td>Medline</td><td>GEM2140</td><td>Waterdeken cover</td></tr></tbody></table>

knaagdiermodel van intestinale ischemie-reperfusieschade via occlusie van de superieure mesenteriale slagader

Rodent Model of Intestinal Ischemia-Reperfusion Injury via Occlusion of the Superior Mesenteric Artery

Intestinale ischemie-reperfusieschade (IRI) wordt in verband gebracht met een groot aantal aandoeningen in zowel de diergeneeskunde als de menselijke geneeskunde. Intestinale IRI-aandoeningen, zoals maagdilatatie volvulus (GDV), mesenteriale torsie en koliek, worden waargenomen bij dieren zoals honden en paarden. Een eerste onderbreking van de bloedstroom zorgt ervoor dat weefsels ischemisch worden. Hoewel noodzakelijk om levensvatbaar weefsel te redden, kan daaropvolgende reperfusie verder letsel veroorzaken. Het belangrijkste mechanisme dat verantwoordelijk is voor IRI is de vorming van vrije radicalen bij reperfusie en herintroductie van zuurstof in beschadigd weefsel, maar er zijn veel andere componenten bij betrokken. De resulterende lokale en systemische effecten geven vaak een slechte prognose. 
Intestinale IRI is de afgelopen 50 jaar het onderwerp geweest van uitgebreid onderzoek. Een in vivo knaagdiermodel waarbij de basis van de superieure mesenteriale slagader (SMA) tijdelijk wordt geligeerd, is momenteel de meest gebruikte methode om intestinale IRI te bestuderen. Hier beschrijven we een model van intestinale IRI met behulp van isofluraan-anesthesie in 21% O2 medische lucht die reproduceerbaar letsel oplevert, zoals aangetoond door consistente histopathologie van de dunne darm. Weefselbeschadiging werd ook beoordeeld in de dikke darm, lever en nieren.

We demonstreerden een model van intestinale IRI bij muizen dat consistente en reproduceerbare resultaten opleverde. De dunne darm, de proximale dikke darm, de nieren en de lever werden doorgesneden en gekleurd met H&E. Een veterinair patholoog beoordeelde weefselbeschadiging met behulp van de eerder genoemde scoresystemen (tabel 1). Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van enkelvoudige factoranalyse van variantie (ANOVA), gevolgd door Tukey's post hoc met paarsgewijze vergelijkingen, die bepaalden of er al dan niet een significant verschil was in de gegevens binnen en tussen groepen. Een p-waarde kleiner dan of gelijk aan 0,05 werd beschouwd als de grens voor het vaststellen van statistische significantie. Alle statistische tests en grafieken werden uitgevoerd in spreadsheetsoftware (bijv. Microsoft Excel) met de add-on Real Statistics Resource Pack. Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM).
Microscopische laesiescores van de drie dunne darmsegmenten (twaalfvingerige darm, jejunum en ileum) waren significant verhoogd voor dieren die intestinale ischemie-reperfusieschade (IRI; N = 7) versus degenen die een schijnlaparotomie ondergingen (Sham; N = 6) (Figuur 2 en Figuur 3). De standaardfout voor deze gegevens was klein, wat de consistentie van de resultaten binnen en tussen groepen aantoont. Elk darmsegment in de Sham-groep leverde exact dezelfde gemiddelde Park/Chiu-score van 0,83 op. De SEM voor de twaalfvingerige darm, het jejunum en het ileum in de Sham-groep was respectievelijk 0,31, 0,40 en 0,31. De gemiddelde Park/Chiu-scores voor de twaalfvingerige darm, het jejunum en het ileum in de IRI-groep waren respectievelijk 4,07 ± 0,44, 4,14 ± 0,46 en 5,14 ± 0,40.
In deze studie stierf 50% (3/6) van de eerste muizen die 60 min ischemie en 120 min reperfusie ondergingen (60/120 groep). Twee van de drie muizen werden voorgelegd voor obductie. Beide muizen hadden epitheliale necrose, congestie en bloeding van de dunne darm. Bovendien hadden de muizen lymfocytalyse, een niet-specifieke verandering die gepaard gaat met fysiologische stress. Geen van beide muizen had laesies in het hart, de longen, de lever of de nieren. Het verkorten van de tijden tot 45 min ischemie en 90 min reperfusie en het toevoegen van 400 IE/kg heparine (45/90/H groep) verlaagde de mortaliteit tot 20% (1/5) zonder de darmletselscores te veranderen (Figuur 4). De gemiddelde Park/Chiu-score voor de 60/120-groep was 4,56 ± 0,38 (N = 3), en de gemiddelde score voor de 45/90/H-groep was 4,375 ± 0,38 (N = 4).
Microscopische bevindingen die wijzen op letsel in de proximale dikke darm, lever en nieren werden niet gezien bij de muizen van 60/120 of de muizen van 45/90/uur.
Tabel 1: Scoresystemen voor de darmen, nieren en lever. Darmschade werd beoordeeld met behulp van het Chiu/Park-systeem17. Nierschade werd beoordeeld met behulp van het Jablonski-scoresysteem18,19. Leverschade werd beoordeeld met behulp van het Suzuki-scoresysteem20,21. Deze tabel is aangepast met toestemming van scoresystemen gepresenteerd in Quaedackers et al.17, Du et al.19 en Behrends et al.21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64314/Table%201%20-%20Scoring%20Systems.zip" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64314/64314fig01.jpg"> Figuur 1: Locatie en isolatie van de superieure mesenteriale slagader (SMA). (A) Normaal gesproken ligt de SMA ventraal ten opzichte van de vena cava inferior en strekt zich uit naar de rechterkant van het dier. Het bevindt zich tussen de coeliakie-slagader en de nierslagader. Deze figuur is met toestemming overgenomen uit The Anatomy of the Laboratory Mouse van Margaret Cook (1965)22. (B) Bij deze procedure worden de darmen naar buiten gebracht en naar links gedraaid (bedekt met bevochtigd gaas op deze foto), zodat de SMA (gele pijl) links van de inferieure vena cava (blauwe pijl) ligt. Afkortingen: RK = rechter nier; D = twaalfvingerige darm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64314/64314fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64314/64314fig02.jpg"> Figuur 2: Dunne darmsegmenten gekleurd met hematoxyline en eosine. Secties van jejunum (A) en ileum (B) van muizen in de Sham-groep vertoonden villi die lang en dun waren zonder vervorming. Secties van jejunum (C) en ileum (D) van muizen in de IRI-groep vertoonden gebieden met necrose (sterretjes) en bloedingen met afstomping en vervorming van de resterende villi (pijlen). De foto's zijn van muizen die 45 minuten ischemie en 90 minuten reperfusie ondergingen en 400 IE/kg heparine kregen. De foto's zijn gemaakt met een vergroting van 20x met 10% zoom. Schaalbalk = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64314/64314fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64314/64314fig03.jpg"> Figuur 3: Park/Chiu-scores voor dunne darmsegmenten. Microscopische schade aan alle drie de darmsegmenten (twaalfvingerige darm, jejunum en ileum) voor dieren die intestinale ischemie-reperfusieschade (IRI) ondergingen, was significant toegenomen in vergelijking met dieren die schijnlaparotomie (Sham) ondergingen. * p < 0,05 voor IRI versus Sham. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64314/64314fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64314/64314fig04.jpg"> Figuur 4: Park/Chiu-scores voor dunne darm die 60 min ischemie en 120 reperfusie ondergaan versus 45 min ischemie en 90 min reperfusie met 400 IE/kg heparine. Het verkorten van de tijden van 60 min ischemie en 120 min reperfusie (60/120) tot 45 min ischemie en 90 min reperfusie met 400 IE/kg heparine (45/90/H) zorgde niet voor een statistisch significant verschil in Park/Chiu-letselscores van de dunne darm van muizen in de IRI-groep. Het verminderde echter wel de sterfte van 50% naar 20%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64314/64314fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

We beschrijven hoe we een veelgebruikt chirurgisch model van intestinale ischemie-reperfusieschade (IRI) bij knaagdieren kunnen genereren. De procedure omvat occlusie van de superieure mesenteriale slagader, gevolgd door het herstel van de bloedstroom. Dit model is nuttig voor studies die occlusieve oorzaken van intestinale IRI in zowel de diergeneeskunde als de menselijke geneeskunde onderzoeken.

Knaagdiermodel van intestinale ischemie-reperfusieschade via occlusie van de superieure mesenteriale slagader

Intestinal ischemia-reperfusion injury (IRI) is associated with a myriad of conditions in both veterinary and human medicine. Intestinal IRI conditions, ...

Begin met het dragen van een masker, haarbedekking en schone laboratoriumjas of scrubs. Plaats vervolgens de verdoofde muis op een schoon oppervlak gescheiden van het operatiegebied en plaats deze met een neuskegel die 1.5% isofluraan met 21% zuurstof levert. Injecteer vervolgens buprenorfine subcutaan in het dorsale cervicale thoracale gebied.Injecteer heparine ook intraperitoneaal om trombusvorming tijdens de occlusieperiode te voorkomen. Breng oogzalf aan op de ogen om schade aan het hoornvlies te voorkomen en verwijder haar uit de buik met een tondeuse. Verplaats de muis naar de verwarmde waterdeken in het operatiegebied.Nogmaals, monteer het met een neuskegel die isofluraan levert. Plaats vervolgens de muis in dorsale lighouding en bevestig de ledematen aan de tafel met chirurgische tape. Controleer de lichaamstemperatuur van het dier met behulp van een knaagdierspecifieke rectale thermometer.Voer na het grondig desinfecteren van de buik een teenknijptest uit om er zeker van te zijn dat het dier volledig verdoofd is. Draag ten slotte steriele handschoenen en drapeer de operatieplaats aseptisch. Maak eerst een ventrale incisie in de buiklijn van drie tot vijf centimeter in de huid met behulp van een scalpelmesje nummer 15.Scheid 0,5 centimeter van de huidrand van de onderliggende spierfascia om later nietjes te kunnen plaatsen. Vervolg vervolgens de incisie door de buikwand langs de lineaire alba met behulp van een veerbelaste microschaar en plaats een retractor. Plaats steriele gaasjes bevochtigd met warme steriele zoutoplossing rond het operatiegebied.Verwijder de dunne darm uit de buikholte. Draai het craniaal en naar links van het dier en plaats het op de bevochtigde kussentjes. Plaats nog een bevochtigd gaasje over de weefsels om uitdroging te voorkomen.Lokaliseer de superieure mesenteriale slagader, of SMA, ventraal ten opzichte van de inferieure vena cava, caudaal ten opzichte van de coeliakie-slagader en craniaal ten opzichte van de nierslagader. Ontleed het uit de buurt van het omringende bindweefsel. Plaats een atraumatische microvasculaire clip langs de basis van de SMA, waar deze zich vertakt van de abdominale aorta.Controleer ischemie van de dunne darm door de kleurverandering van roze naar lichtwit op te merken. Breng de ingewanden terug naar hun oorspronkelijke positie in de buikholte voor de duur van de ischemische periode. Verwijder het oprolmechanisme en bedek de incisie met vochtig gaas.Verwijder na een periode van 45 minuten ischemie de afsluitende clip. Controleer het herstel van de bloedstroom door een mesenteriale pulsatie en een rode kleur te observeren. Breng warme, steriele zoutoplossing intraperitoneaal aan om de juiste hydratatie te behouden.Sluit vervolgens de buikspieren met een 6-0 polyglactine 910 hechtdraad. Dien bupivacaïne plaatselijk toe langs de incisielijn van de spieren voor pijnverlichting. Sluit de huid met chirurgische nietjes of wondclips.Breng de muis terug naar een warme kamer op een circulerende waterdeken. Laat de muis 90 minuten herstellen en controleer de muis op tekenen van pijn of angst. Verzamel na het uitvoeren van humane euthanasie de gewenste weefsels zoals de leverkwabben, inclusief de linker laterale, linker mediane en rechter mediane kwabben.Verzamel vervolgens beide nieren. Snijd de linkernier in de lengterichting en de rechternier in dwarsdoorsnede. Verzamel ten slotte de volledige lengte van de dunne en dikke darm.Om de dunne darmsegmenten in secties van gelijke lengte te verdelen, vouwt u de dunne darm in een Z-vorm waarbij de bovenste lijn de twaalfvingerige darm is, de middelste lijn het jejunum en de onderste lijn het ileum. Het resterende deel van de darm is de dikke darm. Spoel het lumen van de darmsegmenten met zoutoplossing met behulp van een spuit van 10 milliliter die is bevestigd met een angiokatheter van 20 gauge.Knip vervolgens de lengte van de darmen af met een micro-ontleedschaar en leg elk darmsegment plat met de luminale kant naar boven. Gebruik een spuit van drie milliliter die is bevestigd met een naald van 27 gauge en breng royaal 10% gebufferde formaline druppelsgewijs aan om de gehele lengte van het slijmvlies te bedekken. Rol vervolgens elk segment in de omtrek rond een tandenstoker, waarbij u ervoor zorgt dat het proximale gedeelte het binnenste deel van de rol vormt en het lumen naar binnen wijst.Na het rollen moet de darm eruit zien als een Zwitsers broodje. Plaats de spiraal van de afzonderlijke Swiss Roll met de voorkant naar boven in de afzonderlijke gelabelde tissuecassettes. Plaats ten slotte de tissues in gelabelde injectieflacons gevuld met 10% gebufferde formaline om ze op kamertemperatuur te fixeren.Na intestinale IRI toonde H&E-kleuring van het jejunum en ileum van muizen in de schijngroep lange en dunne villi zonder vervorming. Terwijl secties van de muizen in de IRI-groep gebieden van necrose en bloeding vertoonden met afstomping en vervorming van de resterende villi. Verder was de microscopische schade aan alle drie de dunne darmsegmenten voor dieren die IRI ondergingen significant toegenomen in vergelijking met dieren die een schijnlaparotomie ondergingen.

rodent-model-intestinal-ischemia-reperfusion-injury-via-occlusion

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

We introduceren een chirurgische methode experimentele ischemie / reperfusie (I / R) letsel veroorzaken simuleren myocardiaal infarct (MI) in muismodellen die zorgt voor meer duidelijkheid in positionering van de ligatie van de LAD (LAD) om de reproduceerbaarheid te verhogen MI van experimenten in muizen.

Een muizenmodel van myocard ischemie-reperfusie schade door de eileiders van de LAD

Hier beschrijven we de gedetailleerde procedure van intestinale ischemie-reperfusie bij muizen waardoor reproduceerbaar letsel zonder sterfte aan de standaardisatie van deze techniek in het veld bevorderen. Dit model van intestinale ischemie-reperfusieschade kan worden gebruikt om de cellulaire en moleculaire mechanismen van schade en regeneratie te bestuderen.

Muizenmodel van Intestinale ischemie-reperfusie schade

We beschrijven een muismodel van een beroerte veroorzaakt door de occlusie van de middelste hersenslagader met behulp van een met siliconen omhulde naald. Het protocol kan worden toegepast om een permanente occlusie of een tijdelijke ischemie te induceren, gevolgd door reperfusion.

Inductie van ischemische beroerte en ischemie-reperfusie in Muizen met behulp van het Midden-slagader occlusie Techniek en Visualisatie van Infarct Area

Intestinale obstakels zijn een gedeeltelijke of volledige verstopping van de darm die leiden ernstige buikpijn, misselijkheid tot kan, braken, en het voorkomen van de passage van ontlasting. Deze procedure voor het maken van intestinale gedeeltelijke obsructions in muizen is betrouwbaar in het bestuderen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de pathologische celgroei en dood in de darm.

Een muismodel van intestinale gedeeltelijke obstructie

Dit protocol kan lezers te succesvol een varkens model van gesegmenteerde intestinale ischemie en vervolgens isoleren cultuur intestinale stamcellen voor de studie van epitheliale reparatie na letsel.

De cel van de stam van de intestinale isolatie en cultuur in een varkens Model van gesegmenteerde kleine intestinale ischemie

Een muismodel van cerebrale ischemie-reperfusie is gevestigd te onderzoeken de pathofysiologie van een beroerte. We distally de rechts midden cerebrale slagader en rechts gemeenschappelijke halsslagader afbinden en bloedstroom herstellen na 10 of 40 min van ischemie.

Muismodel van twee-schip occlusie van cerebrale ischemie-reperfusie

Hier beschrijven we een muismodel van retinale ischemie door voorbijgaande bilaterale gemeenschappelijke halsslagader occlusie met behulp van eenvoudige hechtingen en een klem. Dit model kan nuttig zijn voor het begrijpen van de pathologische mechanismen van retinale ischemie veroorzaakt door cardiovasculaire afwijkingen.

Een Murine-model van ischemisch netvliesletsel veroorzaakt door voorbijgaande bilaterale gemeenschappelijke halsslagader Occlusie

Myocardiale ischemie-reperfusie model van rattenhart wordt verbeterd door gebruik te maken van een zelfgemaakt retractor, polyvinylchloride buis, en een unieke knoopmethode. Elektrocardiogram, trifenyltetrazoliumchloride en histologische kleuring en procentuele overlevingsanalyseresultaten toonden aan dat de verbeterde modelgroep hogere succes- en overlevingskansen heeft dan de reeds bestaande modelgroep.

Verbeterd knaagdiermodel van myocardiale ischemie en reperfusieletsel

Het huidige protocol beschrijft een ratmodel van occlusie/reperfusie van de middelste hersenslagader dat de anatomische structuur van hersenvaten behoudt zonder schade te veroorzaken.

Een rattenmodel van middelste cerebrale arteriële occlusie/reperfusie zonder de anatomische structuur van cerebrale vaten te beschadigen

Deze studie beschrijft een model van acuut longletsel na viscerale ischemie-reperfusie tijdens supra-coeliakie aorta-kruisklemming via laparotomie bij ratten. Het maakt het mogelijk om zowel de klinische als biologische effecten van aortaklemmen te onderzoeken, evenals de impact van ischemie-reperfusie op onderliggende organen en longletsels op afstand.

Een model van acuut longletsel na viscerale ischemie-reperfusie door supracoeliakie aortakruisklemming bij ratten

Dit protocol presenteert een methode voor het induceren van mesenteriale ischemie-reperfusieschade en het visualiseren van neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) in mesenteriale venulen met behulp van intravitale microscopie. De bloedstroom in de superieure mesenteriale slagader werd gedurende 1 uur beperkt, gevolgd door reperfusie, waardoor directe kwantificering van leukocytenadhesie en NETosis mogelijk was.

Visualisatie van extracellulaire neutrofiele vallen in mesenteriale venulen na mesenteriale ischemie-reperfusieschade via intravitale microscopie

Leer een chirurgisch knaagdiermodel voor intestinale ischemie-reperfusieschade via occlusie van de superieure mesenteriale slagader. Deze methode helpt onderzoekers de pathofysiologie van darmischemie te bestuderen.

Knaagdiermodel van intestinale ischemie-reperfusieschade via occlusie van de superieure mesenteriale slagader

Meer video's verkennen