Automatische scheiding en verzameling van kankergerelateerde stoffen uit klinische monsters
13 januari 2023
Dit artikel beschrijft de toepassing van geautomatiseerde apparatuur om stoffen, zoals celvrij DNA en circulerende tumorcellen, eenvoudig en efficiënt te scheiden en te verzamelen uit volbloed.
Ons protocol is gebruiksvriendelijk. Met behulp van deze techniek kan iedereen gemakkelijk componenten uit het bloed isoleren. Vervuiling kan worden geminimaliseerd en materialen kunnen nauwkeurig worden gescheiden.
Met automatisering en de vaststelling van dit protocol kunnen onderzoekers gemakkelijk kankergerelateerde stoffen met een hoge zuiverheid verkrijgen, wat nuttig is voor verschillende downstream-studies. In het bijzonder wordt verwacht dat het belangrijke voordelen zal bieden voor eindgebruikersonderzoek. Jay Jeong, een senior onderzoeker en assistent-manager bij het Cancer Genomics Research Institute, demonstreert hun procedure.
Om te beginnen laadt u de LBx 1-cartridge door het cartridgetype te selecteren op het touchscreenpaneel van het instrument. Druk op de pijlknop om het aantal monsters te wijzigen. Open vervolgens de instrumentdeur en plaats alle te gebruiken cartridges in volgorde van het nummer op de cartridgehouder.
Voor in totaal vier cartridges plaatst u de dummycartridge in de lege ruimte van de cartridgehouder. Gebruik het steunwiel om de cartridge te monteren en draai de borgmoer vast om deze vast te zetten. Sluit de deur en druk op de run-knop op het touchpad-scherm.
Het instrument sluit de kleppen op de patronen, wat ongeveer 30 seconden duurt. Volg het bericht om de deur te openen. Verwijder het steunwiel en verwijder de met de klep gesloten cartridge uit de cartridgehouder.
Pipetteer maximaal 10 milliliter van een volbloedmonster met behulp van een serologische pipet. Steek de pipetpunt diep in de monsterinlaat van de patroon en injecteer langzaam het volbloedmonster. Nadat u de patronen in het instrument hebt geplaatst, sluit u de deur van het instrument en drukt u op de knop OK.
Plasma en buffy jassen worden automatisch gescheiden van volbloed, wat ongeveer 30 minuten duurt. Zodra het plasma en de buffy coat zijn gescheiden, verschijnt er een bericht op het scherm vergezeld van een alarmgeluid. Stop het alarm door de deur te openen of op de stopknop te drukken.
Open de deur. Verwijder de cartridge en plaats deze op tafel. Herstel drie milliliter plasma uit de plasma-uitlaat met behulp van een pipetpunt van één milliliter.
Herstel vervolgens drie milliliter van de buffy-vacht uit de buffy coat-uitlaat met behulp van een pipetpunt van één milliliter. Laad vervolgens de LBx 2-cartridge door de cartridgenaam op het touchscreenpaneel van het instrument te selecteren. Druk op de pijlknop om het aantal monsters te wijzigen en volg dezelfde procedure als voor de LBx 1-cartridge om de cartridge in de cartridgehouder te plaatsen.
Nadat u de cartridge hebt geplaatst en de deur hebt gesloten, drukt u op de run-knop op het touchpad-scherm. Volg de eerder beschreven procedure om de met de klep gesloten cartridge uit de cartridgehouder te verwijderen en op tafel te plaatsen. Pipetteer de dichtheidsgradiëntoplossing met behulp van een serologische pipet.
Steek de pipetpunt diep in de inlaat van de patroon en injecteer de oplossing langzaam. Pipetteer vervolgens het volbloedmonster en injecteer het langzaam in de monsterinlaat. Nadat u de cartridge hebt geplaatst en vastgezet, sluit u de deur en drukt u op de knop OK.
Zodra het plasma en de PBMC automatisch van volbloed worden gescheiden, verschijnt er een bericht vergezeld van een alarmgeluid. Open de deur en verwijder de patroon. Herstel drie milliliter plasma uit de plasma-uitgang met behulp van een pipetpunt van één milliliter en herstel vervolgens drie milliliter van de PBMC-uitgang.
Evenzo, voor de FAST-auto cartridge, na het verwijderen van de klep-gesloten cartridge uit de cartridgehouder, injecteert u zes milliliter van de PBS-oplossing in de PBS-inlaat van de cartridge. Pipetteer vervolgens drie milliliter volbloed of buffy coat verkregen uit LBx 1, of PBMC-monster verkregen uit LBx 2, en injecteer het monster langzaam in de monsterinlaat van de patroon. Nadat u de cartridge hebt geplaatst en vastgezet, sluit u de deur en drukt u op de knop OK.
Zodra de automatische verrijking van CTC's is voltooid, stopt u het alarm. Verwijder de cartridge en plaats de achterplaatverwijderaar, of BPR, in de vier gaten aan de voorkant van de cartridge. Druk op de donkerblauwe vleugel met de duimen van beide handen en druk vervolgens op het lichtblauwe lichaam totdat het klikt.
Verwijder de cartridgebehuizing voorzichtig door deze op te tillen. Pak het filtermembraan heel voorzichtig bij de rand met een pincet en plaats het membraan in een buis van 1,5 milliliter voor nucleïnezuurbereiding of op een schuifglas voor de kleuring. Herstel indien nodig het gefilterde bloed naar de bloeduitlaat met behulp van een pipetpunt van één milliliter.
De geëxtraheerde cfDA's werden geëvalueerd met behulp van Bioanalyzer en cfDNA-schermtapes werden gebruikt in combinatie met een elektronische ladder. De groene lijn werd gebruikt om de ladder en het monster uit te lijnen. De driehoekmarkeringen geven de DNA-band aan.
De meeste cfDNA's hebben een lengte van 166 basenparen en sommige bestaan in gehele veelvouden van lengte. Meestal meet de concentratie van cfDNA tot de grootte van 50 tot 700 basenparen. Hoewel er een verschil is in de hoeveelheid verkregen uit elk individueel monster, zoals 8,47 nanogram per milliliter en 5,2 nanogram per milliliter, waren de resultaten van cfDNA-extractie in alle gevallen goed voor zowel de concentratie als de grootteverdeling.
Deze resultaten geven aan dat de LBx 1-methode plasma dat cfDNA bevat nauwkeurig scheidt. In FAST-auto werd het membraan verwijderd en gekleurd met fluorescerende antilichamen om CTC's en witte bloedcellen te detecteren. Het gebrandschilderde membraan, geplaatst op glazen dia's, werd waargenomen onder een fluorescentiemicroscoop.
Na membraankleuring vertonen cellen DAPI- of nucleair-positieve signalen in blauw, terwijl EpCAM en CK of CTC's positief in het groen worden gemarkeerd en CD45- of WBC-positieve in rood worden gemarkeerd. Het is niet moeilijk om het membraan te verwijderen. Het is echter noodzakelijk om voorzichtig te zijn met het verlies en de besmetting van CTC's.
Volbloed, PBMC en buffy coat zijn allemaal beschikbaar. In plaats daarvan hoeft u alleen maar het hele volume in te stellen. Andere vloeistoffen kunnen ook worden gebruikt, hoewel testen vereist is.
Deze techniek kan direct in ziekenhuizen worden gebruikt en de stof kan snel worden verkregen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een gebruiksvriendelijk protocol voor de geautomatiseerde scheiding en collectie van stoffen uit volbloed, waaronder celvrij DNA en circulerende tumorcellen. Deze techniek minimaliseert contaminatie en maakt een nauwkeurige scheiding mogelijk, wat een extractie met hoge zuiverheid van kankergerelateerde stoffen voor vervolgstudies faciliteert.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Geautomatiseerde bloedverwerking
- Kankorgenomica
- Extractie van stoffen
Achtergrond
- Belang van het isoleren van kankergerelateerde stoffen uit bloed.
- Uitdagingen bij het minimaliseren van contaminatie tijdens extractie.
- Noodzaak van efficiënte protocollen in kankeronderzoek.
- Rol van automatisering bij het verhogen van de efficiëntie van onderzoek.
Doel van de studie
- Om een gebruiksvriendelijk protocol te ontwikkelen voor substantie-extractie.
- Om de zuiverheid van de geëxtraheerde materialen te verbeteren.
- Om vervolgstudies in kankeronderzoek te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Geautomatiseerde apparatuur voor scheiding.
- Vaststellen van het protocol voor toegankelijkheid voor de gebruiker.
- Minimaliseren van contaminatie tijdens extractie.
- Verzamelen van celvrij DNA en circulerende tumorcellen.
Belangrijkste resultaten
- Hoge zuiverheid van de geëxtraheerde stoffen.
- Effectieve isolatie van kankergerelateerde componenten.
- Demonstratie van het protocol door een senior onderzoeker.
- Potentiële voordelen voor onderzoek door eindgebruikers.
Conclusies
- Het geautomatiseerde protocol verhoogt de extractie-efficiëntie.
- Het biedt aanzienlijke voordelen voor kankeronderzoek.
- De toegankelijkheid van het protocol kan diverse studies ondersteunen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Geautomatiseerde scheiding van kankergerelateerde stoffen uit klinische monsters pakt een kritiek knelpunt in liquid biopsy-workflows aan door hoogzuivere, reproduceerbare extractie van analyten zoals cfDNA en CTCs mogelijk te maken. Deze functionaliteit vergroot het voorspellende vertrouwen in vroege ontdekking en translationeel onderzoek door contaminatie te minimaliseren en de monstervoorbereiding te standaardiseren. De flexibiliteit van het platform ondersteunt diverse downstream omics- en biomarkerstudies, wat de besluitvorming over het portfolio bij cruciale kantelpunten versterkt.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt precieze isolatie van cfDNA en CTC's mogelijk voor hypothese-gestuurde analyse van kankerpaden.
- Vermindert biologische ambiguïteit door hoogzuivere analyten te leveren voor functionele targetvalidatie.
- Ondersteunt het voorspellende vertrouwen bij biomarkersstudies en mechanistische studies in een vroeg stadium.
Screening & Assayontwikkeling
- Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare monstervoorbereiding voor downstream moleculaire en cellulaire assays.
- Faciliteert assay-ontwikkeling door consistent inputmateriaal over verschillende batches en studies te leveren.
- Maakt schaalbare screening-workflows mogelijk door automatisering en het minimaliseren van operatorvariabiliteit.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij translationele biomarkerstrategieën door de extractie van klinisch relevante analyten uit patiëntenmonsters te ondersteunen.
- Handhaaft continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door de integriteit en vergelijkbaarheid van monsters te waarborgen.
- Vermindert de risico's bij beslissingen over verdere ontwikkeling door robuuste, contaminatievrije gegevens te leveren voor cross-functionele teams.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit geautomatiseerde scheidingsplatform is geïntegreerd op de interface tussen monstername en downstream moleculaire analyse, waardoor vroege ontdekking, lead-identificatie en translationele onderzoeksworkflows met elkaar worden verbonden.
- Discovery Biology: Ondersteunt het testen van hypothesen en het verduidelijken van pathways door ziekte-relevante analyten uit bloed te isoleren.
- Screening: Levert reproduceerbare monsters die klaar zijn voor assays voor moleculaire en cellulaire screeningsplatforms.
- Analytics: Maakt kwantitatieve meting van de cfDNA-concentratie en CTC-enumeratie mogelijk voor vergelijkende studies.
- Translationeel Onderzoek: Faciliteert de afstemming van biomarkers en preklinische continuïteit door monster-inputs te standaardiseren.
- Enterprise Hergebruik: Biedt een herbruikbare, geautomatiseerde capaciteit die aanpasbaar is aan meerdere monstertypen en onderzoeksdoelstellingen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en de validatie van doelwitten door het leveren van analyten met een hoge zuiverheid en minimale contaminatie.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid, schaalbaarheid en standaardisatie tussen onderzoeksteams en locaties.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go-beslissingen en de kapitaalefficiëntie door biologische risico's in een laat stadium te verminderen.
- Impact op de portfolio: Maakt risicogestuurde prioritering en verdere ontwikkeling van biomarker- en therapeutische programma's mogelijk.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist technische expertise in monsterverwerking en downstream moleculaire analyse.
- Vereist compatibele instrumentatie en analytische infrastructuur voor geautomatiseerde workflows.
- Vereist standaardisatie van protocollen en kwaliteitscontrolemaatregelen tussen teams.
- Aanpasbaar aan diverse bloedafgeleide monstertypes; validatie is vereist voor andere lichaamsvloeistoffen.
- Zorgvuldige behandeling is noodzakelijk om verlies of contaminatie van zeldzame analyten, zoals CTCs, te voorkomen.
