Spermaverzameling en computerondersteunde spermaanalyse in het Teleost-model Japanse Medaka (Oryzias latipes)
6 oktober 2022
Dit artikel beschrijft twee snelle en efficiënte methoden voor het verzamelen van sperma van het kleine modelvis medaka (Oryzias latipes), evenals een protocol voor het betrouwbaar beoordelen van de spermakwaliteit met behulp van computerondersteunde spermaanalyse (CASA).
Deze techniek maakt het mogelijk om milt te bemonsteren van een kleine modelvis, Japanse Madaka, en de kwaliteit ervan op een consistente manier te onderzoeken. Specifiek spermaverzameling door buikmassage maakt herhaalde bemonstering op dezelfde vis mogelijk, omdat deze aanpak niet invasief is. Bovendien kan deze techniek worden toegepast voor Madaka sperma cryo conservering.
Spermakwaliteit is een essentiële indicator voor bevruchtingssucces en daarom een belangrijke parameter om te analyseren in ecologische en hele productieve fysiologiestudies. Om te beginnen, bereid een zachte spons, door deze te snijden om zelfvoldaan in een petrischaaltje te passen. Knip een rechte lijn in het midden van de spons, die lang genoeg is om de vis op zijn ventrale kant omhoog te houden.
Na het verdoven van de vis, droog de buik van de vis door deze voorzichtig af te vegen met een papieren handdoek. Plaats de vis in de trog van de vochtige spons met de ventrale kant naar boven, zodat de kieuwen worden blootgesteld aan de verdovingsoplossing in de spons. Als het gebied rond de cloaca nat is, droog dan voorzichtig de onderkant van de buik met een wegwerpdoekje.
Plaats onder een ontleedmicroscoop de micropipet met een bijgevoegde aspiratorbuis tegen de cloaca van de vis. Masseer nu de buik van de vis door zachtjes te knijpen met een stompe gladde tang in een rostrale tot caudale beweging. Voor herstel van de vis, laat het los van de spons in het eerder voorbereide herstelwater voordat u de vis terugbrengt naar het aquariumsysteem.
Breng de verzamelde milt meerdere keren over in een buis met voorverwarmde activeringsoplossing en pipetoplossing meerdere keren op en neer met behulp van de aspiratorbuis. Homogeniseer het verdunde sperma voorzichtig door vóór de analyse over de buisjes te vegen. Na het euthanaseren van de vis drogen zoals eerder aangetoond en plaats de vis onder een ontleedmicroscoop met de linker laterale kant naar boven gericht.
Knip met behulp van een kleine ontleedschaar een flap dorsaal van de cloaca en vervolgens over de ribben naar de kieuwen om de inwendige organen bloot te leggen. Lokaliseer de teelballen en snijd het hulpstuk aan beide uiteinden met een fijne tang. Verwijder de teelballen en breng ze over in een voorbereide buis met voorverwarmde activeringsoplossing.
Gebruik de tang om de teelballen meerdere keren tegen de zijkant van de buis te verpletteren om het sperma vrij te maken, wat kan worden gevisualiseerd door het enigszins troebele uiterlijk van de oplossing. Om de analyse te starten, opent u de spermaanalysesoftware en selecteert u de beweeglijkheidsmodule. Stel de configuraties in de software in voor alle parameters.
Plaats een voorverwarmde wegwerpschuif van 20 micrometer telkamer onder de microscoop op een verwarmd podium, ingesteld op 27 graden Celsius. Pipetteer het monster in de kamer op de dia totdat het vol is, maar zonder overvulling. Veeg overtollige monsters voorzichtig weg van de ingang van de kamer om driftbeweging van cellen in de oplossing te voorkomen.
Selecteer analyseren om het monster onder de microscoop te bekijken. Zorg ervoor dat de microscoop gefocust is en selecteer opnieuw analyseren om het sperma in het veld op te nemen. Verplaats de dia naar een nieuw gebied van het monster in het frame en herhaal de procedure voor drie tot vijf verschillende gezichtsvelden, waarbij luchtbellen, celmassa's of artefacten worden vermeden.
Om de resultaten te bekijken, selecteert u de resultaten en dubbelklikt u op een veld om het individuele veld te visualiseren of om handmatig te controleren op verkeerd gelabelde of niet-gevolgde spermatozoa. Klik indien nodig met de rechtermuisknop op individuele spermatozoa om de beweeglijkheid opnieuw te labelen. In de huidige studie werd computerondersteunde spermaanalyse gebruikt om verschillende snelheids- en bewegingsparameters vast te leggen.
De berekende waarden omvatten de rechtheidsindex, lineariteitsindex en wiebel. De osmolariteit van de activeringsoplossingen had invloed op de beweeglijkheid van het sperma door de dissectie van de teelballen. Het sperma was immoreel in aquariumwater, maar beweeglijk in HBSS met hoge en lage osmolariteit.
De beweeglijkheid is echter aanzienlijk verminderd met 36 milli osmol per kilogram, vergeleken met oplossingen met een hogere osmolaliteit. Motiliteit werd ook beïnvloed door de spermaverzamelingsmethode, waarbij het sperma aanzienlijk beweeglijker is in de testisdissectiemethode in vergelijking met buikmassage. Ook was een hoger percentage van de cellen progressief en meer cellen waren gemiddeld of snel bewegend.
Het percentage beweeglijkheid en progressiviteit zijn aanzienlijk hoger in het sperma dat is opgeslagen bij vier graden Celsius of op ijs, vergeleken met 27 graden Celsius opslag. De omgevings- en huisvestingsomstandigheden hadden ook een lichte invloed op de beweeglijkheid van het sperma. Er werd geen significant verschil in beweeglijkheid van het sperma gezien in het sperma dat na en vóór het paaien werd verzameld.
Mannetjes die een maand zonder vrouwtjes werden gehuisvest, vertoonden een hoge beweeglijkheid, maar het verschil was onbeduidend. Voor spermaverzameling door buikmassage is training nodig om de juiste tangdruk en beweging te leren en om feced besmetting te voorkomen. Deze techniek zal zeer nuttig zijn om bijvoorbeeld de effecten van verschillende verontreinigende stoffen op de mannelijke vruchtbaarheid te onderzoeken in ecotoxicologial studies, waar Medaka een veelgebruikt model is.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert twee efficiënte technieken voor het verzamelen van sperma van het kleine vismodel, medaka (Oryzias latipes). De besproken methoden richten zich op buikmassage en testisdissectie, naast een protocol voor het beoordelen van de spermakwaliteit met behulp van computer-ondersteunde spermaanalyse (CASA).
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Onderzoeksgebied
- Reproductieve biologie
- Ecotoxicologie
- Visfysiologie
Achtergrond
- Medaka is een veelgebruikt modelorganisme voor vruchtbaarheidsstudies.
- Spermakwaliteit is cruciaal voor succesvolle bevruchting.
- Niet-invasieve methoden zijn essentieel voor herhaalde bemonstering.
Gebruikte methoden
- Verzameling van sperma via buikmassage en testisdissectie
- Modelorganisme: Medaka (Oryzias latipes)
- Computer-ondersteunde spermaanalyse (CASA)
Belangrijkste resultaten
- De spermamotiliteit varieert aanzienlijk met de gebruikte verzamelingsmethode.
- Omgevingsomstandigheden hebben invloed op de spermakwaliteit, hoewel sommige factoren geen significante effecten hadden.
- Hoge motiliteitsniveaus werden bereikt door testisdissectie vergeleken met buikmassage.
Conclusies
- De studie biedt betrouwbare methoden voor het verzamelen van sperma en het beoordelen van de kwaliteit ervan bij medaka.
- Deze technieken kunnen onderzoek naar de effecten van verontreinigingen op mannelijke vruchtbaarheid bevorderen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of sperm quality in Japanese medaka enables objective evaluation of male fertility, supporting mechanistic studies in reproductive biology and ecotoxicology. Computer-assisted sperm analysis (CASA) provides standardized, reproducible outputs critical for early discovery and target validation in vertebrate fertility research. These capabilities facilitate predictive confidence and risk-adjusted decision-making in translational and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of environmental, physiological, and genetic factors affecting male fertility.
- Supports functional validation of reproductive targets through objective sperm quality metrics.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating variables impacting motility and progressivity.
- Provides quantitative endpoints for hypothesis-driven fertility studies.
Screening & Assay Development
- Delivers validated protocols for sperm collection and analysis in small vertebrate models.
- Standardizes motility and progressivity measurements for assay reproducibility.
- Enables scalable, repeatable workflows for compound or environmental screening.
- Supports reliable evaluation of toxicological or pharmacological impacts on reproductive endpoints.
Translational & Preclinical Research
- Aligns sperm quality metrics with disease-relevant and environmental exposure models.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation of reproductive toxicity or efficacy.
- Provides risk-adjusted data for advancing candidate interventions or environmental assessments.
- Strengthens predictive value for cross-species translational research in vertebrate fertility.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling standardized sperm quality assessment in small fish models, supporting both mechanistic studies and translational research.
- Discovery Biology: Objectively quantifies sperm motility, progressivity, and concentration to clarify reproductive pathways.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for evaluating environmental or compound effects on fertility.
- Analytics: Generates velocity, linearity, and motility indices for robust statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Bridges environmental, physiological, and genetic studies to preclinical model validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for fertility assessment in diverse small vertebrate models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in reproductive studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of sperm analysis workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency in fertility and ecotoxicology pipelines.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of reproductive and environmental research programs.
Implementation Considerations
- Requires training in non-invasive and dissection-based sperm collection techniques.
- Needs access to computer-assisted sperm analysis instrumentation and software.
- Demands cross-team standardization of sample handling and analysis parameters.
- Adaptable to other small teleost or vertebrate models with protocol optimization.
- Careful technique is necessary to avoid sample contamination and ensure data integrity.
