Name: De isolatie van stromende mesenteriale lymfe bij muizen om in vivo kinetiek van lipideabsorptie in de voeding en chylomicronsecretie te kwantificeren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-30T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Leer de isolatie van stromende mesenteriale lymfe bij muizen om lipideabsorptie en chylomicronsecretie in vivo te kwantificeren. Deze methode vermindert dierstress en verhoogt de overlevingskans tijdens metabool onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn de Cystic Fibrosis Foundation (Pilot and Feasibility Award 1810, aan ABK), de Rainin Foundation (Synergy Award, aan PI GJ Randolph en Co-I ABK) en de National Institutes of Health (R01DK118239, R03DK116011 aan ABK) zeer dankbaar voor hun steun aan deze studies.

Alle chirurgische procedures zijn goedgekeurd door de University of Pittsburgh Internal Animal Care and Use Committee [Protocol # 20047008] en voldoen aan de NIH-gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. C57BL6/J mannelijke muizen, 8-14 weken oud, werden gebruikt voor de huidige studie. De muizen werden verkregen uit een commerciële bron (zie Tabel van Materialen). Alle muizen werden gehuisvest op een 12 uur durende licht/donker cyclus met ad libitum toegang tot standaard chow en water.
1. Voorbereiding van dieren
<ol><li>Afhankelijk van het experimentele ontwerp, voer de muizen of laat ze vasten. OPMERKING: Een nacht vasten is niet nodig, tenzij er zorgen zijn over verschillen in de snelheid van maaglediging.</li>
	<li>Induceer anesthesie door 5% isofluraangas en zorg voor een goede verdoving door staart- en teenknijpen. Eenmaal verdoofd, houdt u de muizen op een goed verdovingsvlak met 2% -3% isofluraangas en plaatst u ze met tape op het chirurgische platform.</li>
	<li>Houd de muizen warm op een verwarmd chirurgisch platform dat gebruik maakt van circulerend warm water (zie materiaaltabel).</li>
</ol>2. Chirurgie en experimenteel ontwerp
<ol><li>Begin de operatie door veterinzalf op de ogen aan te brengen, de buik te scheren en antiseptische chirurgische scrub (zie materiaaltabel) op de operatieplaats aan te brengen. Dit steriliseert de incisie en vermindert de generatie van vacht in de lucht tijdens de middellijnincisie.</li>
	<li>Zorg voor een steriel werkgebied door gebruik te maken van steriele instrumenten, gordijnen en andere benodigde apparatuur en benodigdheden.</li>
	<li>Injecteer de eerste dosis carprofen (zie tabel met materialen) voor pijnverlichting (i.p.) in een dosis van 5 mg/kg.</li>
	<li>Pak de huid vast met een pincet en maak een buikincisie in de middellijn met een kleine schaar. Snijd naar het borstbeen (nooit boven) en snijd af tot het liesvet. Knip vervolgens met de schaar apart door de spierlaag. OPMERKING: Steriliseer alle apparatuur voor gebruik.</li>
	<li>Gebruik het oprolmechanisme om de peritoneale ingewanden uit de weg te bewegen totdat het lymfekanaal zichtbaar is.</li>
	<li>Gebruik een met zoutoplossing gedrenkte Q-tip (zie tabel met materialen) en beweeg de lever naar de rechterbovenkant van het lichaam en de darmen en maag naar de linkerkant van het dier.</li>
	<li>Strek de twaalfvingerige darm dwars naar links om de superieure mesenteriale slagader en het darmlymfekanaal bloot te leggen.</li>
	<li>Bereid een canuleslang van 30-40 cm lang voor door een stompe naald in de canuleslang te steken (zie materiaaltabel) en spoel een kleine hoeveelheid heparine (1.000 U / L) door de buis met een spuit van 1 ml. OPMERKING: Lymfestroom wordt ondersteund door de zwaartekracht om naar beneden en in de microcentrifuge-verzamelbuizen op ijs te stromen. Afhankelijk van waar de opvangijsemmer zich naast de chirurgische opstelling bevindt, moet de lengte van de canulebuis mogelijk worden aangepast.</li>
	<li>Gebruik een schaar om een schuine kant aan de punt van de canulebuis te knippen.</li>
	<li>Maak een ondiepe incisie met een irisschaar (zie tabel met materialen) in het lymfekanaal op ongeveer 5 mm van het uiterlijk in de dunne darm.</li>
	<li>Houd de canuleslang vast met een fijne tang en steek de punt voorzichtig omhoog in het kanaal. OPMERKING: Het is belangrijk om de canule niet te ver in het kanaal te duwen, omdat dit de lymfestroom kan voorkomen wanneer de ingetrokken organen worden teruggebracht naar hun oorspronkelijke positie.</li>
	<li>Het lymfekanaal is veel te kwetsbaar voor de manipulaties die gepaard gaan met het vastbinden van de katheter met een hechting. Gebruik in plaats daarvan een druppel cyanoacrylaatlijm (zie materiaaltabel) om de lymfecanule in het mesenteriale lymfekanaal te lijmen.</li>
	<li>Controleer op de melkachtige, witte lymfe (als pre-operatieve olijfolie werd gebruikt) of heldere lymfe (als muizen vóór de operatie nuchter zijn) die onmiddellijk door de lymfefistelcanule begint te stromen. OPMERKING: Controleer of de lymfecanule met succes is geplaatst en lymfe stroomt; Ga verder met de plaatsing van de intraduodenale canule.</li>
	<li>Prik met een naald van 18 G een gat door het pylorische gebied van de maag achter de pylorische sluitspier.</li>
	<li>Steek de darminfuusbuis (zie materiaaltabel) door dat gat in de maag tot ongeveer 1-2 mm voorbij de pylorische sluitspier in de twaalfvingerige darm.</li>
	<li>Bevestig met een ligatuur van de portemonnee met zijde 5-0 hechtdraad (zie materiaaltabel) met een naald naar de maag en sluit af met een druppel cyanoacrylaatlijm om lekkage te voorkomen.</li>
	<li>Start de intraduodenale infusie van 5% glucose-0,9% zoutoplossing bij 0,3 ml / h. OPMERKING: Bij gebruik van muizen met kleine variaties in lichaamsgewicht die ongeveer 25 g (~ 8 weken oud) zijn, is de 0,3 ml / h infusie van glucose / zoutoplossing geschikt. Als muizen dramatisch groter zijn, moet de infusiesnelheid naar boven worden bijgesteld om rekening te houden met de verandering in lichaamsgewicht en bloedvolume.</li>
	<li>Vervang de organen in de lichaamsholte en hechting (5-0) de spier- en huidweefsels afzonderlijk. OPMERKING: De lymfecanule en de intraduodenale voedingssonde worden beide via dezelfde incisie naar buiten gebracht. Er is geen voorrang voor het scheiden van de buizen met een hechtdraad en geen voorkeur voor de hoek van de buitenkant van de buizen.</li>
	<li>Na de operatie, maar vóór het staken van de verdoving, plaatst u de muizen voorzichtig in Snuggle-beperkingen (zie tabel met materialen) om de beweeglijkheid te beperken. OPMERKING: De knuffelbeperkingen voorkomen dat de muizen het hoofd vastpakken of draaien om op de steken en slangen te kauwen.</li>
	<li>Plaats de muizen vervolgens in een heldere plexiglas doos op een rotator met zacht schommelen en warm met behulp van een temperatuurgeregelde commercieel verkrijgbare amfibie / reptielverwarmingspad dat aan de zijkant van de containmentdoos is bevestigd. Zorg voor bevochtiging ook in de vorm van steriele gedeïoniseerde watercontainers op de hoeken van de containmentbox (zie tabel met materialen).</li>
	<li>Op 30 minuten voordat de isofluraan wordt teruggetrokken, dient u de muizen hun tweede pijnstillende dosis toe (Buprenex, 0,1 mg / kg, i.p.).</li>
	<li>Afhankelijk van het experiment, geef de muizen een continue intraduodenale infusie van 5% glucose-0,9% zoutoplossing met een snelheid van 0,3 ml / h gedurende 1 uur. OPMERKING: De 5% glucose-0,9% zoutoplossing wordt bereid met behulp van een steriele zoutoplossing (voor menselijk gebruik, pH 7,4) van de apotheek en een steriele fles voor menselijk gebruik van 50% dextrose, volgens strikte richtlijnen voor steriliteit. De oplossing moet vers worden gemaakt en worden weggegooid als de vervaldatums op de zoutzakzak of de dextrosefles zijn overschreden.</li>
	<li>Dien de muizen toe met een van de lipiden vermeld in tabel 1 als een experimentele lipide via een intraduodenale canule (zie tabel met materialen). OPMERKING: Voor alle gegevens in figuur 1 was SMOFlipid (20% lipide-injecteerbare emulsie, USP, zie materiaaltabel) intraduodenaal geïnfundeerd. Deze infusie zowel pre- als post-intraduodenale lipide bolus vervangt verloren vocht dat door het lymfekanaal afvoert en is een absolute vereiste. De muizen zijn nu klaar om te worden geïnfundeerd met een experimentele lipidedosis.</li>
	<li>Voer de klassieke lipide-infusie uit van een lipide-emulsiebolus van 0,3 ml (SMOFlipid 20% lipide-injecteerbare emulsie, USP) via de intra-duodenale infusiebuis (zie materiaaltabel).</li>
	<li>Na de bolusinfusie van intraduodenale lipiden, schakel de infusie terug naar 5% glucose-0,9% zoutoplossing bij 0,3 ml / h continu tot het einde van het experiment.</li>
	<li>Verzamel de lymfemonsters in vooraf gewogen microcentrifugebuizen gedurende 60 minuten en houd de lymfe op ijs. Weeg de buizen een tweede keer om het gewicht van de lymfe te bepalen die elke periode van 60 minuten wordt uitgescheiden. OPMERKING: Verwacht ongeveer 50-300 μL lymfe per uur te verzamelen, per muis in de ~ 6 uur na een lipidebolus van 0,3 ml.</li>
	<li>Lymfe kan tot 6 uur na de lipideninfusie stromen. Op het tijdstip van 6 uur euthanaseert u de muizen via isofluraan en cervicale dislocatie. OPMERKING: Een chirurg en/of laborant moet aanwezig zijn om de dieren gedurende het hele experiment te controleren. Let tijdens de observatie op stolsels in de lymfedrainage en veranderingen in het gedrag van dieren die wijzen op pijn / angst. Als de lymfegang op enig moment tijdens het experiment verstopt is, wordt het experiment beëindigd en wordt het dier geëuthanaseerd. Het dier kan technisch gezien tot 24 uur na de operatie in leven worden gehouden (volgens de regels van de IACUC-overlevingschirurgie). De overlevingskansen nemen echter in de loop van de tijd af en 6 uur is een reproduceerbare overlevingsperiode waarin lipideabsorptie nog steeds de in vivo fysiologie nabootst en het dier niet worstelt met overleving.</li>
	<li>Voer terminale weefselverzameling uit na euthanasie (stap 3.1). OPMERKING: Het verschil in lipidenabsorptieprofielen in de voeding bij muizen die 6 uur of 24 uur na de operatie werden gehouden, werd onlangs getest44. We ontdekten dat de 24-uursprocedure de overlevingskansen van dieren en de excursie van voedingslipiden naar de lymfe vermindert. Om deze redenen raden we de 6-uursbenadering ten zeerste aan. Dit bijgewerkte chirurgische ontwerp vermindert onnodige dierensterfte en het potentieel voor dierenleed in de postoperatieve periode. Dit ondersteunt een belangrijk doel van de American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care, namelijk dierlijke "vervanging, reductie, verfijning" [ref PMID: 21595115].</li>
</ol>3. Verzameling van luminale inhoud en slijmvliesweefsel
<ol><li>Aan het einde van de lipide-infusieperiode van 6 uur offert u de muizen op via isofluraan en cervicale dislocatie. Bind beide uiteinden van de maag, dunne darm en blindedarm met 5-0 hechtingen om lekkage van de luminale inhoud te voorkomen.</li>
	<li>Verzamel de maag, blindedarm en dikke darm en plaats elk in een glazen buis van 15 ml. Verdeel de dunne darm in drie of vier segmenten en verzamel de luminale inhoud door het weefsel in 2-3 ml koude PBS te spoelen na het in de lengterichting opensnijden.</li>
	<li>Verwijder het darmslijmvlies bestaande uit epitheelcellen en bijbehorende lamina propria uit de spierlaag door elke sectie in 2-3 ml koude PBS te schrapen met een gebogen pincet.</li>
	<li>Plaats alle weefsels, de luminale en mucosale isolaten en de spierlaag in glazen buizen en voeg 8 ml 2: 1 vol CHCl3: MeOH toe aan elke buis.</li>
	<li>Bepaal de radioactiviteits- en/of lipideconcentraties door middel van vloeistofscintillatietelling en/of een triglyceridentestkit (zie materiaaltabel) na Folch-extractie45.</li>
</ol>4. Dunne-laagchromatografie (TLC)
<ol><li>Extraheer de totale lipiden van de luminale en mucosale isolaten via een gemodificeerde Folch-extractie45.</li>
	<li>Droog de geëxtraheerde lipiden in het oplosmiddel onder een stikstofverdamper en resuspensie ze vervolgens in 2:1 vol/vol CHCl3:MeOH voordat ze op een TLC-silicagelplaat worden geladen (zie materiaaltabel).</li>
	<li>Scheid de lipiden met behulp van een oplosmiddelsysteem van petroleumether, ethylether en ijsazijn (25:5:1 vol/vol/vol). Gebruik jodiumdamp voor de visualisatie van verschillende lipiden, inclusief normen.</li>
	<li>Schraap de vlekken op de TLC-plaat die overeenkomen met monoglyceriden / fosfolipide, diglyceriden, vetzuren, triglyceriden en cholesterolester in afzonderlijke scintillatieflacons voordat 4 ml van de scintillatievloeistof wordt toegevoegd (zie tabel met materialen) voor het tellen van scintillatie.</li>
	<li>Druk de gegevens uit als een percentage van de totale dosis boluslipiden of als een fractie van het totale lipide dat voor elk monster is gedetecteerd.</li>
</ol>5. Chylomicron isolatie en karakterisering
<ol><li>Breng de gecombineerde lymfemonsters over van de 6 h post-lipide bolus (stap 2.29) naar ultracentrifugebuizen, gemengd met 0,9% NaCl (300-500 μL), en leg vervolgens zorgvuldig over met een geschikt volume van 0,87% NaCl (300-500 μL).<ol><li>Ultracentrifuge (zie materiaaltabel) de monsters bij 110.000 x g bij 4 °C gedurende 16 uur. Verzamel de bovenste fractie met geïsoleerde chylomicronen en breng ze over naar een nieuwe microcentrifugebuis.</li>
	</ol></li>
	<li>Bepaal chylomicron triglyceride, cholesterol en apoB concentraties volgens de onderstaande stappen.<ol><li>Bepaal triglyceride- en cholesterolconcentraties met behulp van een triglyceriden- en cholesteroltestkit (zie tabel met materialen).</li>
		<li>Incubeer kort 2 μL van de monsters met 200 μL enzymreagens bij 37 °C gedurende 5 minuten in een plaat met 96 putjes. Lees de plaat af met een plaatlezer bij 500 nm voor triglyceride en 600 nm voor cholesterol. OPMERKING: Voor de berekening van concentraties werden normen en blanco's gebruikt. ApoB-concentraties werden bepaald met behulp van Mouse ApoB ELISA Kit (zie materiaaltabel).</li>
	</ol></li>
	<li>Bepaal de deeltjesgrootte van chylomicron.<ol><li>Gebruik verse chylomicronmonsters bij triglycerideconcentraties van ongeveer 40 mg / dL voor TEM-beeldvorming. Plaats kort 5-10 μL van elk monster op een TEM-rooster en droog.</li>
		<li>Onderzoek het raster met een transmissie-elektronenmicroscoop en leg beelden vast. Meet de deeltjesgroottes van de lipoproteïne en analyseer ze met behulp van ImageJ-software (zie Materiaaltabel).</li>
	</ol></li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De oorspronkelijke 2-daagse lymfefistelprocedure werd beschreven door Bollman et al.25 en de laatste 45 jaar beoefend door het laboratorium van Patrick Tso26,27. Het hier gepresenteerde protocol is een krachtige aanvulling op deze klassieke, gouden standaardmethode voor het identificeren, kwantificeren en begrijpen van de unieke chylous secreties van de dunne darm, evenals de in vivo dynamiek van de opname en het metabolisme van voedingsstoffen in de voeding, darmhormonen en darmimmuniteit.
De voordelen van dit model omvatten (1) het vermogen om continu mesenteriale lymfe te bemonsteren gedurende de voedings- en postprandiale periode in plaats van statische bemonstering op één tijdstip tijdens absorptie, spijsvertering of secretie; (2) de meting van darmhormonen en cytokines rechtstreeks in hun fysiologische compartiment in plaats van in het bloed, waar zij worden verdund en enzymatisch worden afgebroken 17,44; (3) het vermogen om de lipoproteïnen die door de dunne darm worden uitgescheiden na inname van een lipidemeel en de afwezigheid van endotheellipasen in de mesenteriale lymfe te isoleren, te kwantificeren en te karakteriseren, waardoor chylomicrontriglyceridenconcentraties en de inheemse chylomicronstructuur behouden46,47; (4) het vermogen om de lymfestroomsnelheid, de output van triglyceriden en cholesterol (of andere duodenale geïnfundeerde verbindingen), chylomicronsamenstelling en darmhormoonconcentraties direct te meten. Ten slotte maakt dit protocol het mogelijk om relatief grote hoeveelheden >50 μL lymfe per uur te verzamelen gedurende een periode van 6 uur. Naarmate de vloeistof wordt aangevuld met intra-duodenale zoutoplossing en glucose-infusie, is het lymfefistelmodel aanzienlijk verbeterd ten opzichte van andere lymfebemonsteringstechnieken en resulteert dit in stromende in plaats van statische pools van mesenteriale lymfe. Aangezien volume een belangrijke hindernis is voor lipidomische, proteomische en metabolomische benaderingen, is dit een belangrijke kracht.
Het hier beschreven 1-daagse lymfefistelprotocol van de muis heeft verschillende voordelen ten opzichte van het oorspronkelijke lymfefistelprotocol, waaronder een vermindering van het totale aantal proefdieren van eerder beschreven 2-daagse lymfefistelprotocollen26,27 vanwege een hogere overlevingskans na de operatie; een verkorting van de totale experimentele tijd van 2 dagen tot één dag; en, ten slotte, een vermindering van de herstelperiode voor muizen van 's nachts (>18 uur), waar doorbraakpijn of slechte postoperatieve resultaten kunnen optreden, tot een meer beheersbare ~ 6 uur na de operatie.
Een kenmerk van dit 1-daagse protocol is de focus op humane overwegingen en eindpunten. Deze moeten de hoogste prioriteit hebben: (1) dieren moeten intraduodenale of IV-vervangingsvloeistoffen krijgen; (2) ze moeten warm en zo pijnvrij mogelijk worden gehouden (met postoperatieve Buprenex en/of carprofen, afhankelijk van de experimentele opzet en de noodzaak om ontstekingsremmende effecten te vermijden); (3) Bloeden, trillen, diarree of tekenen van nood zijn allemaal dwingende redenen voor een humaan eindpunt. Volgens strikte IACUC-richtlijnen is isofluraan gevolgd door cervicale dislocatie een goed eindpunt. Chirurgische overlevingspercentages zijn ~ 70% voor een enkele dag (vergeleken met ~ 40% voor de oorspronkelijke 2-daagse operatie), maar onderzoekers moeten niet aarzelen om het experiment te beëindigen bij een teken van nood. Hiermee moet rekening worden gehouden bij het plannen van het aantal dieren.
In termen van het oplossen van deze techniek is een succesvolle plaatsing van de lymfecanule het belangrijkste knelpunt in deze chirurgische procedure. Tijdens het oefenen van de operatie helpt het om de muis ongeveer 2 uur voorafgaand aan de operatie te voorzien van 0,3 ml olijfolie. Dit zal de afscheiding van chylomicronen in het mesenteriale lymfekanaal veroorzaken, waardoor het "melkachtig" en zichtbaarder lijkt. Methyleenblauw kan ook worden gebruikt, maar is vaak minder duidelijk dan het melkachtige lymfekanaal. Als na de plaatsing van de lymfecanule en de plaatsing ervan met lijm de mesenteriale lymfe met succes door de canule in een verzamelvat stroomt, kan men doorgaan met de plaatsing van een darminfuusbuis. Af en toe kan de lymfe niet continu stromen, maar kan het weer gaan stromen wanneer het dier op de draaitafel wordt geplaatst. Let kritisch op stolsels in de lymfebuis. Deze moeten uit de buizen worden gemasseerd om tegenstroomdruk op het lymfekanaal te voorkomen.
Naast triglyceridensecretie en lymfestroomsnelheid kan deze techniek worden gebruikt om de volgende lipideabsorptiekinetiek en chylomicronkenmerken te bepalen:
Chylomicron secretie45,48,49 Onmiddellijk na een maaltijd die vet bevat, is er een voorbijgaande stijging van circulerend plasmatriglyceride. Omdat triglyceriden inherent hydrofoob zijn, moeten ze eerst worden geëmulgeerd om oplosbaar te zijn in bloed50. Dunne darm enterocyten voeren deze rol uit en verpakken triglyceriden in de voeding in chylomicron-emulsiedeeltjes51. Chylomicronen bevatten cholesterol en triglyceriden in hun kern, omgeven door fosfolipiden en apolipoproteïnen, waaronder apoB-48, apoA-I, apoA-IV en apoC-III52,53,54,55. ApoB-48 is het essentiële structurele eiwit en de andere apolipoproteïnen hebben verschillende functies die nodig zijn voor chylomicronmetabolisme en klaring uit het bloed. Om de belangrijkste kenmerken van chylomicronen te bepalen, inclusief hun triglyceriden- en apolipoproteïnegehalte, moet de hier getoonde 1-daagse lymfefisteltechniek worden gebruikt. De chylomicronsecretiesnelheid is het percentage geïnfundeerd 3H-triglyceride dat wordt uitgescheiden in de lymfe en gemeten door scintillatie door het tellen van lymfemonsters per uur. Dit kan worden gecombineerd met gedetailleerde chylomicronkarakterisering 48,49,56,57,58. Uurlijkse lymfemonsters kunnen worden gecombineerd of afzonderlijk worden bewaard. Lymfe wordt overgebracht naar ultracentrifugebuizen, gemengd met 0,9% NaCl en vervolgens zorgvuldig bedekt met 300-500 μL van 0,87% NaCl. De monsters worden vervolgens ultracentrifugeren bij 110.000 x g bij 4 °C gedurende 16 uur. De bovenste fracties die geïsoleerde chylomicronen bevatten, worden verzameld en getest op triglycerideconcentraties met behulp van de triglyceridentestkit. In het kort wordt 2 μL van het chylomicron (1:10 verdunning) geïncubeerd met 200 μL enzymreagens bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten in een plaat met 96 putten. De plaat wordt gelezen door een plaatlezer bij 500 nm en de normen en spaties worden gebruikt voor de berekening van triglycerideconcentraties. De grootte van chylomicron kan vervolgens worden bepaald door negatieve kleuring en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)14,29. Triglyceriden en cholesterol kunnen worden gekwantificeerd door chemische assay en apolipoproteïnegehalte (apoB-48, A-I, C-II, C-III) door ELISA-kits of Western blot.
Bepaling van de primaire plaats van lipideabsorptie 48,59 Door de luminale en epitheelcelcompartimenten van de twaalfvingerige darm, jejunum en ileum te isoleren 6 h na de infusie van 3 H-triglyceride of een radioactief gelabelde gemengde maaltijd, wordt de inhoud folch geëxtraheerd om te bepalen hoeveel van de 3H-triglyceride wordt geabsorbeerd over het epitheelcelmembraan (normaal) of wordt vastgehouden in het lumen (abnormaal) langs de lengte van de dunne darm48 . Deze studies hebben vooral impact als er potentiële verschillen zijn in GI-motiliteit 60,61,62, als er een hypothese is met betrekking tot galzuren (zeer actief gedurende lipideabsorptie en zelf opnieuw geabsorbeerd in het ileum)63,64,65,66, of als er een bezorgdheid is dat voedingsstoffen worden geabsorbeerd op de verkeerde anatomische locatie (ileum of zelfs dikke darm)67 ,68,69,70.
Identificatie van mechanismen van 3H-triglyceriden die in absorberende epitheelcellen terechtkomen48 Dit wordt uitgevoerd door het percentage 3 H-triglyceriden te berekenen dat is gehydrolyseerd tot 3 H-vrij vetzuur in het darmlumen, geabsorbeerd in het slijmvlies en opnieuw veresterd tot intracellulair 3H-triglyceride voorafgaand aan secretie als chylomicronen. Dit is een krachtige marker van absorptie- / secretiedefecten, omdat het kan worden getraceerd om de beweging van triglyceriden in de voedingstriglyceriden in zijn afbraakproducten en daaropvolgende verpakking in chylomicronen te laten zien. mRNA-expressie van de vetzuurabsorptiemachinerie (CD36, FABPs, ACSLs), re-esterificatieroute (MGAT, DGAT, MTTP, apoB) en apolipoproteïnen (apoC-III, B-48, C-II, A-I, A-IV) kunnen verder worden gekwantificeerd door RT-PCR.
Toekomstige toepassingen van deze techniek worden alleen beperkt door interesse in darm-orgaanoverspraak, metabolisme, immuniteit, opname van voedingsstoffen, milieuverontreinigingen in de voeding of een andere ziekte met een rol in het GI-systeem. Het is waarschijnlijk dat veel overtuigende experimenten en hypothesen zijn vastgelopen vanwege de moeilijkheid om toegang te krijgen tot het kritieke mesenteriale lymfesysteem, en het doel van dit gevisualiseerde protocol is om deze techniek gemakkelijker beschikbaar te maken. Het isoleren van chylomicronen en de mesenteriale lymfe waarin ze zich aanvankelijk bevinden, is een cruciaal onderdeel van het begrijpen van het metabolisme van het hele lichaam; Het 1 Day Mouse Lymph Fistula Model is een krachtig fysiologisch model voor het bestuderen van deze gebeurtenissen.

Het fysiologische belang van het mesenteriale lymfestelsel De mesenteriale lymfevaten zijn in een of andere vorm beschreven sinds ~ 300 voor Christus toen Herophilos het hepatische poortsysteem en alle "absorberende aderen in de darmen" beschreef1,2,3,4,5. Gedurende meer dan 1.700 jaar na deze eerste beschrijving was een bepalend kenmerk van darmlymfevaten de aanwezigheid van melkachtig vocht in de mesenteriale lymfe kort na een maaltijd3. Het is nu bekend dat melkachtige, chylomicron-bevattende lymfe ("chylous" lymfe) niet in de poortader en lever terechtkomt, maar in plaats daarvan door de cisterna chyli naar de thoracale ductus reist en uiteindelijk het bloed bij de linker subclaviaader6 verbindt. Door deze anatomische opstelling reist chylous lymfe eerst door het hart en de longen voordat het door de rest van het lichaam circuleert. Dit betekent dat het hart en de longen een "first-pass" krijgen bij de afscheidingen in de mesenteriale lymfe7.
Een belangrijke rol van mesenteriale lymfevaten is hun transport van voedingslipiden uit de dunne darm 8,9,10. Anatomisch, chylomicronen, intestinale immuuncellen 11,12,13,14, darmhormonen 15,16,17,18, antigenen 19,20,21, niet-chylomicron lipofiele verbindingen22,23 , en overtollig vocht komt de lactealen binnen die ten grondslag liggen aan het enterocytenkeldermembraan en worden vervolgens geconcentreerd door de lymfecapillairen naar de mesenteriale lymfeklieren. Er zijn waarschijnlijk veel onbekende mesenteriale lymfatische componenten, waaronder metabolieten, antigenen, milieuverontreinigende stoffen, voedingsstoffen en signaalmoleculen.
De componenten van mesenteriale lymfe zijn niet systematisch geïdentificeerd, grotendeels vanwege de moeilijkheid om mesenteriale lymfe te isoleren. Toegang tot de mesenteriale lymfe is altijd een serieuze uitdaging geweest omdat lymfekanalen kleurloos zijn, en behalve na een vette maaltijd wanneer ze chylous en melkachtig worden, bevatten de mesenteriale lymfevaten kleurloze lymfevocht 6,8,9,10.
Huidige en gebruikelijke methoden voor het isoleren van darmlymfe Mesenteriale lymfe is niet toegankelijk bij mensen (behalve in zeldzame en extreme omstandigheden waarin ernstig GI-trauma is opgetreden)24. In vivo lymfeverzameling is chirurgisch complex en veeleisend. De oorspronkelijke 2-daagse lymfefistelprocedure werd beschreven door Bollman et al.25 en is de afgelopen 45 jaar verbeterd en geprofessionaliseerd door het laboratorium van Patrick Tso26,27. De lymfefistelprocedure stelt onderzoekers in staat om vloeiende lymfe van bewuste dieren te verzamelen tijdens een 6 uur durende duodenale lipide-infusieperiode.
Het lymfefistelmodel is voornamelijk gebruikt bij ratten om de lymfestroomsnelheid, de output van triglyceriden en cholesterol (of andere duodenale geïnfundeerde verbindingen), chylomicronsamenstelling en intestinale hormoonconcentraties te meten. In mindere mate kan deze techniek ook bij muizen worden gebruikt, hoewel de chirurgische overleving en het lymfevolume eronder lijden. Vanwege de moeilijkheden bij het zien van mesenteriale lymfekanalen, hebben historische methoden het cannuleren van mesenteriale lymfe bij grotere dieren zoals minivarkens28, schapen29, varkens30, honden31 en ratten17 opgenomen. Het werken met deze grotere modellen is arbeidsintensief en laat geen studies in knock-in of knock-out modellen toe.
Er zijn ook alternatieve benaderingen gebruikt. Chylomicronen kunnen worden geïsoleerd uit bloed in de postprandiale toestand (hoewel deze gedeeltelijk worden gehydrolyseerd door plasmalipoproteïnelipase)32,33,34,35. De thoracale ductus kan ook worden gecannuleerd, hoewel de daar verzamelde lymfe een mengsel van mesenteriale lymfe en extra-intestinale lymfedrainage26,36 bevat. In vitro scheiden Caco-2-cellen een chylomicronachtig deeltje af als reactie op vetzuurbehandeling, en deze cellen kunnen samen worden gekweekt met relevante lymfatische endotheel- of vasculaire cellen37,38. Van intestinale organoïde culturen van mens en muis is aangetoond dat ze apicale lipiden verwerken en chylomicronen afscheiden 39,40,41,42. Deze modellen zijn zeer voordelig en maken mechanistische inzichten in de dunne darmfysiologie mogelijk, maar ze kunnen de complexiteit, fysisch-chemische gradiënten of dynamische lymfestroom van in situ mesenteriale lymfevaten niet repliceren.
Voordelen van het 1 dag muis lymfe fistel model hier gepresenteerd Met betrekking tot deze andere methoden voor het isoleren van intestinale lipoproteïnen, wordt de Tso Lab-lymfefisteltechniek traditioneel beschouwd als de gouden standaardtechniek voor het meten van de absorptie van voedingsnutriënten in mesenteriale lymfe. Deze in vivo techniek heeft het voordeel dat het de belangrijkste fysiologische aspecten van lipideabsorptie in de voeding vastlegt - het dynamische uiterlijk van verbindingen gedurende de absorptieperiode, waarvoor de herhaalde bemonstering van stromende mesenteriale lymfe in levende dieren met duodenale voedingsstoffen vereist is. Deze chirurgische techniek meet ook darmhormonen en cytokines direct in hun fysiologische compartiment in plaats van in het bloed, waar ze worden verdund en enzymatisch worden afgebroken 17,43.
Als de experimentele vraag een goed begrip vereist van lipidesecretiedynamiek of de dynamische absorptie en het metabolisme van een hydrofobe GI-verbinding of medicijn, dan is deze techniek niet alleen geschikt, maar is het ook de enige benadering die de beweging van luminale inhoud van de proximale naar de distale darm (maag naar colon) en van de apicale naar het basolaterale oppervlak interpoleert (luminale inhoud via enterocyt naar lactealen en portale circulatie). Omdat deze techniek gebruik maakt van de luminale afgifte van voedingsstoffen via de intraduodenale katheter, en omdat de stromende mesenteriale lymfe wordt omgeleid en verzameld, staat het hele absorptieapparaat onder experimentele controle en kan het worden gebruikt om de absorptieprofielen van de dunne darm kwalitatief te beoordelen.
Hier wordt voor het eerst visueel een belangrijke update van het Tso Lab-lymfefistelmodel gepresenteerd, die (1) de experimentele tijd reduceert tot een chirurgische implantatie- en experimentele verzamelperiode van 1 dag; (2) de overleving van muizen en overwegingen inzake dierenwelzijn verbetert; en (3) verhoogt de reproduceerbaarheid van de aanpak bij muizen om de kracht van genetische muismodellen te benutten. Deze techniek moet worden beschouwd als een gouden standaard voor alle experimentele vragen over intestinale secreties, lipoproteïnen of lipideabsorptie in de voeding en is de beste techniek voor de high-fidelity bepaling van lipideabsorptiekinetiek en chylomicronen.

<table><tbody><tr><td>0.9% Sodium Chloride Injection, USP&nbsp; steriele</td><td>Hospira, Lake Forest, IL, VS</td><td>NDC 0409-4888-06</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL Eppendorf tubes</td><td>Fisher Scientific, Waltham, MA, VS</td><td>7200184</td><td></td></tr><tr><td>14C-cholesterol: Cholesterol-[4-14C] (0.1mCi/ mL)</td><td>American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO, VS</td><td>ARC 0857</td><td></td></tr><tr><td>18 G naald</td><td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, VS</td><td>305199</td><td></td></tr><tr><td>2 Dumont micro-dissectietangen</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA, VS</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>2 Tangen</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, VS</td><td>RS-5130</td><td></td></tr><tr><td>3H-TAG:&nbsp; Triolein [9,10-3H(N)] (3H-TG) (1mCi/ mL)</td><td>American Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO, VS</td><td>ART0199</td><td></td></tr><tr><td>3H-TG Triolein [9,10-3H(N)] (3H-TG)</td><td>American Radiolabeled Chemicals, INC. St. Louis</td><td>MO 63146</td><td></td></tr><tr><td>50% Dextrode Injectie, USP 25gram/50 mL&nbsp; steriele</td><td>Hospira, Lake Forest, IL, VS</td><td>NDC-0409-6648-16</td><td></td></tr><tr><td>Analtech TLC Uniplates: silica gel matrix Z265500-1PAK</td><td>Fisher Scientific, Waltham, MA, VS</td><td>11-101-0007</td><td></td></tr><tr><td>BD CareFusion ChloraPrep Swabstick</td><td>Fisher Scientific, Waltham, MA, VS</td><td>14-910-501</td><td></td></tr><tr><td>Betadine chirurgische scrub</td><td>Dynarex Corp., Orangeburg, NY, VS</td><td>1201</td><td></td></tr><tr><td>Bevel-cut cannula</td><td>Braintree Scientific.,&nbsp; Braintree, MA, VS</td><td>MRE025</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine HCl Injectie Carpuject PFS 0.3mg/mL 10/Bx (Buprenex)</td><td>HenrySchein, Warrendale, PA, VS</td><td>1278184</td><td></td></tr><tr><td>C57BL6/J mannelijke muizen</td><td>Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChloraPrep</td><td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, VS</td><td>260100</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol Assay Kit</td><td>FujiFilm Healthcare, Lexington, MA, VS</td><td>99902601</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol-[4-14C]</td><td>American Radiolabeled Chemicals, INC. St. Louis</td><td>MO 63146</td><td></td></tr><tr><td>Heldere plexiglas box L43cm X B26 X H 21 met temperatuur-gecontroleerde verwarmingspad en bevochtiging</td><td></td><td></td><td>ontwerp en aanpassingen van ons eigen</td></tr><tr><td>commercieel verkrijgbare&nbsp; amfibieën/reptiel verwarmingspad</td><td>ShenZhen XingHongChang Electric CO., LTD. ShenZhen, China</td><td>XHC-F035D</td><td></td></tr><tr><td>Wattenstaafjes</td><td>Fisher Scientific, Waltham, MA, VS</td><td>22363156</td><td></td></tr><tr><td>Duodenale infuusbuis - canuala</td><td>Braintree Scientific, Braintree, MA, VS</td><td>MRE037</td><td></td></tr><tr><td>Ensure</td><td>Abbott Nutrition, Columbus, OH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Verwarmingspad chirurgische platform met gecirculeerde warme waterpomp combinatie</td><td>Patterson Scientific, Waukesha, WI, VS</td><td>Gaymar T/Pump Classic</td><td></td></tr><tr><td>Heparine Natrium Injectie, USP 1.000 eenheden/mL steriele</td><td>Mylan, Morgantown, WV, VS</td><td>NDC-67457-384-31</td><td></td></tr><tr><td>Image J Software</td><td>National Institute of Health, Bethesda, Maryland,</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iris schaar</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, VS</td><td>RS-5602</td><td></td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>Piramal Pharma Solutions, Riverview, MI, VS</td><td>NDC 66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>Isofluraan inductieapparaat en Anesthesie Apparaat</td><td>Patterson Scientific, Waukesha, WI, VS</td><td>muis inductiekamer</td><td></td></tr><tr><td>Krazy lijm</td><td>Elmer's products Inc., Columbus, OH, VS</td><td>KG484</td><td></td></tr><tr><td>Liposyn III 20% lipid injectabel</td><td>Hospira Inc. Lake Forest, Illinois, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS 6500 Multi-Purpose Scintillatie Teller</td><td>Beckman Coulter, Brea, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-dissectieveer schaar</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, VS</td><td>RS-5602</td><td></td></tr><tr><td>Mouse apoB ELISA Kit</td><td>ABCAM Inc., Waltham, MA, VS</td><td>ab230932-1</td><td></td></tr><tr><td>Naaldhouder</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA, VS</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>Retractoren</td><td>Kent Scientific Co., Torrington, CT, VS</td><td>SURGI-5001</td><td></td></tr><tr><td>Rimadyl (Carprofen)</td><td>Zoetis Inc., Kalamazoo MI, VS</td><td>4019449</td><td></td></tr><tr><td>Roterende tafel Barnstead Thermolyne</td><td>Labquake, Zürich, Zwitserland</td><td>Barnstead Thermolyne</td><td></td></tr><tr><td>SMOFlipid 20% lipid injectabele emulsie, USP</td><td>Fresenius Kabi, Warrendale, PA, VS</td><td>NDC-63323-820-01</td><td></td></tr><tr><td>Snuggle</td><td>Lomir Biomedical Inc., Notre-Dame-de-l'&Icirc;le-Perrot, QC J7V 7M4, Canada</td><td>MS 02.5PM</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische schaar</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, VS</td><td>RS-5912SC</td><td></td></tr><tr><td>Hechtdraad (5-0 zijde met naald)</td><td>DemeTECH, Miami Lakes, FL, VS</td><td>DT-719</td><td></td></tr><tr><td>Transmissie Elektronenmicroscoop (JEOL 1400-FLASH 120KV )</td><td>JEOL, Peabody, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triglyceride Assay Kit</td><td>Randox Laboratories, Crumlin, Verenigd Koninkrijk</td><td>TR210</td><td></td></tr><tr><td>ULTIMA GOLD XR Scintillatievloeistof</td><td>Perkin Elmer, Hebron, KY, VS</td><td>6013119</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge, rotor S100AT4-497</td><td>SORVALL RC M120 GX</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

de isolatie van stromende mesenteriale lymfe bij muizen om in vivo kinetiek van lipideabsorptie in de voeding en chylomicronsecretie te kwantificeren

The Isolation of Flowing Mesenteric Lymph in Mice to Quantify In Vivo Kinetics of Dietary Lipid Absorption and Chylomicron Secretion

Intestinale lipoproteïnen, vooral triglyceride-rijke chylomicronen, zijn een belangrijke aanjager van metabolisme, ontsteking en hart- en vaatziekten. Het isoleren van intestinale lipoproteïnen is echter erg moeilijk in vivo omdat ze eerst vanuit de dunne darm worden uitgescheiden in de mesenteriale lymfevaten. Chylomicron-bevattende lymfe leegt vervolgens in de subclavia-ader van het thoracale kanaal om componenten van de maaltijd af te leveren aan het hart, de longen en uiteindelijk de bloedsomloop van het hele lichaam. Het isoleren van naïeve chylomicronen is onmogelijk uit het bloed, omdat chylomicron triglyceride onmiddellijk hydrolyse ondergaat na interactie met lipoproteïnelipase en andere lipoproteïnereceptoren in omloop. Daarom is de oorspronkelijke 2-daagse lymfefistelprocedure, beschreven door Bollman et al. bij ratten, historisch gebruikt om verse mesenteriale lymfe te isoleren voordat deze in de thoracale ader terechtkomt. Dat protocol is de afgelopen 45 jaar verbeterd en geprofessionaliseerd door het laboratorium van Patrick Tso, waardoor de analyse van deze kritische lipoproteïnen en afscheidingen uit de darm mogelijk is. De Tso lymfe fistel procedure is nu bijgewerkt en wordt hier voor het eerst visueel gepresenteerd. Deze herziene procedure is een eendaagse chirurgische techniek voor het installeren van een voedingssonde voor de twaalfvingerige darm, het cannuleren van het mesenteriale lymfekanaal en het verzamelen van lymfe na een maaltijd bij bewuste muizen. De belangrijkste voordelen van deze nieuwe technieken zijn het vermogen om reproduceerbaar lymfe van muizen te verzamelen (wat gebruik maakt van de kracht van genetische muismodellen); de verminderde anesthesietijd voor muizen tijdens de implantatie van de darminfuusbuis en de lymfecanule; het vermogen om continu lymfe te bemonsteren gedurende de voedings- en postprandiale periode; het vermogen om hormonen en cytokines kwantitatief te meten vóór hun verdunning en enzymatische hydrolyse in het bloed; en het vermogen om grote hoeveelheden lymfe te verzamelen voor het isoleren van intestinale lipoproteïnen. Deze techniek is een krachtig hulpmiddel voor het direct en kwantitatief meten van de opname van voedingsstoffen in de voeding, intestinale lipoproteïnesynthese en chylomicronsecretie.

Figuur 2 toont de triglyceridensecretie in mesenteriale lymfe en de gemiddelde lymfestroomsnelheden in de meest recente n = 17 wild-type (WT) muizen die de eendaagse lymfefistelprocedure ondergingen die hier wordt beschreven. Zoals te zien is in figuur 2A, neemt de triglyceridenconcentratie in lymfe toe als reactie op een intraduodenale bolus van 300 μl SMOFLipid. De piek triglyceridenconcentratie wordt bereikt op ~ 2-3 uur na de bolus en neemt gestaag af gedurende de 6 uur tijd (onmiddellijk vóór euthanasie). Parallel aan triglyceridensecretie neemt de lymfestroomsnelheid toe vanaf de bolusinfusie van tijd 0 tot het einde van het experiment (figuur 2B).
Deze resultaten tonen aan dat de chirurgische implantatie van zowel de mesenteriale lymfegang als de intraduodenale canule heeft plaatsgevonden en representatief zijn voor een positieve controle waaraan andere lymfegehalten (hormonen, peptiden, voedingsstoffen) kunnen worden gekoppeld. Als er geen verandering is in de triglyceridenconcentratie in lymfe als reactie op bolus intraduodenale lipiden, geeft dit aan dat de operatie aanzienlijke schade aan de dunne darm heeft veroorzaakt, zodat de absorptiecapaciteit van lipiden afwezig is, of, in eerder niet-fenogetypeerde genetische modellen, zou dit suggereren dat de muis een defect in lipideabsorptie heeft dat fysiologisch betekenisvol is.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64338/64338fig01.jpg"> Figuur 1: Voorgestelde tijdlijn voor het lymfefistelmuismodel. T-4, T-3, T-2: Dubbele cannulatie duurt ongeveer 2-4 uur, gevolgd door plaatsing van de muizen in herstelkamers. T-1: Zodra de muizen zich in de herstelperiode bevinden, krijgen ze een continue duodenale infusie van 5% glucose-0,9% zoutoplossing. T0: de continue intraduodenale infusie wordt overgeschakeld van 5% glucose-0,9% zoutoplossing naar een infusie van experimentele voedingsstoffen. T0-T6: Muizen ontvangen continu intraduodenale 5% glucose in zoutoplossing of, als alternatief, continue voedingsstoffen. Lymfe wordt in deze periode elk uur verzameld. Eindpunt: Muizen worden geëuthanaseerd en weefsels kunnen worden verzameld. De figuur is gemaakt met BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64338/64338fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64338/64338fig02.jpg"> Figuur 2: Mesenteriale lymfetriglyceridenconcentratie en stroomsnelheid. Wild-type muizen werden uitgerust met een intraduodenale voedingssonde en een mesenteriale lymfecanule. Muizen kregen een bolusinfusie van 300 μL lipide. Lymfe werd gedurende 6 uur per uur verzameld en op ijs gehouden. (A) Het gehalte aan lymfetriglyceriden werd bepaald door een chemische bepaling in elk uur aliquot lymfe. (B) In de 6 uur na bolusinfusie wordt de lymfestroom uitgezet als grammen lymfe die per uur worden uitgescheiden. Punten zijn middelen ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64338/64338fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Lipide leveringsmethoden</td>
			<td colspan="6">Aanbevelingen/instructies</td>
		</tr><tr><td>Gemengde lipide-emulsie bolus</td>
			<td colspan="6">Een dosis van 0,3 ml van (A ) Liposyn III 20% lipide-injecteerbare of (B) SMOFlipide 20% lipide-injecteerbare emulsie, USP, via intra-duodenale infusiebuis kan worden gebruikt. Deze geëmulgeerde lipiden zijn nuttig omdat ze niet van tevoren hoeven te worden bereid, vloeibaar zijn bij kamertemperatuur, steriel zijn en omdat ze een "licht verteerbare" mix van vrije vetzuren, triglyceriden, fosfolipiden en natriumtaurocholaat bevatten. Dit is een goede startinfusie voor muizen die pancreas- of galinsufficiënties kunnen hebben.</td>
		</tr><tr><td>Triglyceride bolus</td>
			<td colspan="6">0,3 ml zacht opgewarmde olijfolie (of gezuiverde triolein) als een neutraal lipide dat een dieet weerspiegelt dat rijk is aan onverzadigd vet, reuzel (een weerspiegeling van een dieet met een hoog gehalte aan verzadigd vet) of kokosolie (weerspiegeling van een dieet met een hoog triglyceridengehalte in de middellange keten) kan allemaal worden gegeven door intra-duodenale infusiebuis of orale maagsonde. Als de experimentele triglyceride verzadigd is, moet deze worden opgewarmd om vloeibaar te zijn bij kamertemperatuur.</td>
		</tr><tr><td>Bolus met gemengde maaltijd</td>
			<td colspan="6">0,3 ml Zorg ervoor dat de formulering die 0,075 g vet (21,6%), 0,5 g koolhydraten (64,0%) en 0,1125 g eiwit (14,4%) bevat en een vetarme gemengde maaltijd weerspiegelt, kan worden toegediend via intra-duodenale infusie.</td>
		</tr><tr><td>Radioactief gelabelde lipide bolus</td>
			<td colspan="6">5,0 μCi 3 H-gelabeld glyceroltrioleaat en/of 1,0 μCi 14C-cholesterol in 0,3ml olijfolie kan worden gegeven via intra-duodenale infusie. 14 C-cholesterol: Cholesterol-[4-14C] met specifieke activiteit van 55Ci/mmol en een concentratie van 0,1mCi/ml. 3 H-TG Trioleïne [9,10-3H(N)] (3H-TG) met specifieke activiteit van 60Ci/mmol en concentratie van 1mCi/ml</td>
		</tr><tr><td>Continue dosis</td>
			<td colspan="6">De infusie van een van de bovenstaande experimentele voedingsformuleringen met een snelheid van 0,3 ml / h (in plaats van 0,3 ml totale bolus), zal resulteren in een gestage output van triglyceriden in de lymfe. Dit verschilt van een bolusinfusie, waarbij de triglyceridenconcentratie in lymfe piekt op ~ 2-3 uur en vervolgens terugkeert naar de uitgangsconcentraties bij ~ 6-8 uur.</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Tabel met lipide-infusies.

Het huidige protocol beschrijft een gedetailleerd chirurgisch protocol voor het isoleren van stromende darmlymfe als reactie op intraduodenale voedingsinfusies bij muizen. Dit maakt de fysiologische bepaling van de totale intestinale lipideabsorptie en chylomicronsynthese en -secretie mogelijk als reactie op verschillende experimentele voedingsstoffen.

De isolatie van stromende mesenteriale lymfe bij muizen om in vivo kinetiek van lipideabsorptie in de voeding en chylomicronsecretie te kwantificeren

Intestinal lipoproteins, especially triglyceride-rich chylomicrons, are a major driver of metabolism, inflammation, and cardiovascular diseases. However, ...

Ons protocol stelt ons in staat om het postprandiale metabolisme in stromende mesenteriale lymfe direct te meten. Dit is krachtig omdat we de beweging van voedingsstoffen uit de dunne darm naar de lymfe kwantitatief kunnen bepalen. En we kunnen cytokines, voedingslipiden, andere voedingscomponenten en lymfocyten meten.Deze techniek kan ons helpen de dynamiek te ontleden van voedingslipiden die zich verplaatsen naar lymfe, de synthese en afscheiding van chylomicronen. Het hier gepresenteerde eendagsmodel heeft verschillende voordelen. Ten eerste vermindert het de experimentele tijd.Ten tweede vermindert het de stress bij dieren. Het verhoogt de overleving van dieren. En over het algemeen neemt het experimentele aantal af.Onze techniek wordt vandaag gedemonstreerd door onze Senior Lab Surgeon, Mr.Nick Dedousis. En onze onderzoekswetenschapper, Dr. Lihong Teng. Nadat u de muis hebt voorbereid op een operatie, grijpt u de huid vast met een pincet en maakt u een buikincisie in de middellijn met een kleine schaar.Snijd vervolgens naar het borstbeen en naar beneden naar het liesvet. Gebruik het oprolmechanisme om de peritoneale ingewanden uit de weg te bewegen totdat het lymfekanaal zichtbaar is. Gebruik een met zoutoplossing gedrenkte Q-tip en beweeg de lever naar de rechterbovenkant van het lichaam en de darmen en maag naar de linkerkant van het dier.Stel vervolgens de superieure mesenteriale slagader en het darmlymfekanaal bloot door de twaalfvingerige darm dwars naar links uit te rekken. Bereid een canuleslang van 30 tot 40 centimeter lengte voor door een stompe naald in te brengen. Spoel vervolgens met een spuit van één milliliter een kleine hoeveelheid heparine door de buis en knip een schuine kant aan de punt van de canuleslang met een schaar.Maak vervolgens een ondiepe incisie en lymfekanaal om een irisschaar te gebruiken zoals beschreven in het manuscript. Houd de canuleslang vast met een fijne tang en steek de punt voorzichtig in het kanaal. Omdat het lymfekanaal kwetsbaar is, gebruikt u een druppel cyanoacrylaat om de lymfecanule in de mesenteriale lymfe te lijmen in plaats van de katheter met een hechtdraad te binden.Prik nu met behulp van een naald van 18 gauge een gat door het pylorische gebied van de maag achteraan naar de pylorische sluitspier en steek de duodenale infuusbuis in de maag één tot twee millimeter voorbij de pylorische sluitspier in de twaalfvingerige darm. Bevestig vervolgens de buis aan de maag met een ligatuur met een zijden 5/0-hechtdraad en verzegeld met een druppel cyanoacrylaatlijm om lekkage te voorkomen. Start de intraduodenale infusie van 5% glucose en 0,9% zoutoplossing.Vervang de organen in de lichaamsholte en hecht de middellijnincisie. Plaats de muis voorzichtig in een stevig beveiligingssysteem. Voorzie de muizen van een continue intraduodenale infusie van zoutoplossing en glucose gedurende één uur.Controleer de canule op lymfestroom en begin met het melken van de lymfecanule om de lymfestroom te houden. Voer de klassieke lipide-infusie uit van een lipide-emulsiebolus van 0,3 milliliter via de intraduodenale infusiebuis. Schakel vervolgens de infusie terug naar 5% glucose en 0,9% zoutoplossing bij 0,3 milliliter per uur continu tot het einde van het experiment.Verzamel de lymfemonsters en weeg microcentrifugebuizen gedurende 60 minuten en houd de lymfe op ijs. Weeg de buisjes de tweede keer om het gewicht van de lymfe te bepalen die elke 60 minuten wordt uitgescheiden. Verzamel de maag, blindedarm en dikke darm en plaats elk orgaan in een glazen buis van 15 milliliter.Verdeel de dunne darm in drie of vier segmenten. Snijd het in de lengterichting open en verzamel de luminale inhoud door het weefsel te spoelen met twee tot drie milliliter koude PBS. Verwijder het darmslijmvlies bestaande uit epitheelcellen en bijbehorende lamina propria uit de spierlaag door elke sectie in twee tot drie milliliter koude PBS te schrapen met een gebogen pincet.Plaats alle weefsels, de luminale en mucosale isolaten en de spierlaag in glazen buizen. De triglyceridenconcentratie in lymfe nam toe als reactie op een intraduodenale bolus van 300 microliter SMOFlipid. Piek triglyceridenconcentratie wordt bereikt op twee tot drie uur na de bolus en neemt gestaag af gedurende de zes uur tijd.De lymfestroomsnelheid neemt toe vanaf tijd nul bolusinfusie tot het einde van het experiment. Een belangrijk doel van dit protocol was om stress bij dieren te verminderen, de overlevingskans te verhogen en de anesthesietijd te verkorten. Om dit te bereiken, hebben we Bollman-fixatiekooien verwisseld voor knuffels en hebben we vochtigheid, warmte en vochtaanvulling toegevoegd.Ons one day limp fistula protocol stelt ons in staat om in realtime, in vivo, de lipideabsorptiedynamiek te meten. Het stelt ons ook in staat om kruisverwijzing van darmorganen, metabolisme, opname van voedingsstoffen in de voeding en immuunfenotypen te bestuderen.

the-isolation-flowing-mesenteric-lymph-mice-to-quantify-vivo-kinetics

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De endotheliale glycocalyx / endotheliale oppervlaktelaag is ideaal bestudeerd met behulp van intravitale microscopie. Intravitale microscopie is technisch uitdagend in een bewegend orgaan zoals de longen. We zien hoe gelijktijdige helderveld en fluorescentiemicroscopie kan worden gebruikt om endotheeloppervlak laagdikte schatten in een vrij...

In vivo meting van de muis Pulmonary Endothelial oppervlaktelaag

Hier beschrijven we een techniek om de mesenteriale lymfevat te canuleren bij ratten, wat de kwantificering van lipiden- en geneesmiddeltransport via het lymfestelsel mogelijk maakt na intestinale toediening. De techniek kan worden aangepast om mesenteriale lymfeconcentraties en/of transport van vocht, immuuncellen, peptiden, eiwitten en lipofiele moleculen te beoordelen.

De Mesenteriale Lymfe Duct gecanuleerde Rat Model: Toepassing op de beoordeling van Intestinal Lymfatische Drug Transport

Caco-2 cellen kunnen dienen als een in vitro model om het enterocyt transport van lipiden, en in vet oplosbare geneesmiddelen/vitaminen te bestuderen. Het permeabele membraansysteem scheidt het apicale van het basolaterale compartiment, terwijl het lentivirusuitdrukkingssysteem een effectieve genoverexpressiemethode biedt. De isolatie van lipoproteïnen wordt bevestigd door TEM.

Met behulp van Caco-2 cellen te Lipid Transport studie van de Darm

We presenteren een chirurgische procedure om de intestinale lymfe-lymfeklier bij neonatale varkens te kateteriseren om grote hoeveelheden componenten van het lipidenmetabolisme uit efferente lymfe te verzamelen.

Long-Term catheterisatie van de intestinale Lymfe Stam en verzamelen van lymfe in Neonatale Pigs

Er is een groeiende interesse in de kwantitatieve karakterisering van intestinale lymfocyten vanwege de toenemende erkenning dat deze cellen een cruciale rol spelen bij een verscheidenheid aan intestinale en systemische ziekten. In dit protocol beschrijven we hoe je enkele celpopulaties kunt isoleren uit verschillende compartimenten van de dunne darm voor daaropvolgende flowcytometrische karakterisering.

Isolatie en Flowcytometrische karakterisatie van muizen dunne darm lymfocyten

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de isolatie van lymfocyten van de inductieve sites met inbegrip van de darm-geassocieerde lymfoïde weefsel Peyer van patches en de zuig mesenterische lymfklieren, en de effector met inbegrip van de lamina propria en de intestinale epitheel van het kleine intestinale immuunsysteem.

Isoleren van lymfocyten van het immuunsysteem intestinale kleine muis

Hier tonen we de methoden voor in vivo kwantificering van leukocyten egress van naïef, ontstoken, en kwaadaardige lymfkliertest huid. Wij voeren een head-to-head vergelijking van twee modellen: transdermaal FITC toepassing en in situ photoconversion. Bovendien tonen wij het nut van photoconversion voor het bijhouden van leukocyten egress van cutane tumoren.

Kwantificeren van de leukocyten Egress via de lymfevaten van lymfkliertest huid en tumoren

Dit artikel biedt drie eenvoudige en toegankelijke testen voor het beoordelen van het lipidemetabolisme bij muizen.

Beoordeling van de lipidenbehandelingscapaciteit van het hele lichaam bij muizen

Ontregelde intestinale epitheliale barrièrefunctie en immuunresponsen zijn kenmerken van inflammatoire darmziekten die slecht worden onderzocht vanwege een gebrek aan fysiologische modellen. Hier beschrijven we een muis intestinale lus model dat een goed gevasculariseerd en exteriorized darmsegment gebruikt om mucosale permeabiliteit en leukocyten rekrutering in vivo te bestuderen.

Functionele beoordeling van intestinale permeabiliteit en neutrofiele transepitheliale migratie bij muizen met behulp van een gestandaardiseerd intestinale lusmodel

Dit artikel beschrijft een methode voor magnetische isolatie op basis van kralen van endotheelcellen van muizen uit dermale lymfatische capillairen. De geïsoleerde lymfatische endotheelcellen kunnen worden gebruikt voor stroomafwaartse in-vitro-experimenten en eiwitexpressie-analyse.

Isolatie van dermale lymfatische endotheelcellen bij muizen

Dit protocol beschrijft een overlevingsprocedure voor een veilige en goed verdraagde muismesenteriale lymfadenectomyat van elk van vier stations langs de mesenterische lymfeklierketen. Deze procedure is aanpasbaar om selectieve verstoring van lymfecommunicatie met de distale colon, proximale dikke darm en/of dunne darm mogelijk te maken.

Muismesenteriene lymfadenectomie voor selectieve verstoring van lymfatische communicatie met regio-specifieke darmen

Leer de isolatie van stromende mesenteriale lymfe bij muizen om lipideabsorptie en chylomicronsecretie in vivo te kwantificeren. Deze methode vermindert dierstress en verhoogt de overlevingskans tijdens metabool onderzoek.

De isolatie van stromende mesenteriale lymfe bij muizen om in vivo kinetiek van lipideabsorptie in de voeding en chylomicronsecretie te kwantificeren (Video) | JoVE Journal

De isolatie van stromende mesenteriale lymfe bij muizen om in vivo kinetiek van lipideabsorptie in de voeding en chylomicronsecretie te kwantificeren

Meer video's verkennen