Een nanobar-ondersteund lipide bilayer-systeem voor de studie van membraankrommingsgevoelige eiwitten in vitro

Dit nanobar-ondersteunde lipide bilayer-systeem kan worden gebruikt om de rol van membraankromming te bestuderen bij het reguleren van de dynamiek en distributie van eiwitten en lipiden tijdens celactiviteiten. Deze techniek biedt zowel hoge subwortel als slechte in de membraankrommingsgeneratie door een continue lipide bilayer te vormen op patent nanobarfouten met membraankromming vooraf gedefinieerd door nanofabricage met hoge resolutie. Plaats om te beginnen de nanochip in een bekerglas van 10 milliliter met de patroonzijde naar boven gericht.

Voeg voorzichtig een milliliter 98% zwavelzuur toe aan het bekerglas en zorg ervoor dat het zuur de voor- en achterkant van de chip volledig bedekt. Draai het bekerglas langzaam rond en voeg druppel voor druppel 200 microliter 30% waterstofperoxide toe totdat het hele bekerglas heet wordt. Zorg ervoor dat zwavelzuur en waterstofperoxide goed worden gemengd om Piranha-oplossing te vormen voor het verwijderen van organische moleculen uit de nanochip.

Plaats het bekerglas in een secundaire glazen container en houd de nanochip 's nachts ondergedompeld in de Piranha-oplossing om de onzuiverheden grondig te reinigen. Haal het bekerglas eruit en pipetteer de Piranha-oplossing voorzichtig in een zuurafvalcontainer. Laad vijf milliliter gedeïoniseerd water in het bekerglas om het restzuur te verdunnen en weg te gooien in het zure afval.

Herhaal deze stap vijf keer. Pak de chip met een pincet en was met een continue stroom gedeïoniseerd water om restzuur grondig te verwijderen. Föhn de chip met 99,9% stikstofgas voor SLB-vorming.

Soniceer het lipidenmengsel gedurende 30 minuten. Vries het lipidenmengsel gedurende 20 seconden in vloeibare stikstof in en ontdooi vervolgens bij 42 graden Celsius gedurende twee minuten in een waterbad. Herhaal de vries-/dooicycli 30 keer.

Daarna ziet het lipidenmengsel eruit als een heldere vloeistof. Laat het lipidenmengsel door de mini-extruder lopen en extrudeer 20 keer heen en weer. Verzamel de SUV's van de spuit aan de andere kant om de verontreiniging met grotere deeltjes of vreemd materiaal te verminderen en breng deze over in een centrifugebuis van 1,5 milliliter.

Haal de gereinigde nanochip voorzichtig uit gedeïoniseerd water met een pincet en föhn droog met 99,9% stikstofgas. Voer oppervlaktereiniging van de nanochip uit met luchtplasmabehandeling gedurende één uur. Monteer de nanochip in een PDMS-kamer.

Begin met het plaatsen van de chip op een schoon oppervlak met het patroon naar boven gericht. Bedek het middelste PDMS voorzichtig met de chip en zorg ervoor dat het hele patroon wordt blootgesteld aan het centrale deel van de grote ovaalvormige opening in het middelste PDMS. Bedek het bovenste PDMS met het middelste PDMS en houd de twee kleine gaten binnen het gebied van het grote ovale gat van het middelste PDMS.

Vervolgens wordt de PDMS-kamer geassembleerd. Laad de SUV's in het PDMS-kanaal vanuit een van de twee kleine gaatjes in het bovenste PDMS met een pipet en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur om de SLB te vormen. Pipetteer de PBS-buffer voorzichtig in het PDMS-kanaal vanaf de ene kant van het kleine gat en verwijder het afval met een wattenstaafje uit het andere gat om de ongebonden SUV's weg te spoelen.

Verkrijg vervolgens de SLB gevormd op de nanochip. Stel de laserscan confocale microscopie in met behulp van een 100 x olie objectief. Open de Zen-software om de excitatielaserkracht te selecteren die de fluorescentie van het lipide en eiwit kan prikkelen.

Kies Acquisitiemodus. Klik vervolgens op Smart Setup, gevolgd door Texas Red. Pas de scherpstelling aan met de focusknop om de nanostaven op de chip te lokaliseren totdat de randen van de nanobalk scherp zijn onder het lipidekanaal.

Stel de scanparameters in om een controlebeeld van het lipidenkanaal te verkrijgen voordat u eiwit toevoegt. Voer de FRAP-test uit door te bleken met fluorescerend gelabelde lipide bilayer op een willekeurig enkel nanobargebied. Schakel de selectievakjes Experimentgebieden en Bleken in.

Teken een cirkelvormig gebied met een diameter van vijf micrometer dat de hele nanobalk in het midden kan omvatten en voeg toe aan de experimentgebieden. Voer TimeLapse-beeldparameters in. Kies Tijdreeks.

Klik vervolgens op Duur. Selecteer 100 cycli en interval gelijk aan twee seconden. Voer bleekparameters in.

Schakel de laser selectievakjes in die FRAP uitvoeren en wijzig het vermogen in 100% Klik op Experiment starten voor het FRAP-experiment. Laad de eiwitoplossing in het PDMS-kanaal en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur om de binding van het eiwit op de SLB mogelijk te maken. Heroriënteer de nanobaren en stel de scanparameters in om beelden te maken van zowel lipide- als eiwitkanalen voor detectie van eiwitkromming.

Selecteer Experimentregio's en voer de FRAP-test uit op zowel lipide- als eiwitkanalen en voer TimeLapse-beeldvorming uit om de mobiliteit van krommingsgevoelige eiwitten te karakteriseren. Beide tonen een verhoogde accumulatie aan het einde van SLB-gecoate individuele nanobars met een breedte van 300 nanometer. Hier bevat de SLB 10%PS om de eiwitbinding elektrostatisch te verbeteren.

Beide eiwitten hebben een hogere end-to-center ratio dan lipiden, die ongeveer één is. Bij het vergelijken van de IDR FBP17 en F-Bar duidt de hogere eind-tot-middenverhouding van IDR FBP17 op een sterkere krommingsdetectie dan F-Bar. Alle drie de eiwitten vertoonden preferentiële accumulatie op de nanobar end curved membrane sites wanneer de kromming afnam tot onder de 400 nanometer in diameter.

Van deze drie eiwitdomeinen geeft IDR FBP17 de hoogste nanostaaf en -dichtheid, wat wijst op het sterkste detectievermogen van krommingen, terwijl F-Bar de laagste waarde laat zien. Eiwitbindingscurve kan worden uitgezet door de eiwitconcentratie geleidelijk te verhogen, wat aantoont dat IDR FBP17 een sterk coöperatief krommingsdetectievermogen heeft. Vergeleken met het snelle herstel van lipidesignalen op nanobaren, kan de F-Bar niet binnen twee minuten herstellen, wat wijst op de aanzienlijk verminderde membraanmobiliteit en associatiedynamiek op de gebogen membraanlocaties.

Verrassend genoeg vertoonden IDR FBP17-signalen, anders dan het gedrag van F-Bar, duidelijk herstel binnen hetzelfde tijdsbestek, wat wijst op de dynamische aard van IDR FBP17 geaccumuleerd op de gebogen membranen. Na het wegspoelen van de ongebonden IDR FBP17 in de oplossing, kon hetzelfde herstel in het IDR FBP17-kanaal echter niet worden waargenomen als voorheen. De SLB-kwaliteit is erg belangrijk bij het bestuderen van de interactie tussen gebogen membraan en eiwit.

Dus de FRAP-test is nodig in ons experiment om de membraanmobiliteit te valideren. Dit systeem zal de onderzoekers helpen om verschillende parameters te bestuderen die van invloed zijn op de eiwitinteractie met het gebogen membraan, zoals de krommingsgevoelige domeinen en de lipidesamenstelling, en om de dynamische studies uit te voeren op gebogen membraan zoals gezichtsscheidingsgedrag.