FlowCytometrie-gebaseerde kwantificering en analyse van myocardiale B-cellen

De literatuur rapporteert contrasterende gegevens over de prevalentie van myocardiale B-cellen. Dit komt waarschijnlijk voort uit variabiliteit in perfusie- en verteringstechnieken. Ons protocol maakt reproduceerbare flowcytometrie-gebaseerde analyse op myocardiale B-cellen mogelijk.

Deze techniek maximaliseert de herstelopbrengst van B-cellen en vermindert de variabiliteit in flowcytometrietellingen tussen B-cellen en andere populaties uit hartmonsters. Deze geoptimaliseerde verterings- en isolatiemethode kan eenvoudig worden aangepast om een uitgebreid antilichaampanel te implementeren om verschillende immuunceltypen in het hart te bestuderen. Het protocol kan ook worden toegepast op andere organen, zoals longen of lever, om B-cellen te bestuderen die geassocieerd zijn met die organen.

Om te beginnen, weeg een 12 weken oude mannelijke muis. Laad een insulinespuit van 310 cc met 100 microliter van de B220-antilichaamoplossing. Injecteer het verdunde B220-antilichaam door retro-orbitale injectie en ga onmiddellijk over tot orgaanoogst en perfusie.

Houd na euthanasie de huid van de muis met een tang op het epigastrische gebied. Maak een opening van twee millimeter in de huid met een schaar en gebruik de tang om de huid weg te pellen om de fascialaag te onthullen. Snijd bij de overbuikheid door de fascia en het buikvlies.

Klem het xiphoid-proces met behulp van een hemostatische tang. Maak een verticale snede door de borstwand ter hoogte van de midclaviculaire lijn aan elke kant en til de voorste borstwand op om de mediastinuminhoud te onthullen. Houd de aorta stevig van achteren vast met behulp van een tang.

Breng de naald van de spuit in de top van het hart. Doordrenkt met drie milliliter HBSS met een snelheid van drie milliliter per minuut. Snijd de aorta en verwijder het hart.

Was het hart in de petrischaal met HBSS. Weeg het geïsoleerde hart en noteer het gewicht in milligrammen. Gehakt het hart op kamertemperatuur in kleine stukjes met een mes.

De hartstukken moeten ongeveer 1,5 millimeter groot zijn. Meet de massa van het hartweefsel met behulp van een balans en plaats 60 milligram van het gehakte hart dat moet worden verteerd in een buis van 15 milliliter op ijs met drie milliliter HBSS. Herhaal dit proces voor een muis die de B220-antilichaaminjectie niet heeft ontvangen en plaats deze in de buis met drie milliliter HBSS-gelabeld referentiecontroleweefsel.

Voeg enzymen toe aan elke buis die gehakte weefsels bevat. Voeg 0,5 microliter per milligram DNase I, één 0,5 microliter per milligram collagenase II en 0,2 microliter per milligram hyaluronidase toe. Plaats de verteringsreactie gedurende 30 minuten in de shaker met 300 omwentelingen per minuut.

Buizen worden in de shaker geplaatst onder een kleine hoek, ongeveer 25 graden helling. Voeg zeven milliliter HBSS toe aan elk van de 15-milliliter reactiebuizen en centrifugeer bij 250 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Na het decanteren van het supernatant, resuspenseer elke pellet in vijf milliliter ACK lysis buffer.

Incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Nadat u 10 milliliter PBS aan elke buis hebt toegevoegd, mengt en filtert u in een buis van 50 milliliter met een zeef van 40 micrometer. Sla alle vuil op het filter kapot met een spuitzuiger om ervoor te zorgen dat al het materiaal door het filter gaat.

Nadat u PBS door het filter hebt toegevoegd totdat het volume 25 milliliter per hart bereikt, voegt u nog eens 25 milliliter PBS toe aan de referentiecontroleweefselbuis en verdeelt u het volume in twee verschillende buizen. Label een van de buizen ongebrand en de andere levend / dood. Na centrifugeren bij 250 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius, decanteert u het supernatant en resuspenseert u de niet-gekleurde buis in 100 microliter PBS en elk van de andere pellets in 100 microliter van de levende / dode vlekoplossing.

Incubeer op ijs gedurende 30 minuten in het donker. Nadat u 500 microliter FACS-buffer aan elk monster hebt toegevoegd, brengt u het over in een FACS-buis door een filter van 40 micrometer. Na het weigeren van de FACS-buizen bij 250 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en het weggooien van het supernatant, resuspendeert u de pellet in 500 microliter FACS-buffer.

Voeg 50 microliter FC-blokkerende oplossing toe aan elke buis, behalve de niet-gekleurde en levende / dode buizen. Meng en incubeer gedurende vijf minuten. Na het toevoegen van 50 microliter antilichaammixoplossing aan elke buis, behalve de niet-gekleurde en levende / dode buizen, incubeer gedurende 30 minuten in het donker en bedek de ijsemmer met aluminiumfolie.

Net als bij de levende/dode vlek, opnieuw wassen met 500 microliter FACS-buffer en resuspender in 300 tot 500 microliter FACS-buffer. Open de instrumentbesturingssoftware. Selecteer bovenaan het venster het tabblad Acquisitie en klik op Nieuw.

Typ in het bibliotheekgedeelte in het veld Type om te filteren PE, PerCP-Cy5.5, brilliant violet 421, Alexa Fluor 700 en Zombie Aqua, selecteer de fluoro-4 en klik op Toevoegen nadat u ze hebt getypt. Klik vervolgens op Volgende om door te gaan naar het tabblad Groepen. Klik nu op het symbool met een buis om het hart toe te voegen voor de analyse.

Klik op de referentiegroep en er verschijnt een venster. Selecteer in de kolom fluorescerende tags Zombie Aqua als de fluorescerende tag en verwijder alle andere door op het rode prullenbakpictogram naast elk te klikken. Selecteer vervolgens in het pictogram Besturingstype de optie Cellen.

Klik vervolgens op Opslaan. Klik op Volgende. Klik vervolgens op het tabblad Markeringen.

Er wordt een tabel weergegeven. Typ de bijbehorende celmarkering in de eerste rij van elke fluoro-4-kolom en druk op Enter. Klik tweemaal op Volgende om naar het tabblad Acquisitie te gaan.

Typ 10 miljoen in Gebeurtenissen om de experimentele monsters vast te leggen en typ 200, 000 in hetzelfde veld voor de referentiegroepregel. Klik op Opslaan en openen. Klik linksonder op Instrument Control.

Stel de spanning in op FSC 50, SSC 175, SSC-B 175. Selecteer het acquisitiebesturingselement. Voor de debietoptie selecteert u Hoog in het vervolgkeuzemenu.

Vortex de onbevlekte hartbuis en plaats deze stevig op de injectiepoort van het monster. Zorg ervoor dat de groene indicatorpijl naar het juiste voorbeeld wijst. Klik vervolgens op Opnemen en wacht tot de gebeurtenissen zijn opgenomen.

Doe hetzelfde voor het levend/dood gekleurd hartweefsel. Selecteer het menu Onmengingen en stel de besturingselementen in. Schakel het selectievakje autofluorescentie als fluorescentietag in.

Klik vervolgens op Volgende om door te gaan naar het tabblad Positieve/negatieve populaties identificeren. Op dit tabblad wordt een plot van voorwaarts spreidingsgebied versus zijspreidingsgebied weergegeven. Klik en sleep de punten van de veelhoek om een gebied tussen 1 en 4 miljoen op de as van het voorwaartse spreidingsgebied en tussen 0,2 en 3 miljoen op de as van het spreidingsgebied aan de zijkant te selecteren.

In de volgende plot aan de rechterkant wordt V5-A weergegeven op de X-as. Verplaats de poorten om de helft van de piek uiterst rechts als positief te selecteren en een gebied aan de linkerkant van het plot als negatief. Selecteer in de plot met de titel Reference Group-Unstained een populatie in een vergelijkbaar bereik.

Voor de niet-bevlekte hoeft geen positief/negatief te worden geselecteerd. Klik op de knop Live unmixing. Verkrijg nu de experimentele monsters, vortex de buis en plaats deze veilig op de SIP.

Zorg ervoor dat de groene indicatorpijl naar het juiste voorbeeld wijst. Klik vervolgens op Record in het deelvenster Acquisitiecontrole van de cytometersoftware en wacht tot de gebeurtenissen zijn vastgelegd. Selecteer het tabblad Standaard niet-gemengd werkblad.

Maak een FCS-A versus SSC-A plot met behulp van de dot plot tool bovenaan. Selecteer gebeurtenissen hoger dan 0,4 miljoen op de FSC-A-as en hoger dan 0,8 miljoen op de SSC-A-as met behulp van het gereedschap polygoonselectie. Maak een nieuwe plot door te dubbelklikken op de selectie en klik in deze nieuwe plot met de rechtermuisknop op het Y-aslabel en selecteer live / dode vlek.

Klik met de rechtermuisknop op het X-aslabel en selecteer Autofluorescentie A.Selecteer alle gebeurtenissen onder 10 tot de vijfde op de live / dode-as. Dit zijn de levende cellen. Dubbelklik in deze selectie.

Selecteer in de nieuwe plot PerCP-Cy5.5A voor de X-as en SSC-A voor de Y-as. Selecteer de populaties aan de rechterkant van de PerCP-Cy5.5A. Dit zijn de immuuncellen.

Dubbelklik op de selectie. Selecteer op het nieuwe perceel FSC-A voor de X-as en voorwaartse spreidingshoogte voor de Y-as. Selecteer de gebeurtenissen die een trend volgen waarin de FSC-A-waarde en SSC-A-waarde hetzelfde zijn.

Dit selecteert enkele cellen en elimineert doubletten. Dubbelklik op deze selectie om een nieuwe plot weer te geven in de CD45-positieve eencellige populatie. Selecteer uit de CD45-positieve eencellige populatieplot briljant violet 421 op de X-as versus SSC-A op de Y-as.

Selecteer de populatie rechts op de schitterende violette 421-as. Dit is de B-celpopulatie. Dubbelklik twee keer in deze populatie om twee nieuwe percelen te maken met de B-celpopulatie.

Zet de eerste B-celplot op met PEA op de X-as en briljant violet 421A op de Y-as. De populatie rechts komt overeen met de intervasculaire B-cellen en de populatie links vertegenwoordigt de interstitiële B-cellen. Selecteer beide.

Stel de tweede B-celplot in met Alexa Fluor 700A op de X-as en SSC-A op de Y-as. De populatie aan de linkerkant komt overeen met de CD11b-negatieve cellen en de gebeurtenissen aan de rechterkant komen overeen met de CD11b-positieve cellen. Klik met de rechtermuisknop op elke sectie en klik vervolgens op Gate-eigenschappen.

Klik op Aantal en ouder om het aantal gebeurtenissen en percentages van de bovenliggende populaties weer te geven. Noteer het aantal gebeurtenissen en percentages voor verdere gegevensanalyse. Na het verwijderen van doubletten in een naïef ongewond hart, wordt verwacht dat ongeveer 20% van de CD45-positieve cellen CD19-positieve B-cellen zullen zijn.

Van deze cellen bevindt zich gemiddeld 5,5% in de interstitiële ruimte. 94,5% bevindt zich in de intravasculaire ruimte. Van de hele B-celpopulatie in het hart komt slechts ongeveer 1,6% overeen met B1-cellen op basis van de oppervlaktemarker CD11b en de andere 98,4% komt overeen met B2-cellen.

Bij het analyseren van myocardiale B-cellen via flowcytometrie is het cruciaal om het hart goed te doordringen en te hakken volgens het protocol. Een goede filtratie van het verteerde hart is ook essentieel om het herstel van immuuncellen te maximaliseren.