Name: FlowCytometrie-gebaseerde kwantificering en analyse van myocardiale B-cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-17T14:50:00.000+00:00
Duration: 12 min 46 s
Description: Leer een geoptimaliseerde flowcytometrie-methode voor kwantificering van myocardiale B-cellen in muizenhartweefsel. Dit protocol maximaliseert de opbrengst en minimaliseert variabiliteit in celanalyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd gefinancierd door NHLBI-subsidies 5K08HLO145108-03 en 1R01HL160716-01 toegekend aan Luigi Adamo.
De Aurora Flow Cytometer die werd gebruikt om deze studie te ontwikkelen, werd gefinancierd door NIH Grant S10OD026859. We erkennen de steun van de JHU Ross Flow Cytometry Core.

Alle experimenten die in dit manuscript worden beschreven, werden uitgevoerd met de goedkeuring van de IACUC aan de Johns Hopkins University School of Medicine.
1. Voorbereidingen
<ol><li>Bereid de FACS-buffer voor, zoals beschreven in tabel 1.</li>
	<li>Zorg voor voldoende CO2 om de dieren te euthanaseren.</li>
	<li>Bereid de snijruimte voor (plaats het bankkussen en plaats de tape en snijgereedschappen in de buurt).</li>
	<li>Label de 15 ml buisjes, doe 3 ml HBSS met calcium en magnesium in elke buis (zie tabel met materialen) en plaats ze op ijs (één buis per hart en een extra voor de referentiegroep / flowcytometriecontroles). Vul ook de kleine (35 mm) petrischaaltjes met HBSS.</li>
	<li>Schakel de temperatuurgeregelde shaker in, stel deze in op 37 °C en koel de centrifuge voor op een temperatuur van 4 °C.</li>
	<li>Bereid de spuitpomp voor en stel het debiet in op 3 ml/min. Vul een spuit van 20 ml met HBSS, prime de buislijn met buffer en verwijder eventuele bubbels.</li>
</ol>2. Intravasculaire B-celkleuring (in vivo)
<ol><li>Weeg een 12 weken oude mannelijke muis van de C57BL/6J stam. Laad een insulinespuit van 3/10 cc met 100 μL van de B220-antilichaamverdunning (1:10, in PBS). Dek de spuit af met aluminiumfolie ter bescherming tegen licht.</li>
	<li>Verdoof één muis.<ol><li>Breng een intraperitoneale injectie van 2% 2,2,2-tribroommoethanol aan met een dosis van 400 mg/kg en wacht 10-20 min. OPMERKING: Controleer de ademhaling en beweging van de muis. Zodra de muis stopt met bewegen, stimuleer de pijn door in de teen te knijpen; de afwezigheid van een ontwenningsreflex duidt op adequate anesthesie.</li>
		<li>Als er in de loop van 20 minuten geen adequate anesthesie wordt bereikt, kan een extra dosis anestheticum van 100 mg / kg worden toegediend en moet elke 5 minuten een beoordeling van de kinetiek van de muis, de ontwenningsreflex en de ademhaling worden uitgevoerd.</li>
	</ol></li>
	<li>Plaats de muis op de laboratoriumbank op een bankkussen dat naar één kant neigt, trek voorzichtig de huid van de rug naar beneden en druk het lichaam lichtjes tegen de bank om het oog te laten uitsteken.</li>
	<li>Injecteer het verdunde B220-antilichaam uit stap 2.1 door retroorbitale injectie.<ol><li>Breng de spuit in het oog op 45° van het sagittale vlak van het hoofd van de muis. Injecteer de oplossing langzaam. Als er weerstand wordt gevoeld, verwijder dan de spuit en ga opnieuw naar binnen. Wacht 2 min. OPMERKING: Langdurige incubatietijd zou het vermogen om intra-vasculaire versus extra-vasculaire B-cellen te onderscheiden in gevaar brengen, omdat het tijd zou geven aan het geïnjecteerde antilichaam om buiten de vasculatuur te diffunderen.</li>
	</ol></li>
	<li>Euthanaseer de muis volgens de IACUC-voorschriften.<ol><li>Open de CO2-stroom naar de euthanasiekamer met een snelheid van 0,5 l/min, of het aanbevolen debiet op basis van de grootte van uw kamer.</li>
		<li>Plaats de muis gedurende de aanbevolen tijd in de kamer en zorg ervoor dat deze niet meer ademt. Verwijder het en voer cervicale dislocatie uit als een secundaire methode van euthanasie.</li>
		<li>Zodra de muis is geëuthanaseerd, gaat u onmiddellijk over tot orgaanoogst en perfusie.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Hart collectie
<ol><li>Borstopening.<ol><li>Houd de huid van de muis met een tang op het epigastrische gebied. Maak een opening van 2 mm in de huid met een schaar en gebruik de tang om de huid weg te pellen om de fascialaag, een glanzende doorschijnende laag, van de borst en buik te onthullen. Snijd bij de overbuikheid door de fascia en het peritoneum om de buikwand te openen en het xiphoid-proces te onthullen. Klem het xiphoid-proces met behulp van een hemostatische tang.</li>
		<li>Maak met de schaar een verticale snede door de borstwand ter hoogte van de middelste claviculaire lijn aan elke kant en til de voorste borstwand op om de mediastinuminhoud te onthullen, met behulp van een hemostatische tang als gewicht om de opening te behouden.</li>
	</ol></li>
	<li>Hartperfusie en extractie.<ol><li>Verwijder met behulp van een tang al het vet of thymusweefsel rond het hart.</li>
		<li>Houd de aorta stevig van achteren vast met behulp van een tang. Breng de naald van de spuit (25 G) in de top van het hart. Perfuseer met 3 ml HBSS met een snelheid van 3 ml/min. OPMERKING: Controleer de perfusie. De lever moet zich vullen en het bloed in de kransslagaders moet volledig worden verwijderd. Het gebruik van een spuitpomp gekalibreerd tot 1 ml / minuut wordt aanbevolen om een constante stroom te behouden.</li>
		<li>Knip de aorta met een schaar en haal het hart eruit. Was het hart in de petrischaal met HBSS om eventueel achtergebleven bloed te verwijderen. Verwijder met een schaar en tang het vet, bindweefsel en de thymus en droog het hart. Weeg het geïsoleerde hart en noteer het gewicht in milligrammen. Gehakt het hart bij kamertemperatuur in kleine stukjes (1-2 mm) met een mes. OPMERKING: Volwassen muizenharten kunnen tussen 0,090-0,210 mg wegen.</li>
		<li>Meet de massa van het hartweefsel en plaats 60 mg van het gehakte hart dat moet worden verteerd in een buis van 15 ml met 3 ml HBSS. Behoud het resterende hartweefsel en plaats in een buis met het label "Referentiecontroleweefsel"; dit zal worden gebruikt voor compensatiecontrole voor levend-dood signaal en autofluorescentie.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Hartvertering en celkleuring
<ol><li>Voeg enzymen toe aan elke buis die gehakt weefsel bevat (zie tabel 1). Voeg 0,5 μL/mg DNase 1 (300 eenheden voor 60 mg hartweefsel), 0,5 μl/mg collagenase II (625 eenheden voor 60 mg hartweefsel) en 0,2 μl/mg hyaluronidase (50 eenheden voor 60 mg hartweefsel) toe aan de buis.</li>
	<li>Plaats de verteringsreactie gedurende 30 minuten bij 300 rpm in de shaker. Stel het schudrek in op ongeveer 25° helling.</li>
	<li>Voeg 7 ml HBSS toe aan elk van de reactiebuizen van 15 ml en centrifugeer bij 250 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C met versnelling en breken ingesteld op matig of langzaam. Decanteer het supernatant en resuspendeer elke pellet in 5 ml ACK-lysisbuffer om rode bloedcellen te verwijderen. Incubeer in de ACK-lysisbuffer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Voeg 10 ml PBS toe aan elke buis, meng en filtreer vervolgens in een buis van 50 ml met een zeef van 40 μm. Zorg ervoor dat al het vuil zich in de filterkamer bevindt. Sla vuil op het filter kapot met een spuitzuiger totdat het volledig in de filterkamer is opgehangen.</li>
	<li>Voeg PBS toe door het filter totdat het volume 25 ml per hart bereikt; hierdoor kunnen de zwevende cellen door het filter. Voeg nog eens 25 ml PBS toe aan de referentiecontroleweefselbuis en verdeel het volume in verschillende buizen (elk 25 ml). Label een van de buizen "Unstained" en de andere als "Live-dead". Centrifugeer bij 250 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. OPMERKING: Bereid op dit punt de verdunning voor de levend-dode vlek voor (verdunning: 1:500 in 1x PBS).</li>
	<li>Decanteer het supernatant, resuspendeer de pellet in de Unstained tube in 100 μL PBS en elk van de andere pellets in 100 μL van de levend-dode vlekverdunning. Incubeer op ijs gedurende 30 minuten in het donker en bedek de ijsemmer met aluminiumfolie.</li>
	<li>Voeg 500 μL FACS-buffer toe aan elk monster en breng het over in een gelabelde FACS-buis door een filter van 40 μm. Centrifugeer de FACS-buizen bij 250 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg. Resuspendeer de pellet in 500 μL FACS-buffer.</li>
	<li>Voeg 50 μL Fc-blokkeringsoplossing (zie tabel 1) toe aan elke buis, met uitzondering van de niet-gekleurde en levend-dode buizen. Meng en incubeer gedurende 5 min.</li>
	<li>Voeg 50 μL antilichaammengseloplossing (zie tabel 1) toe aan elke buis, met uitzondering van de niet-gekleurde en levend-dode buizen, en incubeer gedurende 30 minuten in het donker, waarbij de ijsemmer wordt bedekt met aluminiumfolie.</li>
	<li>Voeg 2 ml FACS-buffer toe aan elke buis en centrifugeer bij 250 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant en resuspendeer in 300-500 μL FACS-buffer.</li>
</ol>5. Flowcytometrie
<ol><li>Instellingen voor instrumentbesturing instellen. OPMERKING: In dit protocol wordt het monster geanalyseerd met een Cytek Aurora flowcytometer van 4 lasers. Een andere geschikte flowcytometer kan worden gebruikt om de markers van belang te detecteren.<ol><li>Open de instrumentbesturingssoftware (zie Materiaaltabel). Selecteer bovenaan het venster het tabblad Acquisitie en klik op Nieuw +. Er wordt een venster met de naam Nieuw experiment maken weergegeven.</li>
		<li>Typ in het gedeelte Bibliotheek in het veld Type om te filteren PE, PerCP-Cy5.5, BV421, Alexa Fluor 700 en Zombie Aqua en klik op Toevoegen nadat u elk hebt getypt. De fluorofoornamen moeten rechts worden gezien. Klik vervolgens op Volgende om door te gaan naar het tabblad Groep .</li>
		<li>Klik op het tabblad Groep op het symbool met een buis om het hart voor de analyse toe te voegen.</li>
		<li>Klik op de groep + Referentie en er verschijnt een venster. Selecteer in de kolom fluorescerende tags Zombie Aqua en selecteer in de kolom besturingstype Cellen en klik vervolgens op Opslaan.</li>
		<li>Klik op Volgende > tabblad Markeringen ; er wordt een tabel weergegeven met de namen van de fluoroforen. Typ de overeenkomstige celmarker in de eerste rij van elke fluorofoorkolom en typ Enter: CD45 voor PerCP-Cy5.5; CD19 voor BV421; CD11b voor Alexa Fluor 700; B220 voor PE; en live-dead voor Zombie Aqua.</li>
		<li>Klik tweemaal op Volgende om naar het tabblad Acquisitie te gaan. Typ 10.000.000 in Gebeurtenissen om op te nemen van de experimentgroep en typ 200.000 in hetzelfde veld voor de referentiegroepregel. Klik op Opslaan en openen. De andere instellingen moeten standaard blijven, Stoptijd naar 10.000 en Volume stoppen naar 3.000.</li>
		<li>Klik linksonder op Instrument control. Stel voltage in op FSC-50, SSC-175, SSC-B-175. Selecteer vervolgens het acquisitiebesturingselement. Voor de optie Stroomsnelheid selecteert u Hoog in het vervolgkeuzemenu.</li>
	</ol></li>
	<li>Verkrijg referentiemonsters met een cytometer en ontmeng in software.<ol><li>Vortex de unstained hartbuis en plaats deze stevig op de monsterinjectiepoort (SIP). Controleer of de groene indicatorpijl naar het juiste monster wijst, klik vervolgens op Start in het deelvenster Acquisitiecontrole van de cytometersoftware en wacht tot de gebeurtenissen zijn vastgelegd. Doe hetzelfde voor het met leven bevlekte hartweefsel.</li>
		<li>Selecteer het menu Onmengingen en stel de volgende besturingselementen in:<ol><li>Schakel de selectievakjes voor PE, PerCP-Cy5.5, BV421 en Alexa Fluor 700 in de kolom van de bibliotheek in. Zorg ervoor dat Zombie Aqua niet is aangevinkt in dezelfde kolom. Vink onderaan de optie autofluorescentie aan als fluorescentietag.</li>
			<li>Klik op Volgende om door te gaan naar het tabblad Positieve/negatieve populaties identificeren. Op dit tabblad wordt een plot van FSC-A vs. SSC-B-A weergegeven. Klik en sleep de punten van de veelhoek om een gebied te selecteren tussen 1,0 M en 4,0 M op de FSC-A-as en tussen 0,2 M en 3,0 M op de SSC-B-A-as.</li>
			<li>In de volgende plot aan de rechterkant wordt V5-A weergegeven op de X-as. Verplaats de poorten om de helft van de piek uiterst rechts als positief te selecteren en een gebied aan de linkerkant van het perceel als negatief. Selecteer in de plot met de titel Referentiegroep - Niet-gekleurd een populatie in een vergelijkbaar bereik. Hiervoor hoeft het niet-bevlekte geen positief-negatief te worden ingesteld.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Verkrijg experimentele monsters.<ol><li>Voor elke buis met een monster voor een individuele muis, vortex de buis en plaats deze veilig op de SIP. Controleer of de groene indicatorpijl naar het juiste voorbeeld wijst, klik vervolgens op Start in het deelvenster Acquisitiecontrole van de cytometersoftware en wacht tot de gebeurtenissen zijn vastgelegd.</li>
	</ol></li>
	<li>Gating strategie.<ol><li>Selecteer het tabblad Standaard niet-gemengd werkblad . Maak een FSC-A vs. SSC-A plot met behulp van de Dot plot tool bovenaan. Selecteer gebeurtenissen hoger dan 0,4 M op de FSC-A-as en hoger dan 0,8 M op de SSC-A-as met behulp van het gereedschap Polygoonselectie. Dubbelklik in deze selectie en er wordt een nieuwe plot weergegeven.</li>
		<li>Klik in de nieuw gemaakte plot met de rechtermuisknop op het X-aslabel en selecteer AF-A; klik met de rechtermuisknop op het label van de Y-as en selecteer Live-dead vlek. Klik bovenaan op het gereedschap Rechthoekselectie en selecteer alle gebeurtenissen onder 105 op de live-dode-as die overeenkomen met het lagere live-dead-signaal. Dubbelklik in deze selectie en er wordt een nieuwe plot weergegeven.</li>
		<li>Klik in de nieuwe plot met de rechtermuisknop om PerCP-Cy5.5-A voor de X-as en SSC-A voor de Y-as te selecteren. Selecteer met het gereedschap Rechthoekselectie de gebeurtenissen hoger dan 104 op de PerCP-Cy5.5-A-as die overeenkomen met de CD45-positieve cellen. Dubbelklik op de selectie en er verschijnt een nieuw plot.</li>
		<li>Klik in de nieuwe plot met de rechtermuisknop om FSC-A voor de X-as en FSC-H voor de Y-as te selecteren. Selecteer met behulp van de polygoonselectietool de gebeurtenissen die een trend volgen waarbij fsc-a-waarde en SSC-A-waarde hetzelfde zijn; hiermee worden de celdubbelen verwijderd en wordt de populatie in de selectie aangeduid als de CD45+ populatie. Dubbelklik op de selectie om een nieuw perceel weer te geven met de CD45+ populatie.</li>
		<li>Klik in de CD45+ populatieplot met de rechtermuisknop om BV421 te selecteren op de X-as versus SSC-A op de Y-as. Selecteer met het gereedschap Veelhoekselectie de populatie rechts op de BV421-as . Dit is de B-celpopulatie. Dubbelklik twee keer in deze populatie om twee nieuwe percelen te maken met de B-celpopulatie.<ol><li>Klik met de rechtermuisknop om de eerste B-celplot in te stellen met PE-A op de X-as en BV421-A op de Y-as . De populatie rechts komt overeen met de intravasculaire B-cellen en de populatie links vertegenwoordigt de interstitiële B-cellen. Gebruik het gereedschap Veelhoekselectie om een selectie van beide te maken.</li>
			<li>Klik met de rechtermuisknop om de tweede B-celplot in te stellen met Alexa Fluor 700-A op de X-as en SSC-A op de Y-as . De populatie aan de linkerkant komt overeen met de CD11b-cellen en de gebeurtenissen aan de rechterkant (indien aanwezig) komen overeen met de CD11b+ cellen.</li>
			<li>Klik met de rechtermuisknop op elke selectie en klik vervolgens op Gate Properties. Klik op Aantal en % Bovenliggend om de maten en percentages weer te geven. Noteer het aantal gebeurtenissen en percentages voor verdere gegevensanalyse.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Adamo, L., Rocha-Resende, C., Mann, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+B+lymphocytes+in+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The emerging role of B lymphocytes in cardiovascular disease.</a> Annual Review of Immunology. 38, 99-121 (2020).</li>
<li>Gowans, J. L., Knight, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+route+of+re-circulation+of+lymphocytes+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The route of re-circulation of lymphocytes in the rat.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 159 (975), 257-282 (1964).</li>
<li>Kunkel, E. J., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+and+the+tissue-specific+migration+of+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Chemokines and the tissue-specific migration of lymphocytes.</a> Immunity. 16 (1), 1-4 (2002).</li>
<li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+controlling+homeostatic+recirculation+and+tissue-specific+trafficking+of+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Archives+of+Allergy+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants controlling homeostatic recirculation and tissue-specific trafficking of lymphocytes.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 134 (2), 120-134 (2004).</li>
<li>Rocha-Resende, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+changes+in+myocardial+B+cells+mirror+changes+in+B+cells+associated+with+different+organs%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Developmental changes in myocardial B cells mirror changes in B cells associated with different organs.</a> JCI Insight. 5 (16), (2020).</li>
<li>Adamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+B+cells+are+a+subset+of+circulating+lymphocytes+with+delayed+transit+through+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Myocardial B cells are a subset of circulating lymphocytes with delayed transit through the heart.</a> JCI Insight. 5 (3), 139377(2020).</li>
<li>Adamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+subsets+of+cardiac+B+lymphocytes+improves+cardiac+function+after+acute+injury%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Modulation of subsets of cardiac B lymphocytes improves cardiac function after acute injury.</a> JCI Insight. 3 (11), (2018).</li>
<li>Rocha-Resende, C., Pani, F., Adamo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+modulate+the+expression+of+MHC-II+on+cardiac+CCR2%28-%29+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">B cells modulate the expression of MHC-II on cardiac CCR2(-) macrophages.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 157, 98-103 (2021).</li>
<li>Zouggari, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+lymphocytes+trigger+monocyte+mobilization+and+impair+heart+function+after+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">B lymphocytes trigger monocyte mobilization and impair heart function after acute myocardial infarction.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1273-1280 (2013).</li>
<li>Wu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-10-producing+B+cells+are+enriched+in+murine+pericardial+adipose+tissues+and+ameliorate+the+outcome+of+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">IL-10-producing B cells are enriched in murine pericardial adipose tissues and ameliorate the outcome of acute myocardial infarction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21673-21684 (2019).</li>
<li>Heinrichs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+healing+myocardium+mobilizes+a+distinct+B-cell+subset+through+a+CXCL13-CXCR5-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">The healing myocardium mobilizes a distinct B-cell subset through a CXCL13-CXCR5-dependent mechanism.</a> Cardiovascular Research. 117 (13), 2664-2676 (2021).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splenic+marginal+zone+B+lymphocytes+regulate+cardiac+remodeling+after+acute+myocardial+infarction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Splenic marginal zone B lymphocytes regulate cardiac remodeling after acute myocardial infarction in mice.</a> Journal of the American College of Cardiology. 79 (7), 632-647 (2022).</li>
<li>Yan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+dynamics+of+cardiac+immune+cell+accumulation+following+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Temporal dynamics of cardiac immune cell accumulation following acute myocardial infarction.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 62, 24-35 (2013).</li>
<li>Iwata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmunity+against+the+second+extracellular+loop+of+beta%281%29-adrenergic+receptors+induces+beta-adrenergic+receptor+desensitization+and+myocardial+hypertrophy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Autoimmunity against the second extracellular loop of beta(1)-adrenergic receptors induces beta-adrenergic receptor desensitization and myocardial hypertrophy in vivo.</a> Circulation Research. 88 (1), 578-586 (2001).</li>
<li>Jahns, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+for+a+beta+1-adrenergic+receptor-directed+autoimmune+attack+as+a+cause+of+idiopathic+dilated+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Direct evidence for a beta 1-adrenergic receptor-directed autoimmune attack as a cause of idiopathic dilated cardiomyopathy.</a> The Journal of Clinical Investigation. 113 (10), 1419-1429 (2004).</li>
<li>Christ, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+against+the+beta1+adrenoceptor+from+patients+with+dilated+cardiomyopathy+prolong+action+potential+duration+and+enhance+contractility+in+isolated+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies against the beta1 adrenoceptor from patients with dilated cardiomyopathy prolong action potential duration and enhance contractility in isolated cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (8), 1515-1525 (2001).</li>
<li>Jane-wit, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenergic+receptor+autoantibodies+mediate+dilated+cardiomyopathy+by+agonistically+inducing+cardiomyocyte+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Adrenergic receptor autoantibodies mediate dilated cardiomyopathy by agonistically inducing cardiomyocyte apoptosis.</a> Circulation. 116 (4), 399-410 (2007).</li>
<li>Ludwig, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+autoantibody-induced+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of autoantibody-induced pathology.</a> Frontiers in Immunology. 8, 603(2017).</li>
<li>Haudek, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc+receptor+engagement+mediates+differentiation+of+cardiac+fibroblast+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Fc receptor engagement mediates differentiation of cardiac fibroblast precursor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (29), 10179-10184 (2008).</li>
<li>Staudt, A., Eichler, P., Trimpert, C., Felix, S. B., Greinacher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc%28gamma%29+receptors+IIa+on+cardiomyocytes+and+their+potential+functional+relevance+in+dilated+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Fc(gamma) receptors IIa on cardiomyocytes and their potential functional relevance in dilated cardiomyopathy.</a> Journal of the American College of Cardiology. 49 (16), 1684-1692 (2007).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+natural+IgM+in+myocardial+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The role of natural IgM in myocardial ischemia-reperfusion injury.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 41 (1), 62-67 (2006).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+specific+self-reactive+IgM+antibody+that+initiates+intestinal+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Identification of a specific self-reactive IgM antibody that initiates intestinal ischemia/reperfusion injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (11), 3886-3891 (2004).</li>
<li>Schulze, K., Becker, B. F., Schauer, R., Schultheiss, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+ADP-ATP+carrier--an+autoantigen+in+myocarditis+and+dilated+cardiomyopathy--impair+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Antibodies to ADP-ATP carrier--an autoantigen in myocarditis and dilated cardiomyopathy--impair cardiac function.</a> Circulation. 81 (3), 959-969 (1990).</li>
<li>Matsumoto, Y., Park, I. K., Kohyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+epitope+spreading+is+a+critical+step+for+the+switch+from+C-protein-induced+myocarditis+to+dilated+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">B-cell epitope spreading is a critical step for the switch from C-protein-induced myocarditis to dilated cardiomyopathy.</a> The American Journal of Pathology. 170 (1), 43-51 (2007).</li>
<li>Caforio, A. L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+state+of+knowledge+on+aetiology%2C+diagnosis%2C+management%2C+and+therapy+of+myocarditis%3A+a+position+statement+of+the+European+Society+of+Cardiology+Working+Group+on+Myocardial+and+Pericardial+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Current state of knowledge on aetiology, diagnosis, management, and therapy of myocarditis: a position statement of the European Society of Cardiology Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases.</a> European Heart Journal. 34 (33), 2636-2648 (2013).</li>
<li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+cardiac+cellular+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li>
<li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+the+comprehensive+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+in+normal+and+inflamed+murine+non-lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues.</a> PLoS One. 11 (3), 0150606(2016).</li>
<li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li>
<li>Horckmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericardial+adipose+tissue+regulates+granulopoiesis%2C+fibrosis+and+cardiac+function+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Pericardial adipose tissue regulates granulopoiesis, fibrosis and cardiac function after myocardial infarction.</a> Circulation. 137 (9), 948-960 (2017).</li>
<li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+macrophage+lineages+contribute+to+disparate+patterns+of+cardiac+recovery+and+remodeling+in+the+neonatal+and+adult+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li>
<li>Bajpai, G., Lavine, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+macrophage+subsets+and+stromal+cells+from+human+and+mouse+myocardial+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of macrophage subsets and stromal cells from human and mouse myocardial specimens.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e60015(2019).</li>
<li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+staining+for+discrimination+of+vascular+and+tissue+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes.</a> Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).</li>
<li>Coffman, R. L., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B220%3A+a+B+cell-specific+member+of+th+T200+glycoprotein+family%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">B220: a B cell-specific member of th T200 glycoprotein family.</a> Nature. 289 (5799), 681-683 (1981).</li>
<li>Montecino-Rodriguez, E., Dorshkind, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-1+B+cell+development+in+the+fetus+and+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">B-1 B cell development in the fetus and adult.</a> Immunity. 36 (1), 13-21 (2012).</li>
<li>Bermea, K., Bhalodia, A., Huff, A., Rousseau, S., Adamo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+B+cells+in+cardiomyopathy+and+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Cardiology+Reports%22%5BJournal%5D)">The role of B cells in cardiomyopathy and heart failure.</a> Current Cardiology Reports. , 01722-01724 (2022).</li>
<li>Zhao, T. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rituximab+in+patients+with+acute+ST-elevation+myocardial+infarction%3A+an+experimental+medicine+safety+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Rituximab in patients with acute ST-elevation myocardial infarction: an experimental medicine safety study.</a> Cardiovascular Research. 118 (3), 872-882 (2022).</li>
<li>Kushnir, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B2+but+not+B1+cells+can+contribute+to+CD4%2B+T-cell-mediated+clearance+of+rotavirus+in+SCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">B2 but not B1 cells can contribute to CD4+ T-cell-mediated clearance of rotavirus in SCID mice.</a> Journal of Virology. 75 (12), 5482-5490 (2001).</li>
</ol>

Luigi Adamo is mede-oprichter van i-Cordis, LLC, een bedrijf dat zich richt op de ontwikkeling van immunomodulerende moleculen voor de behandeling van hartfalen, met een specifieke interesse in derivaten van het B-celmodulerende medicijn pirfenidon. De overige auteurs hebben geen conflicten te verklaren.

Een groeiend aantal aanwijzingen geeft aan dat B-cellen een belangrijke rol spelen in de context van myocardiale fysiologie en myocardiale remodellering / aanpassing aan letsel 7,8,9,10,11,12,13,36. Flowcytometrie is een uitstekend hulpmiddel om immuuncelpo...

B-lymfocyten zijn zeer gespecialiseerde immuuncellen die een belangrijke rol spelen in zowel adaptieve als aangeboren immuunresponsen1. Er zijn twee hoofdpopulaties van B-cellen: een kleinere populatie van B1-cellen die meestal worden geproduceerd tijdens het embryonale leven, en een overheersende populatie van B2-cellen die in het volwassen leven in het beenmerg worden geproduceerd1. Na rijping in het beenmerg migreren B-cellen naar primaire en secundaire lymfoïde organen. Van daaruit recirculeren ze continu tussen lymfoïde organen die door bloedvaten en lymfevaten reizen2. B-cellen brengen specifieke antilichamen tot expressie op hun oppervlak, die functioneren als receptoren. Wanneer B-cellen een antigeen tegenkomen dat zich aan hun receptor bindt, kan een activerend signaal worden geactiveerd. Geactiveerde B-cellen migreren naar het weefsel waar het antigeen werd gevonden of gaan terug naar het beenmerg waar ze kunnen rijpen tot antilichaamproducerende plasmacellen 3,4.
Onlangs is het gewaardeerd dat het hart een aanzienlijke populatie B-cellen herbergt. Studies bij knaagdieren hebben aangetoond dat B-cellen het hart vroeg koloniseren tijdens de embryonale ontwikkeling5, en dat myocardiale geassocieerde B-cellen meestal intravasculaire, naïeve B2-cellen zijn die zich hechten aan het endotheel 6,7, met een klein percentage B1-cellen7. Er zijn nog veel gebieden van onzekerheid, maar de beschikbare gegevens geven aan dat B-cellen een belangrijke rol spelen, zowel in het naïeve hart als in de context van myocardiale aanpassing aan letsel.
Studies in het naïeve muizenhart hebben aangetoond dat bij baseline myocardiale B-cellen zich meestal in de intravasculaire ruimte bevinden, gehecht aan het endotheel (>95% van de murine cardiale B-cellen bleken zich in de intravasculaire ruimte te bevinden). Deze B-cellen bleken genexpressiepatronen te hebben die verschillen van die van circulerende B-cellen geïsoleerd uit het perifere bloed. Analyse van naïeve harten van B-cel-deficiënte dieren en syngene controles wees uit dat dieren zonder B-cellen kleinere harten en hogere ejectiefractie6 hadden. Al dit bewijs suggereert dat B-cellen de myocardiale groei en/of myocardiale functie kunnen moduleren, en dat niet alleen interstitiële maar ook intravasculaire B-cellen verantwoordelijk kunnen zijn voor dergelijke waarnemingen. B-cellen bleken ook het fenotype van myocardiale residente macrofagen te moduleren8.
Verschillende studies hebben aangetoond dat B-cellen een belangrijke rol spelen in de context van myocardiale aanpassing aan letsel 8,9,10,11,12,13. B-cellen hopen zich tijdelijk op in het gewonde hart, waarschijnlijk via een CXCL13-CXCR5-afhankelijk mechanisme11,13. Van daaruit bevorderen B-cellen nadelige cardiale remodellering via verschillende mechanismen, waaronder cytokine-gemedieerde monocytenrekrutering 9,12. Bovendien kunnen B-cellen antilichamen tegen harteiwitten produceren die de uitbreiding van hartschade en ongunstige hartremodellering kunnen bevorderen via verschillende mechanismen 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . B-cellen kunnen ook beschermende effecten uitoefenen op het gewonde hart door de afscheiding van IL-1010.
Naarmate het aantal groepen dat de rol van B-cellen in het naïeve en gewonde hart onderzoekt, groeit, wordt het steeds belangrijker om gedeelde protocollen te definiëren om myocardiale B-cellen goed te kwantificeren en te beoordelen en zo inconsistenties te voorkomen die al in de literatuur zijn begonnen te verschijnen. Tot nu toe zijn B-cellen in feite beide gemeld als een van de meest voorkomende immuuncellen in het knaagdierhart7 en aanwezig te zijn met een duidelijk lagere prevalentie dan myeloïde cellen26,27, of vrij zeldzaam28. Evenzo hebben verschillende groepen beschreven dat het aantal myocardiale B-cellen toeneemt na acuut ischemisch myocardinfarct 7,9,13, maar één groep meldde geen veranderingen in het aantal B-cellen van het gewonde myocard29. Studies op cardiale immuuncellen geven zelden details over perfusieomstandigheden en er is geen consensus over de spijsverteringscondities. Aangezien in het knaagdierhart een groot deel van de B-cellen intravasculair is en de extractie van immuuncellen uit het myocard sterk afhankelijk is van de gebruikte verteringsmethode, kunnen de in de literatuur gemelde verschillen het gevolg zijn van verschillen in orgaanperfusie en weefselvertering.
Hier gepresenteerd is een gedetailleerde methode voor flowcytometrie-gebaseerde kwantificering van murine myocardiale B-cellen die de opbrengst van B-celherstel maximaliseert door perfusie- en spijsverteringscondities te optimaliseren en de discriminatie van intravasculaire versus extravasculaire myocardiale B-cellenmogelijk maakt 6. Dit protocol is een aanpassing en optimalisatie van andere vergelijkbare protocollen die onderscheid maken tussen intravasculaire en interstitiële immuuncellen 28,30,31.
In dit protocol standaardiseren we myocardiale perfusie om B-cellen die in de intravasculaire ruimte zweven te elimineren zonder biologisch relevante B-cellen te verwijderen die aan het microvasculaire endotheel zijn gehecht. Bovendien, voortbouwend op eerdere protocollen die het gebruik van intraveneuze injectie van antilichamen hebben beschreven om intravasculaire van interstitiële immuuncellen te onderscheiden32, en gebruikmakend van het feit dat B-cellen de oppervlaktemarker B22033 tot expressie brengen, demonstreren we hoe intravasculaire versus extravasculaire myocardiale B-cellen kunnen worden onderscheiden door intravasculaire injectie van een B220-specifiek antilichaam onmiddellijk vóór het dierenoffer en de hartperfusie. Dit protocol is relevant voor het onderzoek van elke wetenschapper die geïnteresseerd is in het opnemen van de analyse van myocardiale B-cellen in het naïeve en gewonde hart. De wijdverspreide implementatie van dit protocol zal inconsistenties tussen onderzoeksgroepen verminderen, zal de analyse van veranderingen in de intravasculaire en extravasculaire myocardiale B-celpools mogelijk maken en zo de vooruitgang van ontdekkingen op het gebied van cardiale immunologie ondersteunen.
Samenvattend vertegenwoordigt het protocol een geoptimaliseerde workflow om myocardiale B-cellen te kwantificeren en te analyseren via flowcytometrie, en tegelijkertijd onderscheid te maken tussen cellen in de extravasculaire ruimte en de intravasculaire ruimte.

```html
<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody</td><td>101222</td><td>BioLegend</td><td>100 &micro;g 200 &micro;L</td></tr><tr><td>(CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 &micro;m, Blue</td><td>QBIAP303</td><td>Southern Labware</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube</td><td>1605-0000</td><td>SealRite, USA Scientific</td><td></td></tr><tr><td>0.9% Sodium Chloride Injection, USP</td><td>114-055-101</td><td>Quality Biological</td><td>0.90%</td></tr><tr><td>1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube</td><td>1615-5500</td><td>SealRite, USA Scientific</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro;L Graduated TipOne Filter Tips</td><td>11213810</td><td>USA Scientific</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro;L Graduated TipOne Filter Tips</td><td>11267810</td><td>USA Scientific</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free</td><td>430052</td><td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>1-Way Stop Valve, Polycarbonate</td><td>SVPT951</td><td>ECT Manufacturing</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2-Tribromoethanol</td><td>T48402</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro;L Graduated TipOne Filter Tips</td><td>11208810</td><td>USA Scientific</td><td></td></tr><tr><td>3-Way Stop Valve, Polycarbonate</td><td>SVPT953</td><td>ECT Manufacturing</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style</td><td>352054</td><td>Falcon, a Corning Brand</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free</td><td>430290</td><td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer</td><td>118-156-101</td><td>Quality Biological</td><td>Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20</td></tr><tr><td>Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63</td><td>5810759005</td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62</td><td>22638289</td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 &ndash; 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62</td><td>22638246</td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum Foil 12 in x 75' Roll.0007</td><td>UPC 109153</td><td>Reynolds Wrap</td><td></td></tr><tr><td>Anesthesia Induction Chamber - Mouse</td><td>RWD-AICMV-100</td><td>Conduct Science</td><td></td></tr><tr><td>BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL</td><td>309626</td><td>BD Becton, Dickinson and Company</td><td></td></tr><tr><td>Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2" 100-Pack</td><td>CMD 2613</td><td>Brandzig</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody</td><td>115537</td><td>BioLegend</td><td>50 &micro;g/mL</td></tr><tr><td>CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 &micro;m, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile</td><td>T9009</td><td>Southern Labware</td><td></td></tr><tr><td>Carbon Dioxide USP E CGA 940</td><td>CD USPE</td><td>AirGas USA</td><td></td></tr><tr><td>Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL</td><td>UX-34502-46</td><td>Cole-Parmer</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase 2</td><td>LS004176</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Connector brass chrome plated 1/4" female NPT x 1/4" barb</td><td>Y992611-AG</td><td>AirGas USA</td><td></td></tr><tr><td>Cytek Aurora Flow Cytometer</td><td></td><td>Cytek Biosciences</td><td></td></tr><tr><td>Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP</td><td>M-08-12</td><td>AirGas USA</td><td></td></tr><tr><td>DNase I - 40,000 U</td><td>D4527</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Easypet 3 - Electronic Pipette Controller</td><td>4430000018</td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>Electronic Balance, AX223/E</td><td>30100606</td><td>Ohaus Corp.</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5810R centrifuge</td><td>5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes</td><td></td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 10.8.1</td><td></td><td>BD Becton, Dickinson and Company</td><td></td></tr><tr><td>GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100)</td><td>Z740287</td><td>Heathrow Scientific</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (1x) - Ca2+ [+] Mg2+ [+]</td><td>14025076</td><td>gibco</td><td>1x</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>H3506</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Kelly Hemostats, Straight</td><td>13018-14</td><td>Fine Science Tools</td><td></td></tr><tr><td>Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL</td><td>302831</td><td>BD Becton, Dickinson and Company</td><td></td></tr><tr><td>M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940</td><td>M1-940-PG</td><td>AirGas USA</td><td></td></tr><tr><td>McKesson Underpads, Moderate</td><td>4033-CS150</td><td>McKesson</td><td></td></tr><tr><td>Navigator Multi-Purpose Portable Balance</td><td>NV2201</td><td>Ohaus Corp.</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-]</td><td>10010023</td><td>gibco</td><td>1x</td></tr><tr><td>PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody</td><td>103208</td><td>BioLegend</td><td>200 &micro;g/mL</td></tr><tr><td>PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody</td><td>103132</td><td>BioLegend</td><td>100 &micro;g 500 uL</td></tr><tr><td>Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene</td><td>FB0875711YZ</td><td>Fisher Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02</td><td>M08-1</td><td>AirGas USA</td><td></td></tr><tr><td>Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator</td><td>LED-6W</td><td>AmScope</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm)</td><td>305122</td><td>BD Becton, Dickinson and Company</td><td></td></tr><tr><td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO)</td><td>553141</td><td>BD Becton, Dickinson and Company Biosciences</td><td>0.5 mg/mL</td></tr><tr><td>R 4.1.1</td><td></td><td>The R Foundation</td><td></td></tr><tr><td>Razor Blades</td><td>95012500

flowcytometrie-gebaseerde kwantificering en analyse van myocardiale b-cellen

Flow Cytometry-Based Quantification and Analysis of Myocardial B-Cells

Een groeiend aantal bewijzen toont aan dat B-lymfocyten een belangrijke rol spelen in de context van myocardiale fysiologie en myocardiale aanpassing aan letsel. De literatuur rapporteert echter contrasterende gegevens over de prevalentie van myocardiale B-cellen. Van B-cellen is gemeld dat ze zowel tot de meest voorkomende immuuncellen in het knaagdierhart behoren als aanwezig zijn, maar met een aanzienlijk lagere prevalentie dan myeloïde cellen, of vrij zeldzaam zijn. Evenzo hebben verschillende groepen beschreven dat het aantal myocardiale B-cellen toeneemt na acuut ischemisch myocardinfarct, maar één groep meldde geen veranderingen in het aantal B-cellen van het gewonde myocardium. Implementatie van een gedeelde, reproduceerbare methode om de prevalentie van myocardiale B-cellen te beoordelen, is van cruciaal belang om waarnemingen van verschillende onderzoeksgroepen te harmoniseren en zo de voortgang van de studie van B-cel myocardiale interacties te bevorderen. Op basis van onze ervaring komen de schijnbaar contrasterende waarnemingen die in de literatuur worden gerapporteerd waarschijnlijk voort uit het feit dat muizenmyocardiale B-cellen meestal intravasculair zijn en verbonden met het microvasculaire endotheel. Daarom is het aantal B-cellen dat wordt teruggewonnen uit een muizenhart buitengewoon gevoelig voor de perfusieomstandigheden die worden gebruikt om het orgaan te reinigen en voor de gebruikte verteringsmethode. Hier rapporteren we een geoptimaliseerd protocol dat op een specifieke manier rekening houdt met deze twee kritieke variabelen. Dit protocol maakt reproduceerbare, op flowcytometrie gebaseerde analyse van het aantal muizenmyocardiale B-cellen mogelijk en stelt onderzoekers in staat om extravasculaire versus intravasculaire myocardiale B-cellen te onderscheiden.

Zodra de acquisitie is voltooid en alle gebeurtenissen zijn verzameld, moeten de gegevens worden geanalyseerd volgens de standaard flowcytometriepraktijk. De focus van de analyse zal variëren afhankelijk van het individuele doel van elk experiment. In dit geval werd kwantificering van intravasculaire en extravasculaire B-cellen nagestreefd en werd deze uitgedrukt als het aantal cellen per mg weefsel.
Bij gebruik van een spectrale cytometer wordt aanbevolen om de analyse te starten met een eers...

Hier rapporteren we een protocol voor de kwantificering en differentiatie van myocardiale B-lymfocyten op basis van hun locatie in de intravasculaire of endotheelruimte met behulp van flowcytometrie.

FlowCytometrie-gebaseerde kwantificering en analyse van myocardiale B-cellen

A growing body of evidence shows that B-lymphocytes play an important role in the context of myocardial physiology and myocardial adaptation to injury. ...

De literatuur rapporteert contrasterende gegevens over de prevalentie van myocardiale B-cellen. Dit komt waarschijnlijk voort uit variabiliteit in perfusie- en verteringstechnieken. Ons protocol maakt reproduceerbare flowcytometrie-gebaseerde analyse op myocardiale B-cellen mogelijk.Deze techniek maximaliseert de herstelopbrengst van B-cellen en vermindert de variabiliteit in flowcytometrietellingen tussen B-cellen en andere populaties uit hartmonsters. Deze geoptimaliseerde verterings- en isolatiemethode kan eenvoudig worden aangepast om een uitgebreid antilichaampanel te implementeren om verschillende immuunceltypen in het hart te bestuderen. Het protocol kan ook worden toegepast op andere organen, zoals longen of lever, om B-cellen te bestuderen die geassocieerd zijn met die organen.Om te beginnen, weeg een 12 weken oude mannelijke muis. Laad een insulinespuit van 310 cc met 100 microliter van de B220-antilichaamoplossing. Injecteer het verdunde B220-antilichaam door retro-orbitale injectie en ga onmiddellijk over tot orgaanoogst en perfusie.Houd na euthanasie de huid van de muis met een tang op het epigastrische gebied. Maak een opening van twee millimeter in de huid met een schaar en gebruik de tang om de huid weg te pellen om de fascialaag te onthullen. Snijd bij de overbuikheid door de fascia en het buikvlies.Klem het xiphoid-proces met behulp van een hemostatische tang. Maak een verticale snede door de borstwand ter hoogte van de midclaviculaire lijn aan elke kant en til de voorste borstwand op om de mediastinuminhoud te onthullen. Houd de aorta stevig van achteren vast met behulp van een tang.Breng de naald van de spuit in de top van het hart. Doordrenkt met drie milliliter HBSS met een snelheid van drie milliliter per minuut. Snijd de aorta en verwijder het hart.Was het hart in de petrischaal met HBSS. Weeg het geïsoleerde hart en noteer het gewicht in milligrammen. Gehakt het hart op kamertemperatuur in kleine stukjes met een mes.De hartstukken moeten ongeveer 1,5 millimeter groot zijn. Meet de massa van het hartweefsel met behulp van een balans en plaats 60 milligram van het gehakte hart dat moet worden verteerd in een buis van 15 milliliter op ijs met drie milliliter HBSS. Herhaal dit proces voor een muis die de B220-antilichaaminjectie niet heeft ontvangen en plaats deze in de buis met drie milliliter HBSS-gelabeld referentiecontroleweefsel.Voeg enzymen toe aan elke buis die gehakte weefsels bevat. Voeg 0,5 microliter per milligram DNase I, één 0,5 microliter per milligram collagenase II en 0,2 microliter per milligram hyaluronidase toe. Plaats de verteringsreactie gedurende 30 minuten in de shaker met 300 omwentelingen per minuut.Buizen worden in de shaker geplaatst onder een kleine hoek, ongeveer 25 graden helling. Voeg zeven milliliter HBSS toe aan elk van de 15-milliliter reactiebuizen en centrifugeer bij 250 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Na het decanteren van het supernatant, resuspenseer elke pellet in vijf milliliter ACK lysis buffer.Incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Nadat u 10 milliliter PBS aan elke buis hebt toegevoegd, mengt en filtert u in een buis van 50 milliliter met een zeef van 40 micrometer. Sla alle vuil op het filter kapot met een spuitzuiger om ervoor te zorgen dat al het materiaal door het filter gaat.Nadat u PBS door het filter hebt toegevoegd totdat het volume 25 milliliter per hart bereikt, voegt u nog eens 25 milliliter PBS toe aan de referentiecontroleweefselbuis en verdeelt u het volume in twee verschillende buizen. Label een van de buizen ongebrand en de andere levend / dood. Na centrifugeren bij 250 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius, decanteert u het supernatant en resuspenseert u de niet-gekleurde buis in 100 microliter PBS en elk van de andere pellets in 100 microliter van de levende / dode vlekoplossing.Incubeer op ijs gedurende 30 minuten in het donker. Nadat u 500 microliter FACS-buffer aan elk monster hebt toegevoegd, brengt u het over in een FACS-buis door een filter van 40 micrometer. Na het weigeren van de FACS-buizen bij 250 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en het weggooien van het supernatant, resuspendeert u de pellet in 500 microliter FACS-buffer.Voeg 50 microliter FC-blokkerende oplossing toe aan elke buis, behalve de niet-gekleurde en levende / dode buizen. Meng en incubeer gedurende vijf minuten. Na het toevoegen van 50 microliter antilichaammixoplossing aan elke buis, behalve de niet-gekleurde en levende / dode buizen, incubeer gedurende 30 minuten in het donker en bedek de ijsemmer met aluminiumfolie.Net als bij de levende/dode vlek, opnieuw wassen met 500 microliter FACS-buffer en resuspender in 300 tot 500 microliter FACS-buffer. Open de instrumentbesturingssoftware. Selecteer bovenaan het venster het tabblad Acquisitie en klik op Nieuw.Typ in het bibliotheekgedeelte in het veld Type om te filteren PE, PerCP-Cy5.5, brilliant violet 421, Alexa Fluor 700 en Zombie Aqua, selecteer de fluoro-4 en klik op Toevoegen nadat u ze hebt getypt. Klik vervolgens op Volgende om door te gaan naar het tabblad Groepen. Klik nu op het symbool met een buis om het hart toe te voegen voor de analyse.Klik op de referentiegroep en er verschijnt een venster. Selecteer in de kolom fluorescerende tags Zombie Aqua als de fluorescerende tag en verwijder alle andere door op het rode prullenbakpictogram naast elk te klikken. Selecteer vervolgens in het pictogram Besturingstype de optie Cellen.Klik vervolgens op Opslaan. Klik op Volgende. Klik vervolgens op het tabblad Markeringen.Er wordt een tabel weergegeven. Typ de bijbehorende celmarkering in de eerste rij van elke fluoro-4-kolom en druk op Enter. Klik tweemaal op Volgende om naar het tabblad Acquisitie te gaan.Typ 10 miljoen in Gebeurtenissen om de experimentele monsters vast te leggen en typ 200, 000 in hetzelfde veld voor de referentiegroepregel. Klik op Opslaan en openen. Klik linksonder op Instrument Control.Stel de spanning in op FSC 50, SSC 175, SSC-B 175. Selecteer het acquisitiebesturingselement. Voor de debietoptie selecteert u Hoog in het vervolgkeuzemenu.Vortex de onbevlekte hartbuis en plaats deze stevig op de injectiepoort van het monster. Zorg ervoor dat de groene indicatorpijl naar het juiste voorbeeld wijst. Klik vervolgens op Opnemen en wacht tot de gebeurtenissen zijn opgenomen.Doe hetzelfde voor het levend/dood gekleurd hartweefsel. Selecteer het menu Onmengingen en stel de besturingselementen in. Schakel het selectievakje autofluorescentie als fluorescentietag in.Klik vervolgens op Volgende om door te gaan naar het tabblad Positieve/negatieve populaties identificeren. Op dit tabblad wordt een plot van voorwaarts spreidingsgebied versus zijspreidingsgebied weergegeven. Klik en sleep de punten van de veelhoek om een gebied tussen 1 en 4 miljoen op de as van het voorwaartse spreidingsgebied en tussen 0,2 en 3 miljoen op de as van het spreidingsgebied aan de zijkant te selecteren.In de volgende plot aan de rechterkant wordt V5-A weergegeven op de X-as. Verplaats de poorten om de helft van de piek uiterst rechts als positief te selecteren en een gebied aan de linkerkant van het plot als negatief. Selecteer in de plot met de titel Reference Group-Unstained een populatie in een vergelijkbaar bereik.Voor de niet-bevlekte hoeft geen positief/negatief te worden geselecteerd. Klik op de knop Live unmixing. Verkrijg nu de experimentele monsters, vortex de buis en plaats deze veilig op de SIP.Zorg ervoor dat de groene indicatorpijl naar het juiste voorbeeld wijst. Klik vervolgens op Record in het deelvenster Acquisitiecontrole van de cytometersoftware en wacht tot de gebeurtenissen zijn vastgelegd. Selecteer het tabblad Standaard niet-gemengd werkblad.Maak een FCS-A versus SSC-A plot met behulp van de dot plot tool bovenaan. Selecteer gebeurtenissen hoger dan 0,4 miljoen op de FSC-A-as en hoger dan 0,8 miljoen op de SSC-A-as met behulp van het gereedschap polygoonselectie. Maak een nieuwe plot door te dubbelklikken op de selectie en klik in deze nieuwe plot met de rechtermuisknop op het Y-aslabel en selecteer live / dode vlek.Klik met de rechtermuisknop op het X-aslabel en selecteer Autofluorescentie A.Selecteer alle gebeurtenissen onder 10 tot de vijfde op de live / dode-as. Dit zijn de levende cellen. Dubbelklik in deze selectie.Selecteer in de nieuwe plot PerCP-Cy5.5A voor de X-as en SSC-A voor de Y-as. Selecteer de populaties aan de rechterkant van de PerCP-Cy5.5A. Dit zijn de immuuncellen.Dubbelklik op de selectie. Selecteer op het nieuwe perceel FSC-A voor de X-as en voorwaartse spreidingshoogte voor de Y-as. Selecteer de gebeurtenissen die een trend volgen waarin de FSC-A-waarde en SSC-A-waarde hetzelfde zijn.Dit selecteert enkele cellen en elimineert doubletten. Dubbelklik op deze selectie om een nieuwe plot weer te geven in de CD45-positieve eencellige populatie. Selecteer uit de CD45-positieve eencellige populatieplot briljant violet 421 op de X-as versus SSC-A op de Y-as.Selecteer de populatie rechts op de schitterende violette 421-as. Dit is de B-celpopulatie. Dubbelklik twee keer in deze populatie om twee nieuwe percelen te maken met de B-celpopulatie.Zet de eerste B-celplot op met PEA op de X-as en briljant violet 421A op de Y-as. De populatie rechts komt overeen met de intervasculaire B-cellen en de populatie links vertegenwoordigt de interstitiële B-cellen. Selecteer beide.Stel de tweede B-celplot in met Alexa Fluor 700A op de X-as en SSC-A op de Y-as. De populatie aan de linkerkant komt overeen met de CD11b-negatieve cellen en de gebeurtenissen aan de rechterkant komen overeen met de CD11b-positieve cellen. Klik met de rechtermuisknop op elke sectie en klik vervolgens op Gate-eigenschappen.Klik op Aantal en ouder om het aantal gebeurtenissen en percentages van de bovenliggende populaties weer te geven. Noteer het aantal gebeurtenissen en percentages voor verdere gegevensanalyse. Na het verwijderen van doubletten in een naïef ongewond hart, wordt verwacht dat ongeveer 20% van de CD45-positieve cellen CD19-positieve B-cellen zullen zijn.Van deze cellen bevindt zich gemiddeld 5,5% in de interstitiële ruimte. 94,5% bevindt zich in de intravasculaire ruimte. Van de hele B-celpopulatie in het hart komt slechts ongeveer 1,6% overeen met B1-cellen op basis van de oppervlaktemarker CD11b en de andere 98,4% komt overeen met B2-cellen.Bij het analyseren van myocardiale B-cellen via flowcytometrie is het cruciaal om het hart goed te doordringen en te hakken volgens het protocol. Een goede filtratie van het verteerde hart is ook essentieel om het herstel van immuuncellen te maximaliseren.

flow-cytometry-based-quantification-and-analysis-of-myocardial-b-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Het IP-FCM methode is gepresenteerd, die een gevoelige, robuust, biochemische evaluatie van de natieve eiwit-eiwit interacties mogelijk maakt, zonder dat genetische manipulatie of grote steekproeven.

IP-FCM: Immunoprecipitatie gedetecteerd door middel van flowcytometrie

This video demonstrates a flow cytometry-based technique using two fluorochromes to identify CD4+ and CD8+ T cells, γδ T cells, B cells, natural killer (NK) cells, and monocytes in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). Upon incubating the cells with fluorochrome-conjugated antibodies against the surface markers, the cell subsets are identified using an optimal flow cytometric gating strategy.

A Flow Cytometry Assay to Identify Immune Cell Subsets in Peripheral Blood Mononuclear Cells

This video illustrates the reconstitution of synthetic antigen-presenting cells through Bead-Supported Lipid Bilayers and their application in assessing the synaptic output generated by activated T cells.

Utilizing Bead-Supported Lipid Bilayers to Investigate the Synaptic Output from T Cells

Dit artikel beschrijft spectrale cytometry, een nieuwe benadering flowcytometrie dat de vormen van emissiespectra gebruikt om fluorochromen onderscheiden. Een algoritme vervangt vergoedingen en kan de behandeling van auto-fluorescentie als een onafhankelijke parameter. Deze nieuwe aanpak maakt het mogelijk voor een juiste analyse van de cellen geïsoleerd van vaste organen.

Analyse van celsuspensies Geïsoleerd van vaste weefsels door Spectral flowcytometrie

De MDS-diagnose is moeilijk in de afwezigheid van morfologische criteria of niet-informatieve cytogenetica. MFC kan helpen verfijnen van het diagnostisch proces van MDS. Om te worden nuttig zijn voor de klinische praktijk, de MFC analyse moet worden gebaseerd op parameters met voldoende gevoeligheid en specificiteit en gegevens moeten worden gereproduceerd tussen verschillende exploitanten.

Database-geleide Flow-cytometry voor evaluatie van het beenmerg myeloïde cel rijping

Dit protocol biedt een eenvoudige en efficiënte methode om te isoleren, te identificeren en te kwantificeren van immune cellen die woonachtig zijn in het myocardium van muizen tijdens steady-state of ontsteking. Het protocol combineert enzymatische en mechanische spijsvertering voor het genereren van een enkel celsuspensie die verder kan worden geanalyseerd door stroom cytometry.

Isolatie en identificatie van Extravascular immuuncellen van het hart

Dit artikel illustreert een krachtige methode om te kwantificeren mitochondriën of lysosomen in levende cellen. De combinatie van lysosoom - of mitochondriën-specifieke kleurstoffen met fluorescently geconjugeerde antilichamen tegen oppervlakte markeringen zorgt ervoor dat de kwantificering van deze organellen in gemengde cel populaties, zoals primaire cellen geoogst van weefselmonsters, met behulp van Multicolor stroom cytometry.

Multicolor Stroom Cytometry gebaseerde kwantificering van Mitochondria en lysosomen in T cellen

Hier presenteren we een protocol voor het verwerken van vers beenmerg (BM) geïsoleerd van muis of mens voor High-dimensionale massa Cytometry (Cytometry door time-of-Flight, CyTOF) analyse van neutrofiele-Lineage cellen.

Voorbereiding van het hele beenmerg voor massa Cytometry analyse van neutrofiele-Lineage cellen

We beschrijven hierin een eenvoudige analyse van de heterogeniteit van het muriene immuun B-celcompartiment in het peritoneum, milt en beenmergweefsel door middel van flowcytometrie. Het protocol kan worden aangepast en uitgebreid naar andere muizenweefsels.

Flowcytometrische karakterisering van de ontwikkeling van murine B-cellen

Isolatie van cellen uit ontlede implantaten en hun karakterisering door middel van flowcytometrie kan aanzienlijk bijdragen aan het begrijpen van het patroon van immuunrespons tegen implantaten. Dit artikel beschrijft een nauwkeurige methode voor de isolatie van cellen uit ontlede implantaten en hun kleuring voor flowcytometrische analyse.

Flowcytometrie met hoge dimensionaliteit voor analyse van de immuunfunctie van ontlede implantaatweefsels

Leer een geoptimaliseerde flowcytometrie-methode voor kwantificering van myocardiale B-cellen in muizenhartweefsel. Dit protocol maximaliseert de opbrengst en minimaliseert variabiliteit in celanalyse.

FlowCytometrie-gebaseerde kwantificering en analyse van myocardiale B-cellen

Meer video's verkennen