Laser-geïnduceerde actiepotentiaal-achtige metingen van cardiomyocyten op micro-elektrode arrays voor verhoogde voorspelbaarheid van veiligheidsfarmacologie

Deze methode maakt het mogelijk om intracellulaire actiepotentialen op traditionele MEA's te registreren, waardoor een betere beschrijving van de AP-vorm en een gevoeligere classificatie van pro-aritmische potentialen mogelijk is. In vergelijking met typische veldpotentiaalregistraties biedt de intracellulaire werkelijke potentiaalvorm meer inzicht in de precieze autorisatie van de onderliggende ionkanalen. Wanneer toegepast op cardiomyocyten afgeleid van klinische patiënten via stamceltechnologie, kan de methode bijdragen aan causale diagnose en personalisatie van C R P en hartaandoeningen zoals aritmieën Onze technicus, Karin Gebhardt, zal de cardiomyocytenteelt demonstreren.

Om te beginnen met het coaten van de elektrodevelden van de eerder geautoclaveerde MEA's, dropwise met fibronectine met behulp van een 10 microliter pipet onder de laminaire stromingskap. Om de osmotische schok te verminderen, brengt u de platingoplossing gedurende 90 seconden druppelsgewijs over in de buis van 50 milliliter die thawd cardiomyocyten bevat. Voeg voorzichtig acht milliliter platingmedium toe aan de buis en meng de celsuspensie voorzichtig.

Verwijder met een pipet van 10 milliliter het supernatant, zorg ervoor dat u de pellet niet weggooit en pas het celnummer aan de uiteindelijke concentratie aan. Verwijder vóór het plaatsen van de cel de aangebrachte coatingoplossing uit het MEA-elektrodegebied met behulp van een pipet van 10 microliter. Om uitdroging van het coatingzaad te voorkomen, de cellen onmiddellijk door vier microliter van de cellen druppelsgewijs op de elektrodevelden toe te voegen voor beide, zes put MEA en één put M E A.Laat de cellen nu een uur aan de putten hechten bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.

Voeg onder de laminaire stromingskap 200 microliter en een milliliter steriel platingmedium toe, verwarmd tot 37 graden Celsius voor respectievelijk zes Well MEA en single well MEA. Voor MEA-opnames plaatst u het MEA-systeem bovenop het apparaat met de MEA-chiphouder gecentreerd over het doelgat. Laat de laser vervolgens scherpstellen op de elektroden door de MEA-opstelling te positioneren, zodat het doel zich direct onder het gat van het MEA-systeem bevindt.

Om de cellen te laten herstellen van de mechanische verstoring, brengt u de MEA-chip met de gekweekte cellen 15 minuten voor de opname over van de incubator naar de MEA-opstelling. Reinig vervolgens de contactpads en pinnen zorgvuldig, met behulp van een isopropanol-wattenstaafje om de geluidsniveaus te verlagen. Plaats de MEA voorzichtig in de MEA-opstelling en plaats de MEA-chip met zes putten met het serienummer zichtbaar aan de rechterkant of een mea-chip met één put met de referentie-elektrode aan de linkerkant.

Stel nu het MEA-systeem geïntegreerde verwarming in op 38 graden Celsius. Sluit het deksel van het apparaat omdat de geïntegreerde veiligheidsschakelaar alleen toestaat dat de laser wordt geactiveerd als het deksel over de MEA-chip is gesloten. Met behulp van het MEA-configuratieprogramma stelt u het high pass- en low-pass MEA-systeemfilter in op respectievelijk 0,1 hertz of minder en 3.500 hertz.

Gebruik de MC-racksoftware of alternatieve software voor opname. Pas het invoerbereik aan volgens het experiment. Ervoor zorgen dat het signaal de versterker en de bemonsteringsfrequentie niet verzadigt.

Gebruik de langetermijnweergavefunctie van de software om de opname te controleren. Na het plaatsen van de MEA-chip in de MEA-installatie en het instellen van de software initialiseert u de lasermechanica met behulp van de FB ALP-software. Klik nu op de initialisatieknop.

Aan het einde van de initialisatie bevindt het virtuele laserpunt zich in put D voor een mea met zes putten en linksonder voor een enkele put MEA. Verplaats vervolgens met behulp van de bedieningstoets met een muisklik het virtuele laserpunt naar het midden van de D vijf-elektrode en pas de focus aan door de bedieningstoets ingedrukt te houden en met het muiswiel te scrollen. U kunt ook de autofocusfunctie gebruiken.

Druk op de knop P één en het virtuele laserpunt gaat automatisch naar de put F.Het systeem is nu uitgelijnd. Pas het laservermogen en de procestijd aan volgens de experimentele vereisten. Om de laser in te schakelen, klikt u op de laser uit-knop die verschijnt als laser aan, Schakel over naar de opnamesoftware.

Kies een bestandsnaam en klik op de rode opnameknop gevolgd door de afspeelknop bovenaan het venster om de meting op te nemen. Voordat u de cellen met de laser opent, registreert u een basislijn gedurende 60 seconden. Schakel terug naar de initialisatiesoftware en deactiveer elektroden die door de laser op de virtuele kaart aan de rechterkant van het softwarevenster moeten worden uitgesloten.

Om de laser te starten, klikt u met de Alt-muis en selecteert u de middelste elektrode van dit putje. Dit initieert de laser om de cellen op elke elektrode van deze put automatisch te openen, herhaal voor elke put om alle eerder geactiveerde elektroden van deze geselecteerde put te openen. Los millimolaire concentratie van Nifedipine E-40 31 en Dofetilide eerst op in DMSO en vervolgens in volledig medium tot 10 keer de gewenste concentratie.

Overschrijd nooit een uiteindelijke DMSO-concentratie van 0,1% in de put. Noteer de basislijnactiviteit gedurende 60 seconden. Start de laser geïnduceerde peratie zoals eerder gedemonstreerd, wat resulteert in een transformatie van de FPS in liAP's.

Breng alle medicijnen aan als enkele concentratie per put. Verwijder respectievelijk 20 microliter en 100 microliter medium per put uit zes put- en enkele put-MEA's. Voeg 20 microliter of 100 microliter van de te meten geneesmiddeloplossing toe aan de put.

Afhankelijk van het MEA-type, en voorzichtig twee tot drie keer op en neer pipetteren. Laat de verbindingen 300 seconden inspoelen. Gedurende deze tijd kan de liAP-vorm transformeren in de FP-vorm.

Nogmaals, geïnduceerde laser geïnduceerde peratie en registreer mogelijke samengestelde defecten op de liAP gedurende nog eens 60 seconden. De toevoeging van nifedipine verminderde de plateaufase van de liAP's op een concentratieafhankelijke manier en verkortte daardoor de gehele liAP. Deze verkorting was vergelijkbaar met de veldpotentialen van cardiomyocyten uit ongemanipuleerde elektroden.

E-40 31 remde de repolarisatie van relevante KV één punt 11 kaliumkanalen en leidde tot het aritmische gedrag van cardiomyocyten bij verhoogde concentraties. Ook verhoogde E-40 31 de liAP-duur op een concentratieafhankelijke manier. Aan het einde van de liAP werden kleine positieve spanningsafbuigingen waargenomen bij 0,1 micromolaire die prominenter werden met hogere concentraties, wat wijst op een voorbijgaande nieuwe depolarisatie genaamd EAD's.

Bij de hoogste concentratie van 0,1 micromolair escaleerden deze EAD's in de loop van de tijd in ectopische beats. Dat zijn voorbarige actiepotentialen. EAD en ectopische beats zijn belangrijke indicatoren van pro-aritmische activiteit.

En uiteindelijk resulteert de elektrische activiteit in aritmisch kloppen. De concentratieresponsrelaties correleerden met FP's en liAP-opnames. Verder, in aanwezigheid van dofetilide, vertoonden zowel FP als liAP duur van ongeveer twee seconden binnen dezelfde put, de FP-golfvorm presenteerde regelmatige repolarisatie-afbuigingen.

Terwijl in de liAP EAD's zijn detecteerbaar. Het is belangrijk om de focus voor elke melomen aan te passen, omdat een onscherp microscoopbeeld de opening van de cellen kan beïnvloeden. Ook moet actiepotentiaal kort na opterperatie worden gebruikt voor analyse.

Deze techniek is gevoeliger in het detecteren van eerdere aritmische effecten in vergelijking met standaard MEA, waardoor de detectie van nadelige samengestelde effecten nauwkeuriger kan worden bepaald.