Genotypering van enkelvoudige nucleotidepolymorfismen in het mitochondriale genoom door pyrosequencing

Pyrosequencing is een sequencing door synthesetechniek die kan worden gebruikt om single nucleotide polymorfismen in mitochondriaal DNA te genotyperen. Deze methode is voordelig in zijn gemak van implementatie en kosteneffectiviteit in vergelijking met andere sequencingmethoden. Het kan gemakkelijk worden gebruikt als een diagnostische methode voor bepaalde mitochondriale ziekten door het bepalen van heteroplasmiewaarden van pathogene varianten in mitochondriaal DNA.

Verkrijg om te beginnen een mitochondriaal DNA-sequentiebestand voor de soort die wordt gegenotypeerd en identificeer de positie van het single nucleotide polymorfisme of SNP. Zorg ervoor dat de gebruikte referentiesequentie de juiste basisnummering voor de bestudeerde mutatie gebruikt, zodat de positie van de SNP gemakkelijk kan worden geïdentificeerd. Kopieer 1.000 basenparen stroomopwaarts en stroomafwaarts van de SNP-site en plak de afgekapte reeks in de pyrosequencing primer-ontwerpsoftware.

Markeer de polymorfe basis, klik er met de rechtermuisknop op en selecteer vervolgens Doelgebied instellen om de geanalyseerde SNP-basis in te stellen als het doel van de pyrosequencing-test. Druk op het pictogram Afspelen in de rechterbovenhoek van de interface om de primerselectie te starten en wacht tot de software automatisch de primertrio's genereert, twee primers voor voorversterking van het sjabloon-DNA en de derde primer voor sequencing door de synthese in de pyrosequencingmachine. Klik met de rechtermuisknop en selecteer Alle primersets kopiëren om alle primersets te behouden.

Open de run-software die bij de pyrosequencer is geleverd, selecteer Nieuwe test en selecteer vervolgens de sjabloon voor de kwantificeringstest van het allel. Voer de te analyseren sequentie in het overeenkomstige vak in door de nucleotiden direct na de sequencingprimer in te typen. Geef voor de variabele positie de twee mogelijke bases aan, gescheiden door een schuine streep.

Druk op Dispensatievolgorde genereren en laat de software automatisch een geschikte volgorde bepalen voor de nucleotiden die in de sequencing door synthesereactie moeten worden afgegeven. Sla op en geef een naam op voor de test. Voer vervolgens de run uit door het te analyseren DNA te verdunnen tot 5 nanogram per microliter.

Zorg er in de eerste run voor dat u monsters van bekende heteroplasmie als referentie en wild-type monsters opneemt. Voer vervolgens een presequencing PCR uit van 5 microliter verdund DNA en 25 microliterreacties, met behulp van de amplificatieprimers en parameters. Als u de bestandsinstellingen wilt uitvoeren, selecteert u Nieuwe uitvoering in de pyrosequencer-software.

De pyrosequencer kan tegelijkertijd 48 afzonderlijke voorversterkte reacties sequencen met een leeg vierkant dat een enkele sequencingput op een pyrosequencing-schijf vertegenwoordigt. Laad de assays door met de rechtermuisknop op een vierkantje te klikken en Load Assay te selecteren. Indien nodig, sequentieer maximaal vier afzonderlijke assays met verschillende sequencing primers.

Stel de primerdispensatiemodus in op automatisch om automatisch een injectiekamer toe te wijzen voor elke sequencingprimer die voor de run wordt gebruikt. Stel de uitvoeringsmodus in op standaard, tenzij er vier verschillende soorten testen op één sequencingschijf worden uitgevoerd. Zorg ervoor dat het aantal testen in het run-sjabloonbestand overeenkomt met het aantal PCR-reacties dat wordt versterkt.

Sla vervolgens de uitgevoerde bestanden op een USB-station op. Om de pyrosequencer voor te bereiden, drukt u op de reinigingsknop op het hoofdtouchscreen van het apparaat en reinigt u alle injectoren met zeer zuiver water, volgens de instructies op het scherm. Wanneer u de absorberstrip in de machine steekt, moet u ervoor zorgen dat de uiteinden elkaar ontmoeten in de 9 uur-positie.

Nadat u de USB-stick hebt aangesloten, drukt u op de knop Volgorde om de eerder voorbereide uitvoerbestanden te laden. Volg de instructies op het apparaat om de reagentia, indien nodig, in de overeenkomstige injectoren op de machine te laden en te primen. Laad 3 microliter kralen in de putjes en laad vervolgens 10 microliter van elke PCR-reactie die in het overeenkomstige monster moet worden gesequenced.

Pipetteer op en neer om het monster te mengen met de magnetische kralen. Zoek naar de indicatie in de geprimeerde pyrosequencer dat de schijf in de machine kan worden geladen. Schroef de plaatbevestigingsmoer los en lijn de geladen monsterplaat uit met de metalen pen in het schijfcompartiment.

Zodra de plaat stevig in het plaatcompartiment is geschroefd, start u de sequencing-run door op de startknop op de touchscreen-interface te drukken. Zodra de uitvoering is voltooid, verwijdert u het USB-station uit het apparaat en sluit u het weer aan op de computer waarop de pyrosequencer-software wordt uitgevoerd. Nadat het nieuw gegenereerde run-bestand op het USB-station is verschenen, dubbelklikt u op het Run Result-bestand.

Dit analyseert automatisch de luciferase-output van elke put bij nucleotide-opname en kwantificeert het mitochondriale allel van belang. Zoek naar de kleurscores die door de software worden weergegeven op basis van de kwaliteit van de lezingen. Als u de resultaten wilt opslaan, selecteert u Rapporten in het bovenste venster, gevolgd door Volledig rapport om een PDF-bestand te genereren met de pyrogrammen en resultaten van elke put van de run.

U kunt de resultaten ook in andere indelingen downloaden op het tabblad Rapporten. Agarose-gel-elektroforese van een PCR-amplificatie met behulp van de amplificatieprimers uit beide sets geselecteerd voor de m. 3243A>G-mutatie zoals weergegeven in deze figuur.

Hier duidt Het op het bijna homoplasmatische m. 3243A>G monster dat moet worden geanalyseerd. Een vergelijking van de prestaties van beide primersets met behulp van molaire standaarden voor kalibratie wordt weergegeven in deze figuur.

De gemeten waarden worden aangegeven door de verticale stippellijnen. Een lineaire functie X=Y wordt weergegeven om te illustreren hoe dicht elk van de twee geteste assays bij een ideale meting ligt. De namen van de cellijnen op de X-as zijn de namen van de verschillende cybride klonen die met behulp van deze test werden gegenotypeerd.

Genotyperingsresultaten op vier cybride klonen van onbekende m. 3243A>G heteroplasmie met behulp van beide assays worden hier getoond. Sequencing werd uitgevoerd in technische drievoud.

Genotyperingsresultaten van mitochondriale zinkvingernuclease-behandelde cellen, samen met onbehandelde en nep-behandelde controles, en de pyrogrammen van twee MEF-celmonster PCR-replicaties die worden gebruikt om de resultaten te genereren, evenals de wild-type genotyperingscontrole worden hier weergegeven. Pyrosequencing kan worden gebruikt als een uitlezing voor gentherapie-experimenten voor het beoordelen van verschillende gentherapietechnologieën in mitochondriaal DNA.