High-throughput cardiotoxiciteitsscreening met behulp van volwassen door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocytenmonolagen

Dit protocol is belangrijk omdat het onderzoekers in staat stelt om commerciële of in-house gemaakte hiPSC-CMs te rijpen tot een volwassen-achtig fenotype dat de voorspellende waarde van hiPSC-CMs bij cardiotoxiciteitsscreening aanzienlijk verbetert. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het volwassen hiPSC-CMs levert in een high throughput-formaat voor optische mapping van calcium- of spanningsverandering. Dit protocol kan worden gebruikt om ziektemechanismen te onderzoeken of om geneesmiddelen te screenen op cardiotoxiciteit.

De procedure wordt gedemonstreerd door Jeffrey Creech, een onderzoeksmedewerker van mijn laboratorium. Begin met het wassen van de rijpingsinducerende extracellulaire matrix, of MECM, platen twee keer met 200 microliter van Hank's gebalanceerde zoutoplossing, of HBSS, 1 uur voorafgaand aan cardiomyocytenplating. Houd de putten gehydrateerd.

Breng de cardiomyocytenbuizen over van de tank met vloeibare stikstof naar droogijs en laat de druk los door de buisdoppen iets te openen. Sluit vervolgens de buisdoppen opnieuw en ontdooi ze gedurende 4 minuten in het waterbad. Na het ontdooien van de cellen, besproei de buizen met 70% ethanol voordat u ze opent.

Breng de cellen over in conische buizen van 15 milliliter met een pipet van 1 milliliter. Voeg 1 milliliter platingmedium toe aan de cryovial en breng de was over in de conische buis van 15 milliliter. Druppel vervolgens langzaam 1 milliliter platingmedium en roer de buis.

Herhaal dit tot de overdracht van 8 milliliter platingmedium. Centrifugeer de buis van 15 milliliter gedurende 5 minuten op 300 x g en resuspensie van de pellet in 1 milliliter van het platingmedium. Verwijder een aliquot en voer live celtelling uit met een hemocytometer voordat u een platingmedium toevoegt om 7,5 x 10 tot de 5e cellen per milliliter te verkrijgen.

Doseer 100 microliter van de celsuspensie per put van een MECM-gecoate 96-putplaat met behulp van een meerkanaalspipet en incuber de cellen gedurende 2 dagen. Vervang vervolgens het medium door 200 microliter onderhoudsmedium en onderhoud de platen gedurende 7 dagen, met een verandering van medium op dag 5. Voer op dag 7 een EP-test uit, zoals beschreven in de tekst.

Zorg ervoor dat u het medium om de dag vervangt wanneer u kiest voor uitbreiding van de celcultuur. Om hiPSC-CM te zuiveren via magnetisch geactiveerde celsortering, of MACS, zuigt u het celkweekmedium op en wast u de cellen met 1 milliliter HBSS-Dissocieer vervolgens de cellen door 1 milliliter 0,25% trypsine-ethyleendiaminetetra-azijnzuur of EDTA toe te voegen en de cellen gedurende 10 minuten te incuberen. Deactiveer vervolgens de trypsine / EDTA door de cellen opnieuw te verzenden en te singulariseren met 2 milliliter platingmedium.

Verzamel de cellen uit de zes putten in een conische buis van 50 milliliter met behulp van een zeef van 70 micrometer. Na het wassen van de zeef met 3 milliliter platingmedium, tel je de cellen. Na het tellen, centrifugeer en was de celpellet met 2 milliliter ijskoude MACS-scheidingsbuffer voordat u pelleteert en de cellen opnieuw verzendt in 80 microliter koude MACS-scheidingsbuffer per 5 x 10 naar de 6e cellen.

Voeg 20 microliter koude niet-cardiomyocytendepletiecocktail toe en meng de suspensie voordat je gedurende 10 minuten op ijs broedt. Na het wassen van de cellen met 4 milliliter koude MACS-scheidingsbuffer op 300 x g gedurende 5 minuten, resuspensie van de pellet in 80 microliter koude MACS-scheidingsbuffer. Voeg 20 microliter koude anti-biotine microbeads per 5 x 10 toe aan de 6e cellen en meng de celsuspensie voorzichtig voordat je gedurende 10 minuten op ijs broedt.

Terwijl de monsters aan het broeden zijn, plaatst u de positieve depletiekolommen die zijn uitgerust met de 30 micrometer voorscheidingsfilters op de MACS-separator en plaatst u de gelabelde 15 milliliter verzamelbuizen onder de kolommen. Vervolgens primeert u elke kolom met 3 milliliter koude MACS-scheidingsbuffer. Meng de met antilichamen behandelde celsuspensie met 2 milliliter MACS-scheidingsbuffer en voeg deze toe aan de kolom.

Voeg 2 milliliter MACS-scheidingsbuffer toe aan elke kolom en verzamel 12 milliliter doorstroomde cardiomyocytensuspensie. Centrifugeer de cardiomyocyten en gooi het supernatant weg voordat u de cardiomyocyten opnieuw in een 1-milliliter platingmedium suspenseert. Om de concentratie te bepalen, telt u de cellen en past u het volume aan de gewenste zaaidichtheid aan voordat u de gezuiverde cardiomyocytencellen op de MECM 96-well-platen plaatst.

Zuig en vervang het onderhoudsmedium voor cardiomyocyten door 100 microliter spanningsgevoelige kleurstoffen, of VSD, of calciumgevoelige fluoroforen, of CSF, per put van een plaat met 96 putten. Vervang na 30 minuten incubatie de kleurstoffen door een testmedium of HBSS. Breng de cellen in evenwicht bij 37 graden Celsius voordat u optische mapping van basisgegevens verkrijgt met behulp van een optisch mappingapparaat met hoge doorvoer.

Om de cellen te behandelen met geneesmiddelen voor acute blootstellingstests of om de cellen in kaart te brengen die chronisch zijn blootgesteld aan geneesmiddelen van belang, verdunt u de geneesmiddelen in dimethylsulfoxide of DMSO en bewaart u ze als voorraadoplossingen bij 20 graden Celsius voordat u ze in HBSS verdunt tot de gewenste concentraties. Voeg voor cardiotoxiciteitstests in 96-putplaten vier doses van een verbinding toe met ten minste acht putjes per dosis. Gebruik doses variërend van onder tot boven de klinisch effectieve therapeutische plasmaconcentratie, inclusief de effectieve dosis.

Vergelijkbaar met de baseline elektrofysiologische metingen vóór toediening van het geneesmiddel, leg elektrofysiologische opnames vast ten minste 30 minuten na medicamenteuze behandeling voor chronische studies. Breng na baseline-opnamen ten minste vier doses van elk medicijn aan op volwassen hiPSC-CMs-monolagen die GCaMP6m tot expressie brengen, met ten minste acht putjes per dosis. Breng de medicijnen op de cellen gedurende 30 minuten in evenwicht en verwarm de cellen tot 37 graden Celsius voor en tijdens de gegevensverzameling.

Voeg na basislijnopnamen van een hele plaat 500 nanomolaire isoproterenol toe aan elke put om robuuste medicijnresponsgegevens mogelijk te maken en de effecten van isoproterenol op monolayer beat rate, contractieamplitude en calciumtransiënte duur te kwantificeren. Om optische kaartgegevens te verkrijgen, opent u de voorste lade en plaatst u de plaat op de plaatverwarming. Nadat u de acquisitiesoftware hebt geopend en de locatie voor het opslaan van bestanden in de software hebt bepaald, selecteert u de duur van 10 tot 30 seconden en de framesnelheid van de acquisitie voor een hogere tijdelijke resolutie en klikt u op Acquisitie starten.

Open de analysesoftware en selecteer op het tabblad Filter importeren de optie Bladeren naar één bestand of Meerdere naast elkaar plaatsen om een plaat te reconstrueren. Selecteer de bestanden, voer een aantal rijen en kolommen in en selecteer Automatisch. Selecteer vervolgens Pixelgrootte bijwerken, voer de afstand per pixel in en gebruik de putwizard om de locatie van de putten in de afbeelding te bepalen voordat u op Opslaan verwerken klikt en naar het volgende tabblad gaat.

Open het tabblad ROI's of Interessegebieden en kies ervoor om de ROI's handmatig, automatisch of helemaal geen ROI's te tekenen, die in aanmerking worden genomen voor de analyse van de hele plaat. Nadat u de regio in het vak hebt geselecteerd, klikt u op de knop Opslaan verwerken om naar de volgende stap te gaan. Vink de vakjes Putten verbergen en Alleen gefilterd weergeven aan om de ROI's te visualiseren.

Open het tabblad Analyse, selecteer elke put of ROI om de nauwkeurigheid van automatische beatdetectie te bevestigen. Voeg beats toe of verwijder beats uit de traceringen door een afzonderlijke beat te selecteren en op Delete op het toetsenbord te drukken. Als u klaar bent, klikt u op Opslaan.

Klik vervolgens op de knop Time-Space Plot op het tabblad Analyse en voeg de regel toe om de tijd-ruimteplot te bepalen om gegevens voor elke put of de ROI te visualiseren. Nadat u een horizontale of verticale lijn hebt geselecteerd, klikt u op Plot genereren. Nadat u de nauwkeurige beatdetectie hebt gecontroleerd, gaat u naar het tabblad Exporteren en selecteert u Bestandsindeling, voert u de optie Beatstatistiek in voordat u op Exporteren klikt.

Eenmaal geëxporteerd, opent u gegevensbestanden en voert u de gekozen statistische analyseroutine uit. Fasecontrastbeeldvorming toonde aan dat de hiPSC-CM's die op de MECM waren geplateerd, volwassen werden en structureel verschilden van dezelfde partij hiPSC-CM's die op de muis-ECU waren gereplateerd. Volwassen cellen werden staafvormig, terwijl onrijpe cellen een cirkelvorm behielden.

Cardiomyocyten gekleurd met alfa-actinine-antilichamen toonden de typische vorm van de cellen gekweekt op elke ECM-aandoening. In overeenstemming met de TnI-kleuring gaf de alfa-actininekleuring aan dat de hiPSC-CM's die op de MECM rijpten een staafvormig volwassen fenotype bevorderden en een grotere sarcoomorganisatie induceerden. Mitochondriale inhoud en activiteit waren verschillend tussen cellen gekweekt op de muis ECM en de MECM.

De elektrofysiologische gegevens voor actiepotentialen geregistreerd met behulp van VSD's en het optische mappingsysteem toonden aan dat de atriale specifieke cellen een significant snellere spontane slagsnelheid en kortere actiepotentiaalduur, of APD80, hebben dan de ventrikelspecifieke cellen. Heatmaps voor de hele plaat voor parameters zoals APD80 onthulden de reproduceerbaarheid van een bepaalde parameter binnen een plaat. Typische actiepotentialen van volwassen hiPSC-CM monolagen gaven de actiepotentiaalmorfologie van geïsoleerde en geteste volwassen cardiomyocyten aan.

Er werd ook een typisch actiepotentiaal spontaan ritme getoond. Als reactie op isoproterenol veroorzaakte activering van de bèta-1-adrenerge receptoren positieve chronotropie, positieve inotropie en positieve lusitropie. HiPSC-CM respons op menselijk Ether-a-go-go-gerelateerd gen, of hERG, kanaalblokker, waaronder E-4031, domperidon, vandetanib en sotalol, werd bestudeerd met behulp van GCaMP6m calciumfluorescentie om het ritme te controleren.

De studie toonde de detectie van vroege na-depolarisaties veroorzaakt door de E-4031 hERG-kanaalblokkade. Werk snel met de cellen in suspensie en vermijd schuifspanning door cellen voorzichtig te pipetteren. Voer bovendien zorgvuldig mediawissels uit om te voorkomen dat de hiPS-syncytie wordt beschadigd.

Na deze procedure zijn cellen vatbaar voor het verzamelen van eiwitten, RNA, DNA en lipiden voor analyse met de favoriete techniek van onderzoekers. De techniek stelt onderzoekers in staat om ziekten te onderzoeken en te testen op cardiotoxiciteit van nieuwe geneesmiddelen met behulp van volwassen cardiomyocyten.