Fluorescentie-geactiveerde kernen negatieve sortering van neuronen gecombineerd met single nuclei RNA-sequencing om de hippocampale neurogene niche te bestuderen

De strategie om neuronen uit te sluiten met behulp van negatieve FACS-sortering genereert hoogwaardige RNA-sequencingsnelheden van celpopulatie met lage abundantie, zoals neurale stamcellen, astrocyten en oligodendrocyten, om hun rol in de modulatie van volwassen hippocampale neurogenese te bestuderen. Met deze methode is het mogelijk om de keuze van antilichamen in de FACS-gating aan te passen, waardoor dit protocol zeer veelzijdig is in het aanpakken van verschillende biologische vragen met betrekking tot de gyrus dentate. Deze methode is voornamelijk ontworpen om de volwassen hippocampus niche te onderzoeken.

Het kan echter gemakkelijk worden aangepast voor het bestuderen van andere stamcelniches. De procedure wordt gedemonstreerd door Sara Ahmed de Prado, postdoctoraal opleidingsmedewerker aan het Francis Crick Institute. Om te beginnen, breng de hersenen ontleed van de geëuthanaseerde muis over in een petrischaaltje van 10 centimeter gevuld met ijskoude PBS.

Plaats vervolgens de petrischaal op ijs en snijd de hersenen in twee helften langs de sagittale as. Verwijder met behulp van een scalpel het cerebellum. Breng de ene helft van de hersenen over naar de nieuwe petrischaal van 10 centimeter die op ijs is geplaatst en ijskoude PBS bevat.

Ontleed de gyrus dentate, of DG, met behulp van een verrekijker en herhaal deze stap om de tweede DG uit de tweede helft van de hersenen te verkrijgen. Breng de twee DG's over in de voorgekoelde Dounce-homogenisator en voeg 1 milliliter koude homogenisatiebuffer of HB toe. Homogeniseer het weefsel met 10 slagen van de losse A-stamper, gevolgd door 15 slagen van de strakke B-stamper. Breng het homogenaat over in een voorgekookte buis van 15 milliliter.

Spoel de Dounce homogenisator af met 1 milliliter koud HB en combineer deze met dezelfde buis. Voeg 3 milliliter HB toe aan de buis van 15 milliliter en incubeer gedurende 5 minuten op ijs. Meng deze kernensuspensie twee keer door de buis voorzichtig om te keren.

Gebruik 0,5 milliliter HB, maak de 70 micrometer zeefdop die over een reageerbuis van 50 milliliter is geplaatst voorvochtig en zeef vervolgens de kernensuspensie voordat de celzeef wordt gewassen met 0,5 milliliter HB. Verwijder vervolgens de celzeef en centrifugeer de reageerbuis in een zwenkbakcentrifuge bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 graden Celsius. Gooi het supernatant weg. Resuspendeer de pellet voorzichtig in 4 milliliter HB met behulp van een P1000-pipet.

Na 5 minuten incubatie op ijs, centrifugeer de suspensie bij 500 x g gedurende 10 minuten, bij 4 graden Celsius. Gooi het supernatant weg en resuspendeer de pellet in 3 milliliter wasmiddel. Gebruik 0,5 milliliter wasmiddel om een zeefdop van 35 micrometer over een reageerbuis van 50 milliliter voor te maken.

Zeef vervolgens de kernensuspensie door 0,5 milliliter suspensie per keer te pipetteren met behulp van een P1000-pipet. Na het wassen van de zeefdop met 0,5 milliliter wasmiddel, plaatst u de buis op ijs. Breng het filtraat over in een nieuwe buis van 15 milliliter en centrifugeer het gedurende 5 minuten en 4 graden Celsius, bij 500 x g.

Gooi het supernatant weg en resuspenseer de pellet in 3 milliliter wasmedia. Herhaal de centrifugatie en resuspendeer de pellet in 1 milliliter wasmedia met de muis anti-NeuN, Alexa Fluor 488-geconjugeerd antilichaam en 1 microgram per milliliter DAPI. Incubeer de reactie gedurende 45 minuten op ijs in het donker.

Voor fluorescentie geactiveerde kernensortering, of FANS, breng de immuno-gekleurde kernsuspensie over naar een reageerbuis van 5 milliliter en plaats deze op ijs tot het begin van de flowcytometrieprocedure. Vortex de monsters gedurende 3 seconden, met milde intensiteit, voordat de buizen in het FACS-instrument worden geplaatst. Om de gegevens van gekleurde kernenophanging te verkrijgen, stelt u de poorten in DAPI-hoogte en het DAPI-gebied in om het celpuin en de geaggregeerde kernen uit te sluiten.

Stel vervolgens de poorten in het log side scatter, of SSC, gebied, en de log forward scatter, of FSC, gebied, om de enkele kernen te scheiden van de resterende DAPI gekleurd aggregaat of cel puin. Isoleer vervolgens de NeuN-AF488-negatieve populatie door de poorten te zetten voor het anti-NeuN-AF488- en FSC-gebied. Sorteer na de analyse de anti-NeuN-AF488 negatieve populatie in een verzamelbuis van 1,5 milliliter gevuld met 50 microliter wasmedia met behulp van de gating-strategie.

Zodra het sorteren is voltooid, voegt u 1 milliliter PBS met 1% runderserumalbumine of BSA toe aan de verzamelbuis om druppels uit de wand van de buis te verzamelen en de buis te centrifugeren bij 500 x g, gedurende 5 minuten, bij 4 graden Celsius. Gooi het supernatant weg en laat 50 microliter opgelost om gecentuiffeerde kernen te resuspenderen. Voeg in een microbuisje van 0,5 milliliter 5 microliter van de kernensuspensie toe aan 5 microliter Trypan-blauw.

Meet de concentratie en beoordeel de levensvatbaarheid van de eencellige suspensie met behulp van een geautomatiseerde celteller voordat de bibliotheekvoorbereiding en sequencing van de kernen wordt uitgevoerd. Bioinformatische clustering onthulde goed gescheiden groepen kernen die overeenkomen met bekende celtypen binnen de DG, met of zonder FANS. Binnen het niet-FACS-gesorteerde monster waren de meeste hoogwaardige gesequencede kernen 84,9% van de neuronen.

Het bestond uit drie groepen neuronen, wat wijst op de mogelijkheid dat de meest representatieve celpopulaties in de gyrus dentate korrelneuronen, andere exciterende neuronen en remmende neuronen zijn. Binnen het niet-FACS-gesorteerde monster waren de geïdentificeerde niet-neuronale clusters meestal gemaakt van 11,1% van de gliaceltypen, waaronder astrocyten, oligodendrocyten en oligodendrocytenvoorlopercellen, 3,3% immuuncellen en 0, 6% Cajal-Retzius-cellen. Tijdens het uitvoeren van FANS om NeuN-positieve populaties uit te sluiten, werden de clusters van gliacellen prominent, met 81,3% van de totale kernen.

Voor de monsters gesequenced bij 50.000 reads per kernen werden 25.010 genen gedetecteerd per kernen voor het niet-FACS-gesorteerde monster, en 1.665.5 genen voor het NeuN-negatieve FANS-monster, wat bevestigt dat hoogwaardige transcriptomische profilering van enkele kernen en FACS-sortering de kernen niet beschadigt voor daaropvolgende snRNA-seq. Het hoge aandeel neuronen in het niet-FACS-gesorteerde monster had een hogere transcriptionele activiteit van 2, 660 genen per kern en 6, 170 transcripten per kern in het niet-FACS-gesorteerde monster dan de niet-neuronale celtypen met een gemiddelde transcriptionele activiteit van 1.090 genen per kern en 1.785 transcripten per kern. Zodra de gegevens met dit protocol zijn gegenereerd, is het de moeite waard om deze nieuwe orthogonale methoden zoals speciale symptomica of in vivo studies te overwegen om eventuele bevindingen te valideren.