Identificatie en isolatie van burst-forming unit en kolonievormende eenheid Erytroïde voorlopers uit muizenweefsel door flowcytometrie

Dit protocol maakt de identificatie en isolatie van BFU-E en CFU-E erytroïde voorlopers rechtstreeks mogelijk uit vers geoogst muizenweefsel zoals beenmerg en milt. Met behulp van deze techniek kunnen we zuivere populaties van erytroïde voorlopers isoleren, wat niet mogelijk was met de vorige stroomprotocollen. Deze methode verbetert ons vermogen om muismodellen met erytroïde ziekte te bestuderen aanzienlijk door voorloperisolatie mogelijk te maken voor veel downstream-experimenten.

Plaats om te beginnen de vers ontlede dijbenen en het scheenbeen direct in de koude kleuringsbuffer of SB-5 en houd de buizen op ijs totdat ze klaar zijn om het beenmerg te extraheren. Plaats een schone gesteriliseerde mortel op ijs in een emmer en breng de botten over op de mortel. Knip met behulp van de dissectieschaar ongeveer 1 millimeter uiteinden van elk bot af.

Gebruik een spuit van 3 milliliter uitgerust met een naald van 26 gauge met SB-5 om het merg uit de botten te spoelen en in de mortel te verzamelen en herhaal het proces 3 tot 5 keer met behulp van een verse buffer elke keer totdat de botten kleurloos lijken. Filter het gespoelde merg door een gaas van 100 micrometer en verzamel de cellen in een centrifugebuis van 50 milliliter die op ijs is geplaatst. Gebruik vervolgens de vijzel en stamper om de gespoelde botten in 5 tot 10 milliliter SB-5 te verpletteren.

Filter het mengsel van gemalen botten en buffer door de 100-micrometer celzeef om zich te poolen met de eerder verzamelde cellen. Plaats een gaasfilter van 100 micrometer op een lege centrifugebuis van 50 milliliter die op ijs is geplaatst. Plaats een enkele milt op het gaasfilter en voeg 0,5 tot 1 milliliter SB-5 toe aan de milt om ervoor te zorgen dat deze niet droogt.

Gebruik de rubberen kant van een 3- of 5-milliliter spuitzuiger om de milt door het gaas te persen. Voeg meer SB-5 toe, 5 milliliter per keer, en blijf pureren totdat alle cellen in de buis zijn verzameld. Bereid een eencellige suspensie voor door de verzamelde cellen met 2 milliliter SB-5 op en neer te pipetteren met behulp van een grote openingpunt.

Kleur de fluorescentie minus één of FMO-controles door alle antilichamen behalve het gelijknamige antilichaam van de FMO toe te voegen aan de celsuspensie in de FACS-buis. Om de controles met één kleur te kleuren, voegt u een enkel antilichaam toe aan de celsuspensie in de FACS-buis. Vortex elke controlebuis gedurende 2 tot 3 seconden bij 3000 RPM en incubeer vervolgens bij 4 graden Celsius schommelen gedurende 2,5 uur in het donker.

Was na de incubatie de cellen met SB-5 en vul het volume van de celsuspensie aan tot 4 milliliter met SB-5. Draai de cellen op 900 g gedurende 10 minuten bij 4 graden Celsius en adem het supernatant op. Schorste de niet-gebeitste en alle eenkleurige bedieningselementen opnieuw in 300 microliter SB-5 en filter door een filtergaas van 40 micrometer in nieuwe FACS-buizen.

Maak een DAPI SB-5-oplossing door de DAPI-voorraad te verdunnen in een verhouding van 1 tot 10.000 in SB-5. Suspendeer de FMOS opnieuw in 1,8 milliliter DAPI SB-5 en DAPI single-color control in 300 microliter DAPI SB-5 en filter ze vervolgens door een filtergaas van 40 micrometer in nieuwe FACS-buizen. Na het toevoegen van de antilichaam master mix aan elk monster, vortex de buizen gedurende 2 tot 3 seconden bij 3000 rpm gevolgd door incubatie bij 4 graden Celsius in het donker gedurende 2,5 uur in de schommelende toestand.

Na het wassen van de cellen zoals eerder aangetoond, suspensie de monsters opnieuw in 1,8 milliliter DAPI SB-5 en filter door een 40-micrometer filtergaas in een nieuwe FACS-buis en analyseer de monsters met behulp van een cystometer. Gebruik de voorwaartse verstrooiing om het vuil te verwijderen op basis van de grootte en gebruik vervolgens de voorwaartse verstrooiingshoogte versus het histogram van het voorwaartse spreidingsgebied om celaggregaten uit te sluiten en afzonderlijke cellen te selecteren. Herhaal de uitsluiting met de zijverstrooiingshoogte versus het histogram van het zijverstrooiingsgebied.

Sluit de dode cellen uit door de positieve cellen uit te splitsen voor DAPI. Selecteer de afstamming negatieve TUR één 19 negatieve kit positieve cellen. En selecteer hieruit een subpopulatie die CD 55 uitdrukt.

Verdeel de afstamming negatieve TUR één 19, negatieve kit, positieve, CD 55 positieve cellen in 2 principepopulaties, P zes en P zeven op basis van de expressie van CD 49 F en CD 1 0 5. Nu gebaseerd op de uitdrukking van CD 150 en CD 41, onderverdelen P 6 verder in P 3, P 4 en P 5. Op dezelfde manier, op basis van de expressie van CD 150 en CD 71, onderverdelen P 7 verder in BFUE, vroege CFUE en late CFUE.

In deze studie werden burst- en kolonievormende eenheden geïdentificeerd uit de vers geoogste beenmerg- en miltcellen. Na 72 uur erytropoëtine of voertuiginjectie bij de muizen, toonde erytropoëtinestimulatie uitbreiding van de vroege en late kolonievormende eenheidspopulaties P 1 laag en P 1 hoog in de geoogste beenmerg- en miltcellen. De respons van beenmerg- en miltvoorlopers op erytropoëtine in vivo toonde ook een hoger aantal cellen in de vroege en late kolonievormende eenheidspopulaties P 1 laag en P 1 hoog, vergeleken met voertuigcontrole.

Het is het belangrijkst om een eencellige suspensie te genereren voordat de cellen met antilichamen worden geëtiketteerd. Dit kan worden bereikt door herhaaldelijk op en neer te pipetteren en door EDTA in de buffer op te nemen. De gezuiverde voorlopers kunnen worden gebruikt voor elke stroomafwaartse cellulaire en moleculaire analyse.

Bijvoorbeeld single cell transcriptomics, atesque, colony assays en biochemie. Deze techniek hielp ons bij het testen van de voorspellingen van single cell RNA-seq experimenten.