Name: De mechanica van (poro-)elastische contractiele actomyosinenetwerken als modelsysteem van het celcytoskelet (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-10T12:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Ontdek de mechanica van poro-elastische actomyosinegels als modelsysteem voor het celcytoskelet. Deze in vitro methode onthult hoe myosinecontractiliteit vloeistofstroming genereert en netwerk- en cytosolsnelheden correleert.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen Dina Aranovich bedanken voor de eiwitzuivering en etikettering. G.L. is het Israëlische ministerie van Wetenschap, Technologie en Ruimte dankbaar voor de Jabotinsky PhD Scholarship. A.B.G. is de Israel Science Foundation (subsidie 2101/20) en het Ministerie van Wetenschap en Technologie - Staat Israël (subsidie 3-17491) dankbaar voor financiële steun.

1. Oppervlaktebehandeling en passivering van glas:
OPMERKING: Deze sectie bevat drie belangrijke stappen (zie figuur 1): (i) reiniging en hydrofielisatie, (ii) silanisatie en (iii) oppervlaktepassivering.
<ol><li>Reiniging en hydrofielisatie<ol><li>Gebruik Piranha-oplossing voor het reinigen van glasoppervlakken. OPMERKING: Piranha-oplossing is een mengsel van 30% H 2O 2 en 70% H2 SO4 (materiaaltabel). Het belangrijkste doel is om organische verontreinigingen van dekplaatoppervlakken te verwijderen en de OH-groepen op het glasoppervlak bloot te leggen. Op deze manier wordt het glasoppervlak hydrofiel.</li>
		<li>Plaats 10-12 #1.5 (22 mm x 22 mm) glazen coverslips (Table of Materials) in een zelfgemaakte polytetrafluorethyleenhouder (basisoppervlak: 5,5 cm x 5,5 cm). Breng de polytetrafluorethyleenhouder over in een bekerglas van 400 ml (materiaaltabel) en incubeer het gedurende 2 uur met 300 ml piranha-oplossing. Doe deze stap op ijs en in een chemische kap. OPMERKING: De polytetrafluorethyleenpaal die op de houderbasis is geschroefd, is 12 cm lang en langer dan het bekerglas (11 cm), waardoor de houder veilig kan worden overgebracht/uitgetrokken in/van de Piranha-oplossing. Omdat de Piranha-oplossing nog steeds zeer reactief en zeer heet kan zijn, is het noodzakelijk om de reactie te stoppen. De eenvoudigste manier om de reactie te stoppen is om de Piranha-oplossing in (kraan)water te gieten om een verdunning van 50x (ten minste) te bereiken. De oplossing kan dan veilig worden weggegooid. Bewaar de gebruikte Piranha-oplossing nooit in een gesloten glazen fles - dit kan eindigen in een flesexplosie.</li>
		<li>Breng de polytetrafluorethyleenhouder over in een schoon bekerglas gevuld met vers dubbel gedestilleerd water (DDW) om overtollige Piranha van de dekzeilen te wassen.</li>
		<li>Breng het bekerglas over in een ultrasoonapparaatbad (materiaaltafel) en soniceer op 80 Hz op vol vermogen gedurende 10 minuten bij 25 °C. Herhaal deze stap nog twee keer met verse DDW. Gebruik telkens verse DDW.</li>
	</ol></li>
	<li>Silanisatie<ol><li>Breng de houder over in een schoon bekerglas (400 ml) gevuld met 300 ml zuivere methanol (materiaaltafel) en vervolgens in een ultrasoonapparaatbad (materiaaltafel). Sonicate op 80 Hz op vol vermogen gedurende 30 minuten bij 25 °C.</li>
		<li>Breng de houder na ultrasoonapparaat over in een silaanoplossing bereid met 15 ml DDW, 3,1 ml azijnzuur (materiaaltabel), 340 ml methanol en 7,6 ml silaan ((3-mercaptopropyl) trimethoxysilaan) (materiaaltabel). Sluit het bekerglas af met parafilm en bewaar het een nacht in de koelkast op 4 °C. OPMERKING: De bereiding en hantering van de silaanoplossing moet worden uitgevoerd in een chemische kap. Na de silanisatiestap plaatst u de gebruikte silaanoplossing (afval) in een speciale glazen fles in de chemische kap.</li>
		<li>Breng de houder de volgende dag gedurende 15 s over in een schoon bekerglas gevuld met 300 ml zuivere methanol. Breng de houder vervolgens over in een schoon bekerglas, niet voordat u de bodem van de polytetrafluorethyleenhouder hebt gedroogd om overtollige methanol te verwijderen. Breng het bekerglas over in de oven (Materiaaltafel) om de glazen afdekplaten gedurende 5 minuten bij 120 °C te drogen.</li>
	</ol></li>
	<li>Oppervlaktepassivering met een inert polymeer<ol><li>Bereik oppervlaktepassivering door de glazen afdekplaten te incuberen met een inert polymeer (Table of Materials). Neem voor elk experiment twee coverslips en plaats ze in een petrischaal bedekt met een parafilmlaag die aanvankelijk is gereinigd met ethanol (EtOH) (DDW / EtOH: 30/70 vol / vol) (tabel met materialen).</li>
		<li>Incubeer elke coverslip met 1 ml van een 4 mg·ml−1 5 kDa molecuulgewicht methoxypolyethyleenglycolmaleimide (mPEG-mal, Mw = 5 kDa) (materiaaltabel) in 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (materiaaltabel) gedurende 1 uur bij 22 °C. OPMERKING: Door de coverslips op een hydrofobe parafilmlaag te plaatsen, wordt de hydrofiele PEG-polymeeroplossing beperkt tot het oppervlak van de glazen dekplaat. De incubatietijd is van cruciaal belang voor het bereiken van optimale passivering. Gebruik incubatietijden variërend tussen 45 min en 2 h. Boven deze incubatietijd kan het oppervlak van de glazen afdekplaat verslechteren, wat leidt tot eiwithechting en een verlies van transparantie.</li>
		<li>Spoel aan het einde van het incubatieproces elke coverslip af met 5 ml DDW en droog met een stroom van N2 (gas). Droog de afdekstroken niet onder vacuüm. Aangezien de afdekstroken na passivering nat moeten worden gehouden, plaatst u onmiddellijk 1 ml 10 mM Tris op de gepegyleerde oppervlakken. Gebruik de coverslips binnen 2 uur. OPMERKING: De verschillende stappen moeten worden uitgevoerd in een laminaire stromingskamer om verontreiniging van het glasoppervlak te voorkomen.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Eiwitzuivering
<ol><li>Zuiver G-actine van konijnenskeletspieracetonpoeder met behulp van de gelfiltratiemethode24.<ol><li>Actine zuivering duurt 1 week. Bewaar de gezuiverde G-actine in G-buffer (5 mM Tris pH 7,8, 0,01% NaN3, 0,1 mM CaCl 2,0,2 mM ATP en 1 mM DTT) en bewaar het op ijs. Gebruik de oplossing binnen 2 weken. OPMERKING: Vervang het ijs om de paar dagen.</li>
		<li>Label de actine met een maleimide-gemodificeerde fluorescerende kleurstof16 (Tabel met materialen). Zuiver de GST-fascin op basis van de methode van Ono et al.25. Flash-freeze beide eiwitten in vloeibare N2, en opslaan bij −80 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Gebruik een standaardprotocol om myosine II te zuiveren van de skeletspieren van konijnen26. De gezuiverde myosine II (dimeren) voorraadbuffer omvat 10 mM Tris pH 7,4, 0,5 M KCl en 35% w/v sucrose. Bevries de myosine in vloeistof N2 en bewaar bij −80 °C. OPMERKING: De hoge concentratie KCl houdt de myosinemotoren in een dimere vorm, terwijl het hoge percentage sucrose ervoor zorgt dat de activiteit van de motoren niet wordt belemmerd bij het bevriezen. Gebruik een speciale pipet voor het hanteren van viskeuze vloeistoffen bij het werken met myosine II-stamoplossingen (materiaaltabel).<ol><li>Label de myosine II-dimeren met een fluorescerende kleurstof (Materiaaltabel) op paren gemanipuleerde cysteïneresiduen19,27. Gebruik daarvoor een kippenmaag RLC-mutant A26. Vries het gelabelde myosine II in vloeistof N2 in en bewaar bij −80 °C. OPMERKING: Deze etiketteringsprocedure zorgt ervoor dat het gelabelde myosine actief is als het inheemse myosine II-eiwit.</li>
	</ol></li>
	<li>Gebruik een UV-Vis-spectrofotometer (materiaaltabel) om de absorptie van de stockeiwitoplossingen te meten en leid de eiwitconcentraties af met de wet van Beer-Lambert met behulp van de volgende extinctiecoëfficiënten: G-actine (ε290 = 26.460 M−1·cm−1), GST-fascin (ε 280 = 99.330 M−1·cm−1), myosine II-dimeer (ε280 = 268.800 M−1·cm−1), en RLC-mutant A (ε280 = 3.960 M−1·cm−1)19.</li>
</ol>3. Monstervoorbereiding
OPMERKING: Polymeriseer de actinemonomeren in de aanwezigheid van grote aggregaten van myosine II-motoren en de sterke passieve crosslinker fascin om macroscopisch contractiele elastische actomyosinenetwerken te produceren19,23. Het toevoegen van fluorescerende kralen aan de oplossing maakt het mogelijk om de oplosmiddelstroom tijdens gelcontractie te volgen.
<ol><li>Eiwit ("actomyosine") oplossing<ol><li>Bewaar de eiwitten, behalve G-actine, op −80°C in kleine aliquots en ontdooi ze voor gebruik bij 37°C. Het totale volume van de actomyosine-oplossing is 40 μL.</li>
		<li>Bereid de oplossing door 10 mM Tris pH 7,4, 2 mM MgCl2, 25 mM KCl, 1 mM ATP, een ATP-regenererend systeem (0,5 mg·ml−1 creatinekinase en 5 mM creatinekosfaat), 200 μM EGTA (chelaten Ca2+ ionen), een antibleekoplossing (0,1 mg·ml−1 glucoseoxidase, 0,018 mg·ml−1 katalase en 5 mg·ml−1 glucose) te mengen, 5 μM G-actine, 280 nM GST-fascin en 1,67 nM myosine II. Het percentage gelabelde G-actine is 5% (molair percentage). OPMERKING: Gebruik een laag percentage gelabelde G-actine om de verzadiging van het fluorescerende signaal in de gevorderde stadia van gelcontractie te voorkomen.</li>
	</ol></li>
	<li>Voorbereiding van myosine II motoraggregaten<ol><li>Voeg de myosinemotoren toe aan de eiwitoplossing in de vorm van aggregaten. Om grote myosineaggregaten (150 myosinedimeren/aggregaat) te vormen, verdunt u de myosine-stamoplossing met 10 mM Tris pH 7,4 om een eindconcentratie van 25 mM KCl te bereiken.</li>
		<li>Bewaar de verdunde myosine-oplossing gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT) en breng deze vervolgens over op ijs tot gebruik. De motoren zijn tot 2 uur volledig actief.</li>
	</ol></li>
	<li>Het meten van de oplosmiddelstroom<ol><li>Om de oplosmiddelstroom door de gelporiën te volgen, voegt u de fluorescerende kralen toe aan de actomyosine-oplossing. Verminder de interactie tussen de kralen en het actomyosinenetwerk door de kralen te passiveren. Incubeer praktisch 1 μL kralen (Tabel van Materialen) met 5 μM G-actine gedurende 20 minuten bij RT, en verwijder vervolgens overtollig G-actine door centrifugatie (Materiaaltabel) (omstandigheden: 6.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C).</li>
		<li>Herhaal deze stap met 10 mg·ml−1 runderserumalbumine (BSA) (materiaaltabel) om (mogelijk) het resterende ongecoate oppervlak te blokkeren. Gebruik de kralen bij een uiteindelijke verdunning van 1:10.000 vol/vol in de experimenten. OPMERKING: Het is belangrijk om de diameter van de kralen aan te passen aan de grootte van de gelporiën, zodat de verhouding tussen kraal en porie in alle stadia <1 is.</li>
	</ol></li>
	<li>Effect van de viscositeit van de oplossing<ol><li>Controleer de viscositeit van de oplossing door glycerol (materiaaltabel) aan de actomyosine-oplossing toe te voegen. Het toevoegen van glycerol met een gewichtspercentage variërend van 0% tot 34% induceert een overeenkomstige toename van de viscositeit van de oplossing van η ω tot 2,76 η ω, waarbij η ω de viscositeit van water bij 20 °C28 is. OPMERKING: Het is essentieel om een speciale pipet te gebruiken voor het hanteren van viskeuze vloeistoffen bij het werken met glycerol (materiaaltabel).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Een experiment uitvoeren
<ol><li>Zelfgemaakte monsterhouder handling<ol><li>Neem een van de PEG-gepassiveerde coverslips, plaats er een ingevette parafilm spacer op en plaats deze in de monsterhouder. OPMERKING: Men kan de parafilm spacer vervangen door elke spacer.</li>
	</ol></li>
	<li>De actomyosine-oplossing bereiden<ol><li>Bereid de actomyosine-oplossing op ijs in een microcentrifugebuis door de verschillende microscopische bestanddelen op te nemen, de myosine II-motoraggregaten toe te voegen en als laatste EGTA toe te voegen. Meng de oplossing goed. De toevoeging van EGTA initieert actomyosine-netwerkpolymerisatie, die de starttijd van het experiment bepaalt.</li>
	</ol></li>
	<li>Plaats 1,1 μL van die oplossing op de op de houder gemonteerde coverslip en plaats de tweede coverslip erop. Schroef de houder vast om het monster af te dichten. Dit proces knijpt enigszins in de druppel, die een schijfachtige vorm aanneemt. De druppeldiameters variëren tussen 2.800-3.000 μm.</li>
	<li>Plaats de monsterhouder op de microscoop en start de acquisitie. Bereid de microscoop van tevoren voor om de initiële acquisitietijd te verkorten. Het duurt meestal 1-2 minuten na het mengen om de beeldvorming van het monster te starten.</li>
</ol>5. Microscopie technieken
<ol><li>Beeld de monsters af met behulp van een omgekeerde fluorescerende microscoop (Table of Materials) die wordt bestuurd door speciale software (Table of Materials).<ol><li>Gebruik lage vergrotingen van 2,5x/0,075 Plan-NEOFLUAR-objectief (Materiaaltabel) om het hele gelgebied te visualiseren en de macroscopische samentrekking met de tijd te volgen.</li>
		<li>Gebruik een 10x/0.3 Ph1 UPlanFL-doelstelling (Table of Materials) om de porositeit en structuur van het netwerk te karakteriseren en om de zelforganisatie en contractie van het netwerk met de tijd te volgen. OPMERKING: Dit doel is ook nuttig voor het lokaliseren van de myosine II-motoraggregaten binnen het netwerk en het volgen van de beweging van fluorescerende kralen over de gelporiën. Hogere vergrotingen kunnen worden gebruikt ten koste van een verminderd gezichtsveld, wat nog belangrijker is in de beeldvormingsmodus met twee kleuren (Table of Materials).</li>
	</ol></li>
	<li>Prikkel de monsters bij 488 nm (actine/fluorescerende kralen) en 561 nm (myosinemotoraggregaten/fluorescerende kralen). Verkrijg de beelden met 100 ms per frame met speciale software (Table of Materials) in streamingmodus met een EMCCD-camera (Electron Multiplying Charge-coupled Device) (Table of Materials). OPMERKING: De intensiteit van de fluorescentielamp (materiaaltabel) moet op de laagst mogelijke waarde worden gehouden om signaalverzadiging tijdens netwerkcontractie te voorkomen.</li>
	<li>Gelijktijdige tweekleurenbeeldvorming<ol><li>Gebruik deze modus voor twee doeleinden: (i) het detecteren van de lokalisatie van de myosinemotoraggregaten binnen het actinenetwerk, en (i) het karakteriseren van de uitwendige oplosmiddelstroom binnen en buiten tijdens netwerkcontractie.</li>
		<li>Exciteer de actine- en myosine II-motoren bij respectievelijk 488 nm en 561 nm en neem de beelden gelijktijdig op een EMCCD-camera (materiaaltabel) op met behulp van een apparaat met dubbele emissie (materiaaltabel). Gebruik hetzelfde beeldvormingssysteem om tegelijkertijd de actinegel (488 nm) en de fluorescerende kralen (561 nm) in beeld te brengen.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlberts%2C+B+%22Genesis%2C+Modulation%2C+and+Regeneration+of+Skeletal+Muscle+In+Molecular+Biology+of+the+Cell.+4th+edition%22">Genesis, Modulation, and Regeneration of Skeletal Muscle In Molecular Biology of the Cell. 4th edition</a>. , Garland Science. New York. (2002).</li>
<li>Howard, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHoward%2C+J+%22Mechanics+of+Motor+Proteins+and+the+Cytoskeleton%22">Mechanics of Motor Proteins and the Cytoskeleton</a>. , Sinauer Associates. Sunderland, MA. (2001).</li>
<li>Mogilner, A., Manhart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+fluid+mechanics%3A+Coupling+cytoplasmic+flow+with+active+cytoskeletal+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Fluid+Mechanics%22%5BJournal%5D)">Intracellular fluid mechanics: Coupling cytoplasmic flow with active cytoskeletal gel.</a> Annual Review of Fluid Mechanics. 50 (1), 347-370 (2018).</li>
<li>Bausch, A. R., Kroy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bottom-up+approach+to+cell+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">A bottom-up approach to cell mechanics.</a> Nature Physics. 2 (4), 231-238 (2006).</li>
<li>Moeendarbary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytoplasm+of+living+cells+behaves+as+a+poroelastic+material%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">The cytoplasm of living cells behaves as a poroelastic material.</a> Nature Materials. 12 (3), 253-261 (2013).</li>
<li>Charras, G. T., Mitchison, T. J., Mahadevan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+cell+hydraulics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Animal cell hydraulics.</a> Journal of Cell Science. 122 (18), 3233-3241 (2009).</li>
<li>Charras, G. T., Yarrow, J. C., Horton, M. A., Mahadevan, L., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-equilibration+of+hydrostatic+pressure+in+blebbing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Non-equilibration of hydrostatic pressure in blebbing cells.</a> Nature. 435 (7040), 365-369 (2005).</li>
<li>Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+fluid+flow+in+rapidly+moving+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Intracellular fluid flow in rapidly moving cells.</a> Nature Cell Biology. 11 (10), 1219-1224 (2009).</li>
<li>Paluch, E., Piel, M., Prost, J., Bornens, M., Sykes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+actomyosin+breakage+triggers+shape+oscillations+in+cells+and+cell+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cortical actomyosin breakage triggers shape oscillations in cells and cell fragments.</a> Biophysical Journal. 89 (1), 724-733 (2005).</li>
<li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+under+construction%3A+In+vitro+reconstitution+of+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).</li>
<li>Siton-Mendelson, O., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+reconstitution+of+synthetic+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhesion+%26+Migration%22%5BJournal%5D)">Toward the reconstitution of synthetic cell motility.</a> Cell Adhesion & Migration. 10 (5), 461-474 (2016).</li>
<li>Bernheim-Groswasser, A., Wiesner, S., Golsteyn, R. M., Carlier, M. -F., Sykes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+actin-based+motility+depend+on+surface+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The dynamics of actin-based motility depend on surface parameters.</a> Nature. 417 (6886), 308-311 (2002).</li>
<li>Bieling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+feedback+controls+motor+activity+and+mechanical+properties+of+self-assembling+branched+actin+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Force feedback controls motor activity and mechanical properties of self-assembling branched actin networks.</a> Cell. 164 (1-2), 115-127 (2016).</li>
<li>Carvalho, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+polymerization+or+myosin+contraction%3A+two+ways+to+build+up+cortical+tension+for+symmetry+breaking%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Actin polymerization or myosin contraction: two ways to build up cortical tension for symmetry breaking.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1629), 20130005(2013).</li>
<li>Dayel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+reconstitution+of+actin-based+symmetry+breaking+and+motility%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">In silico reconstitution of actin-based symmetry breaking and motility.</a> PLoS Biology. 7 (9), e1000201(2009).</li>
<li>Manhart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+regulation+of+the+dynamic+steady+state+of+actin+networks%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Quantitative regulation of the dynamic steady state of actin networks.</a> eLife. 8, 42413(2019).</li>
<li>Siton, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortactin+releases+the+brakes+in+actin-based+motility+by+enhancing+WASP-VCA+detachment+from+Arp2%2F3+branches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Cortactin releases the brakes in actin-based motility by enhancing WASP-VCA detachment from Arp2/3 branches.</a> Current Biology. 21 (24), 2092-2097 (2011).</li>
<li>Pontani, L. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+an+actin+cortex+inside+a+liposome%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of an actin cortex inside a liposome.</a> Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).</li>
<li>Ideses, Y., Sonn-Segev, A., Roichman, Y., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+II+does+it+all%3A+Assembly%2C+remodeling%2C+and+disassembly+of+actin+networks+are+governed+by+myosin+II+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Myosin II does it all: Assembly, remodeling, and disassembly of actin networks are governed by myosin II activity.</a> Soft Matter. 9 (29), 7127-7137 (2013).</li>
<li>Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+gels%3A+Dynamics+of+patterning+and+self-organization%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Active gels: Dynamics of patterning and self-organization.</a> Physical Biology. 3 (4), 264(2006).</li>
<li>Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+motors+robustly+drive+active+gels+to+a+critically+connected+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state.</a> Nature Physics. 9 (9), 591-597 (2013).</li>
<li>Linsmeier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disordered+actomyosin+networks+are+sufficient+to+produce+cooperative+and+telescopic+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility.</a> Nature Communications. 7 (1), 12615(2016).</li>
<li>Ideses, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+buckling+of+contractile+poroelastic+actomyosin+sheets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Spontaneous buckling of contractile poroelastic actomyosin sheets.</a> Nature Communications. 9 (1), 2461(2018).</li>
<li>Spudich, J. A., Watt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+rabbit+skeletal+muscle+contraction%3A+I.+Biochemical+studies+of+the+interaction+of+the+tropomyosin-troponin+complex+with+actin+and+the+proteolytic+fragments+of+myosin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The regulation of rabbit skeletal muscle contraction: I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin.</a> Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).</li>
<li>Ono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+actin+binding+region+and+a+protein+kinase+C+phosphorylation+site+on+human+fascin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of an actin binding region and a protein kinase C phosphorylation site on human fascin.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (4), 2527-2533 (1997).</li>
<li>Margossian, S. S., Lowey, S. Preparation of myosin and its subfragments from rabbit skeletal muscle. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMargossian%2C+SS+%22In+Methods+in+Enzymology%22">In Methods in Enzymology</a>. 85, Academic Press. Cambridge, MA. 55-71 (1982).</li>
<li>Quinlan, M. E., Forkey, J. N., Goldman, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orientation+of+the+myosin+light+chain+region+by+single+molecule+total+internal+reflection+fluorescence+polarization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Orientation of the myosin light chain region by single molecule total internal reflection fluorescence polarization microscopy.</a> Biophysical Journal. 89 (2), 1132-1142 (2005).</li>
<li>Cheng, N. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formula+for+the+viscosity+of+a+glycerol%E2%88%92water+mixture%5BTitle%5D)+AND+%22Industrial+%26+Engineering+Chemistry+Research%22%5BJournal%5D)">Formula for the viscosity of a glycerol−water mixture.</a> Industrial & Engineering Chemistry Research. 47 (9), 3285-3288 (2008).</li>
<li>Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+membranes+with+grafted+polymers%3A+Physicochemical+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).</li>
<li>Strychalski, W., Guy, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+pressure+dynamics+in+blebbing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Intracellular pressure dynamics in blebbing cells.</a> Biophysical Journal. 110 (5), 1168-1179 (2016).</li>
<li>Head, D. A., Levine, A. J., MacKintosh, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+regimes+of+elastic+response+and+deformation+modes+of+crosslinked+cytoskeletal+and+semiflexible+polymer+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+E%22%5BJournal%5D)">Distinct regimes of elastic response and deformation modes of crosslinked cytoskeletal and semiflexible polymer networks.</a> Physical Review E. 68 (6), 061907(2003).</li>
<li>MacKintosh, F. C., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonequilibrium+mechanics+and+dynamics+of+motor-activated+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Nonequilibrium mechanics and dynamics of motor-activated gels.</a> Physical Review Letters. 100 (1), 018104(2008).</li>
<li>Melero, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+molecular+adsorption+of+proteins+using+the+PRIMO+system+for+micro-patterning+to+study+cell+responses+to+extracellular+matrix+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Light-induced molecular adsorption of proteins using the PRIMO system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60092(2019).</li>
<li>Bendix, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+analysis+of+contractility+in+active+cytoskeletal+protein+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks.</a> Biophysical Journal. 94 (8), 3126-3136 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier wordt een in vitro benadering gebruikt om de mechanica van poro-elastische actomyosinegels te karakteriseren als een modelsysteem van het celcytoskelet en, meer in het algemeen, van het celcytoplasma, waarvan is aangetoond dat het zich gedraagt als een poro-elastisch materiaal 3,5. De reologie van het celcytoskelet (cytoplasma) is gekenmerkt door een poro-elastische diffusieconstante, die dicteert hoe lang het duurt voordat de intracellulaire cytoso...

Levende cellen hebben unieke mechanische eigenschappen. Naast het vermogen om passief te reageren op toegepaste krachten, zijn ze ook in staat om actief krachten te genereren als reactie op externe stimuli1. Deze kenmerken, die essentieel zijn voor een verscheidenheid aan cellulaire processen, met name tijdens celmotiliteit, worden voornamelijk toegeschreven aan de mechanische en dynamische eigenschappen van het celcytoskelet, met name het actomyosinecytoskelet, een actieve gel van polaire actinefilamenten, myosinemoleculaire motoren en accessoire-eiwitten. Deze actomyosinenetwerken vertonen intrinsieke zelforganisatie- en contractie-eigenschappen aangedreven door de myosinemotoreiwitten, die de actinefilamenten met elkaar verbinden en actief mechanische spanningen genereren in het netwerk dat wordt gevoed door ATP-hydrolyse2.
Talrijke experimentele en theoretische studies zijn uitgevoerd om de materiaaleigenschappen van het cytoskelet3 te bestuderen. De algemeen aanvaarde opvatting is dat het cytoskelet zich gedraagt als een visco-elastisch materiaal4. Dit betekent dat op korte tijdschalen het cytoskelet zich gedraagt als een elastisch materiaal en op lange tijdschalen gedraagt het zich als een viskeuze vloeistof vanwege de crosslinking-eiwitten en myosinemotorische loslating (en herbevestiging), waardoor het netwerk dynamisch kan omslaan. In veel situaties kan het visco-elastische model echter niet de experimentele resultaten beschrijven, die meer consistent zijn met een beeld dat het cytoskelet beschrijft en, meer in het algemeen, het celcytoplasma dat wordt beschreven als een poro-elastisch actief materiaal 5,6. Twee hoofdkenmerken kenmerken dit soort materialen. (i) Het eerste hoofdkenmerk is het genereren van een stroom van het doordringende cytosol (het "oplosmiddel") over de gelporiën door contractiliteitsgradiënten aangedreven door de myosinemotoren, die ten grondslag liggen aan processen zoals cel blebbing7, motiliteit8 en celvormoscillaties9. De opkomst van dergelijke cytosolische stromen kan lokaal zijn, voor blebbing, of globaal, zoals in celmotiliteit. In het laatste geval drijven de contractiel aangebrachte spanningen aan de achterkant van de cel de stroom van de cytosolische vloeistof naar de voorkant van de cel, die de eiwitpool aanvult die nodig is voor lamellipodia-assemblage8. (ii) Het tweede hoofdkenmerk is dat de ontspanning van spanningen diffuus is en wordt gekenmerkt door een effectieve diffusieconstante, , die afhankelijk is van de gelelastische modulus, gelporositeit en oplosmiddelviscositeit5. De poro-elastische diffusieconstante bepaalt hoe snel het systeem reageert op een toegepaste spanning. Hogere diffusieconstanten komen overeen met een snellere herverdeling van de spanning. Dit bepaalt op zijn beurt hoe lang het duurt voordat de intracellulaire cytosolische vloeistof binnen de cel wordt herverdeeld na toegepaste mechanische stress, hetzij extern of intern, zoals de actieve contractiele spanningen die worden gegenereerd door myosinemotoren. Deze voorbeelden tonen dus aan dat de mechanica van het cytoskelet en het cytosol nauw met elkaar verbonden zijn en niet afzonderlijk kunnen worden behandeld3.
Omdat cellen hun mechanische eigenschappen op verschillende manieren kunnen reguleren, blijft het samenspel tussen netwerkmechanica en vloeistofstroomdynamica slecht begrepen. Een krachtige alternatieve benadering is het gebruik van in vitro gereconstitueerde systemen die volledige controle over de verschillende microscopische bestanddelen en de systeemparameters mogelijk maken, waardoor deze modelsystemen optimaal zijn voor fysische analyse10,11. Deze aanpak is met succes gebruikt om de impact van eiwitsamenstelling en systeemgeometrie op actine-gebaseerde motiliteit 12,13,14,15,16,17,18 te bestuderen, de 2D-patronen van actomyosinenetwerken 19,20,21,22, en de wisselwerking tussen netwerkcontractiliteit en vloeistofstroomdynamica van poro-elastische actomyosinegels, waar dit artikel zich op richt23.
In dit manuscript wordt de voorbereiding van contractiele elastische actomyosinenetwerken van controleerbare dimensies en materiaaleigenschappen besproken op basis van het werk van Ideses et al.23. De dynamiek van de samentrekkende gel en het gedraineerde oplosmiddel worden geanalyseerd en gekwantificeerd, waardoor wordt aangetoond dat deze actomyosine-gels kunnen worden beschreven als een poro-elastisch actief materiaal. Het bestuderen van het effect van oplosmiddelviscositeit op spanningsdiffusiviteit bevestigt verder de poro-elastische aard van deze netwerken. De verschillende schaalrelaties die worden gebruikt voor de kwantificering van gegevens worden verstrekt. Tot slot worden ook de experimentele uitdagingen, de veelvoorkomende valkuilen en de relevantie van de experimentele resultaten voor het celcytoskelet besproken.

<table><tbody><tr><td>(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilaan</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>175617</td><td>Opgeslagen onder Argon atmosfeer bij 4 &deg;C&nbsp;</td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Bio-Lab ltd</td><td>1070521</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 488</td><td>Invitrogene</td><td>A10254</td><td>Verdund met DMSO, opgeslagen onder Argon atmosfeer bij -20 &deg;C&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 647</td><td>Invitrogene</td><td>A20347</td><td>Verdund met DMSO, opgeslagen onder Argon atmosfeer bij -20 &deg;C&nbsp;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma -Aldrich Company</td><td>A3059</td><td>Opgeslagen bij 4 &deg;C&nbsp;</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma -Aldrich Company</td><td>C9322</td><td>De voorraadfles wordt bewaard onder droge atmosfeer (silica gel) bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Dekglasjes</td><td>Mezel-glaser</td><td>CG2222-1.5</td><td>Bewaard in milliQ-water na de Piranha-behandeling en gebruikt binnen 3 weken</td></tr><tr><td>Creatine kinase</td><td>Roche Life Science Products</td><td>10736988001</td><td>Verse bereiding in glycine buffer, op ijs gehouden en binnen 3 dagen gebruikt.&nbsp; De voorraadfles wordt bewaard onder droge atmosfeer (silica gel) bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Creatinefosfaat</td><td>Roche Life Science Products</td><td>10621714001</td><td>Wanneer opgelost moet worden bewaard bij -20 &deg;C en binnen 3 maanden worden gebruikt. De voorraadfles wordt bewaard onder Argon atmosfeer en opgeslagen bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Roche Life Science Products</td><td>10708984001</td><td>Wanneer opgelost moet worden bewaard bij -20 &deg;C en binnen 3 maanden worden gebruikt</td></tr><tr><td>Dual view Simultaan beeldvormingssysteem&nbsp;</td><td>Photometrics</td><td>DV2-CUBE</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>MP Biomedicals</td><td>195174</td><td></td></tr><tr><td>EM-CCD Camera</td><td>Andor Technology Ltd</td><td>DV 887</td><td></td></tr><tr><td>EM-CCD Camera</td><td>Photometrics</td><td>Evolve Delta</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Bio-Lab ltd</td><td>525050300</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentielamp</td><td>Rapp Optoelectronic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoresbrite YG Microspheres</td><td>Polysciences</td><td>17151-10</td><td>200 nm diameter</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>ICN Biomedicals Inc</td><td>194024</td><td>Wanneer opgelost moet worden bewaard bij -20 &deg;C en binnen 3 maanden worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Glucose oxidase</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>G7141</td><td>Bewaard in -20 &deg;C en binnen 3 maanden gebruikt. Het voorraadpoeder wordt bewaard onder Argon atmosfeer en bewaard bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>ICN Biomedicals Inc</td><td>800687</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>MP Biomedicals</td><td>808822</td><td></td></tr><tr><td>Waterstofperoxide</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>216763</td><td>Opgeslagen bij 4 &deg;C&nbsp;</td></tr><tr><td>KCl</td><td>EMD Millipore Corp.</td><td>529552</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Bio-Lab ltd</td><td>1368052100</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>EMD Millipore Corp.</td><td>442615</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMI3000</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-mal</td><td>Nanocs</td><td>PG1-ML-5k&nbsp;</td><td>Mw = 5000 Da. Verdeeld in kleine batches per gewicht. Opgeslagen onder Argon atmosfeer bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Nile red microspheres</td><td>Spherotech</td><td>FP-2056-2&nbsp;</td><td>2300 nm diameter</td></tr><tr><td>Objectief (10x)</td><td>Leica Germany</td><td>HC PL AP0</td><td>UPlanFL Numerische Apertuur = 0.3</td></tr><tr><td>Objectief (2.5x)</td><td>Leica Germany</td><td>506304</td><td>&nbsp;Plan-NEOFLUAR Numerische Apertuur = 0.075</td></tr><tr><td>Oven</td><td>WTC Binder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Amcor</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>PBS Buffer</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Shutter Driver</td><td>Vincet Associates</td><td>VMM D1</td><td></td></tr><tr><td>Silica gel</td><td>Merck</td><td>1.01907.5000</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Elma</td><td>Elmasonic P</td><td></td></tr><tr><td>Zwavelzuur</td><td>Carlo Erba reagents</td><td>410301</td><td></td></tr><tr><td>DV2 Dual-Channel Simultaan-beeldvormingssysteem</td><td>Photometrics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>MP Biomedicals</td><td>819620</td><td></td></tr><tr><td>UV-VIS Spectrofotometer</td><td>Pharmacia</td><td>Ultraspec 2100 pro</td><td></td></tr><tr><td>MICROMAN E</td><td>Gilson</td><td>FD10001</td><td>1&ndash;10 uL</td></tr><tr><td>MATLAB R2017b</td><td>MathWorks</td><td></td><td>Data kwantificering&nbsp;</td></tr><tr><td>MetaMorph&nbsp;</td><td>Molecular devices</td><td></td><td>Controlesoftware van het optische beeldvormingssysteem; data kwantificering (deeltjesvolganalyse, netwerkmaat)</td></tr></tbody></table>

de mechanica van (poro-)elastische contractiele actomyosinenetwerken als modelsysteem van het celcytoskelet

The Mechanics of (Poro-)Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton

Cellen kunnen actief hun vorm veranderen en beweeglijk worden, een eigenschap die afhangt van hun vermogen om hun interne structuur actief te reorganiseren. Dit kenmerk wordt toegeschreven aan de mechanische en dynamische eigenschappen van het celcytoskelet, met name het actomyosinecytoskelet, een actieve gel van polaire actinefilamenten, myosinemotoren en accessoire eiwitten die intrinsieke contractie-eigenschappen vertonen. De algemeen aanvaarde opvatting is dat het cytoskelet zich gedraagt als een visco-elastisch materiaal. Dit model kan echter niet altijd de experimentele resultaten verklaren, die meer consistent zijn met een beeld dat het cytoskelet beschrijft als een poro-elastisch actief materiaal - een elastisch netwerk ingebed met cytosol. Contractiliteitsgradiënten gegenereerd door de myosinemotoren drijven de stroom van het cytosol door de gelporiën, wat afleidt dat de mechanica van het cytoskelet en het cytosol nauw met elkaar verbonden zijn. Een belangrijk kenmerk van poro-elasticiteit is de diffusieve ontspanning van spanningen in het netwerk, gekenmerkt door een effectieve diffusieconstante die afhankelijk is van de gelelastische modulus, porositeit en cytosol (oplosmiddel) viscositeit. Omdat cellen veel manieren hebben om hun structuur en materiaaleigenschappen te reguleren, blijft ons huidige begrip van hoe cytoskeletmechanica en cytosolstroomdynamiek zijn gekoppeld, slecht begrepen. Hier wordt een in vitro reconstitutiebenadering gebruikt om de materiaaleigenschappen van poro-elastische actomyosinegels te karakteriseren als een modelsysteem voor het celcytoskelet. Gelcontractie wordt aangedreven door myosine motorische contractiliteit, wat leidt tot het ontstaan van een stroom van het penetrerende oplosmiddel. Het artikel beschrijft hoe deze gels te bereiden en experimenten uit te voeren. We bespreken ook hoe de oplosmiddelstroom en gelcontractie kunnen worden gemeten en geanalyseerd, zowel op lokale als op wereldwijde schaal. De verschillende schaalrelaties die worden gebruikt voor gegevenskwantificering worden gegeven. Ten slotte worden de experimentele uitdagingen en veelvoorkomende valkuilen besproken, inclusief hun relevantie voor de cytoskeletmechanica van cellen.

Per experiment worden twee glazen dekplaten gebruikt. De glazen afdekplaten worden gereinigd en gepassiveerd met PEG-polymeren. Passivering is essentieel om te voorkomen dat de opgeloste eiwitten zich in de vroege experimentele stadia aan de glasoppervlakken hechten en om de interactie van het samentrekkende netwerk met de glazen wanden te minimaliseren. Het niet bereiken van een goede passivering kan leiden tot inefficiënte contractie en kan in extreme gevallen zelfs de vorming van het actinenetwerk remmen.
<p class...

In dit werk wordt een in vitro reconstitutiebenadering gebruikt om de poro-elasticiteit van actomyosinegels onder gecontroleerde omstandigheden te bestuderen. De dynamiek van de actomyosinegel en het ingebedde oplosmiddel worden gekwantificeerd, waardoor de netwerkporo-elasticiteit wordt aangetoond. We bespreken ook de experimentele uitdagingen, veelvoorkomende valkuilen en relevantie voor celcytoskeletmechanica.

De mechanica van (poro-)elastische contractiele actomyosinenetwerken als modelsysteem van het celcytoskelet

Cells can actively change their shapes and become motile, a property that depends on their ability to actively reorganize their internal structure. This ...

We hebben een in vitro benadering ontwikkeld om de mechanica van poro-elastische actomyosinegels te karakteriseren als een modelsysteem van het celcytoskelet, en meer in het algemeen het cytoplasma, waarvan is aangetoond dat het zich gedraagt als een poro-elastisch actief materiaal. Deze methode geeft inzicht in hoe myosinecontractiliteit bijdraagt aan het ontstaan van een vloeistofstroom en hoe netwerk- en cytosolsnelheden gecorreleerd zijn in tijd en ruimte. Deze eenvoudige aanpak stelt ons in staat om de mechanische eigenschappen van dynamisch evoluerende systemen te extraheren zonder gebruik te maken van geavanceerde apparatuur of technieken waar conventionele gereedschappen zoals AFIM niet kunnen worden gebruikt.Deze methode kan inzicht geven in de reologie van poro-elastische actieve materialen, ongeacht de specificiteit van de actieve gel en de ingebedde vloeistof. Plaats om te beginnen 10 tot 12 nummer 1,5 glazen afdekplaten in een zelfgemaakte polytetrafluorethyleenhouder en bereid piranha oplossing voor in een bekerglas van 400 milliliter. Bereid de oplossing op ijs in een chemische kap.Breng de houder over in het met Piranha gevulde bekerglas. Breng na drie uur de houder

the-mechanics-poro-elastic-contractile-actomyosin-networks-as-model

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Vorming van actomyosinebundels in vitro en het meten van myosine ensemblekrachtgeneratie met behulp van een optisch pincet wordt gepresenteerd en besproken.

Myosine Ensemble Mechanics onderzoeken in Actin Filament Bundles met behulp van optische pincetten

Differentiële dynamische microscopie (DDM) combineert kenmerken van dynamische lichtverstrooiing en microscopie. Hier wordt het proces van het gebruik van DDM om gereconstitueerde cytoskeletnetwerken te karakteriseren door de subdiffusieve en gekooide dynamiek van deeltjes in vimentinenetwerken en de ballistische beweging van actieve myosine-gedreven actine-microtubulecomposieten te kwantificeren.

Kwantificeren van cytoskeletdynamica met behulp van differentiële dynamische microscopie

Dit protocol beschrijft de vorming van ondersteunde lipide bilayers en de toevoeging van cytoskeletale filamenten en motoreiwitten om de dynamiek van gereconstitueerde, membraangebonden cytoskeletale netwerken te bestuderen met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Reconstitutie van membraangebonden minimale actinecorticosterces op ondersteunde lipidebilagen

In dit manuscript demonstreren we de experimentele technieken om het F-actinecytoskelet in te kapselen in gigantische unilamellaire lipideblaasjes (ook wel liposomen genoemd), en de methode om een cortex-biomimicking F-actinelaag te vormen aan de binnenste folder van het liposoommembraan.

In vitro Reconstitutie van het Actin Cytoskelet Inside Giant Unilamellar Vesicles

Dit artikel presenteert protocollen voor het engineeren en karakteriseren van afstembare driedimensionale composietnetwerken van co-verstrengelde actinefilamenten en microtubuli. Composieten ondergaan actieve herstructurering en ballistische beweging, aangedreven door myosine II- en kinesinemotoren, en worden afgestemd op de relatieve concentraties actine, microtubuli, motoreiwitten en passieve crosslinkers.

Reconstitueren en karakteriseren van Actin-Microtubule Composieten met instelbare motoraangedreven dynamica en mechanica

Actomyosine contractiliteit speelt een belangrijke rol in cel- en weefselmorfogenese. Het is echter een uitdaging om actomyosinecontractiliteit in vivo acuut te manipuleren. Dit protocol beschrijft een optogenetisch systeem dat snel Rho1-gemedieerde actomyosinecontractiliteit in Drosophila-embryo's remt, waardoor het onmiddellijke verlies van epitheliale spanning na de inactivatie van actomyosine in vivo wordt onthuld.

Optogenetische remming van Rho1-gemedieerde actomyosinecontractiliteit in combinatie met meting van epitheliale spanning in Drosophila-embryo's

Hier presenteren we methoden voor het bereiden van quasi-tweedimensionale (2D) verstrengelde, verknoopte en vloeibare kristalactine-assemblages van gezuiverde eiwitten.

Het afstemmen van de contractiliteit en vervormingsmodi van actieve op actine gebaseerde assemblages in vitro: van tweedimensionale actieve netwerken tot druppels van vloeibare kristallen

Dit protocol beschrijft een instelbare motiliteitsassay met actiniekometstaart-kralen om kwantitatief te onderzoeken hoe myosinemotoractiviteit de assemblage van vertakte actine en de netwerkarchitectuur bij een membraanachtige interface beïnvloedt.

Reconstitutie van myosin-I-gemedieerde vertakte actine-assemblage in een bead-gebaseerde actine-komeetstaart-motiliteitsassay

Traditionele, tweedimensionale celcultuur technieken vaak resulteren in veranderde eigenschappen met betrekking tot de differentiatie markers, cytokines en groeifactoren. Drie-dimensionale celkweek in het draaiende celkweek systeem (RCC's) herstelt expressie van vele van deze factoren zoals hier afgebeeld met een extravillous trophoblast cellijn.

Roterende celkweek systemen for Human Cultuur van de Cel: Human trofoblast cellen als een model

We hebben geoptimaliseerd een micro-inkapseling techniek als een effectief 3D-platform voor de vermeerdering en differentiatie van embryonale stamcellen endoderm en dopaminerge (DA) neuronen. Het biedt ook een kans voor immuun-isolatie van cellen van de gastheer tijdens de transplantatie. Dit platform kan worden aangepast voor andere celtypen.

Alginaat microcapsule als een 3D-platform voor de vermeerdering en differentiatie van humane embryonale stamcellen (hESC) tot verschillende geslachten

Ontdek de mechanica van poro-elastische actomyosinegels als modelsysteem voor het celcytoskelet. Deze in vitro methode onthult hoe myosinecontractiliteit vloeistofstroming genereert en netwerk- en cytosolsnelheden correleert.

De mechanica van (poro-)elastische contractiele actomyosinenetwerken als modelsysteem van het celcytoskelet

Meer video's verkennen