Name: Beoordeling van ex vivo muizen biventriculaire functie in een Langendorff-model (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Leer hoe u ex vivo hartperfusie toepast om biventriculaire functie in muizen te beoordelen na koude preservatie. Deze methode biedt betrouwbare gegevens voor transplantatieonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Alle dierproeven in dit protocol zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Michigan, Ann Arbor. Alle muizen werden gehuisvest in een lichtcyclus van 12:12 in pathogeenvrije kamers. Zie de Materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen, dieren en apparatuur die in dit protocol worden gebruikt.
1. Constructie van de siliconenballonkatheter
OPMERKING: De siliconenballon is gemaakt zoals eerder beschreven13.
<ol><li>Voeg 9,5 ml gedestilleerd water, 14,2 ml lichte glucosestroop en 33,8 g sacharose toe aan een bekerglas van 100 ml. Verwarm en roer de oplossing tot de suiker volledig is opgelost.</li>
	<li>Bereid het deeg voor door 10 g tarwebloem en 5 g water te mengen tot een gelijkmatige consistentie is bereikt en laat het 10 minuten rusten.</li>
	<li>Vorm een klein stukje deeg tot een ovaal - de "kop" - en bevestig het aan het uiteinde van een droge spaghettistreng. Dompel deze kop vervolgens in de suikeroplossing en haal hem langzaam uit de oplossing, aangezien de kop nu volledig bedekt is. NOTITIE: Het deeg moet glad en gelijkmatig van structuur zijn. De grootte van het deeg kan worden gevarieerd om ballonnen van verschillende grootte te genereren, van 5 mm (korte diameter) tot 7 mm (lange diameter). Probeer ze te bedekken met een dun laagje suikeroplossing.</li>
	<li>Hang de spaghettistreng op een blok polystyreenschuim of andere houders, om een glanzende hoes gelijkmatig over het hoofd te vormen en een nacht te drogen.</li>
	<li>Dompel de mal in siliconendispersie (siliconenelastomeer gedispergeerd in xyleen). Plaats de spaghettistreng terug in het polystyreenschuimblok bij 37 °C gedurende 2 uur of tot het droog is. Herhaal deze stap één keer. NOTITIE: Het is essentieel om te voorkomen dat de siliconendispersiegel oxideert door blootstelling aan de lucht, omdat dit een ongelijkmatige ballondikte genereert.</li>
	<li>Plaats de mal in het water om de ballon te scheiden en op te vangen. Bewaar de ballon in 0,02% natriumazide.</li>
	<li>Knip een punt met twee stompe uiteinden van een naald van 22 G; monteer een stomp uiteinde op de siliconenballon en een ander stomp uiteinde op PE-slang. Gebruik 4-0 zijde om de ballon op zijn plaats op de naald te binden. NOTITIE: Test de integriteit van de ballon door er water in te injecteren. Zodra de ballon gevuld is, drukt u zachtjes op de ballon om te testen of de ballon de spanning binnenin behoudt. Gebruik een nieuwe ballon als deze lekt. De gemonteerde ballonnen kunnen worden opgeborgen voor toekomstig gebruik.</li>
</ol>2. Voorbereiding van het hartperfusiesysteem
<ol><li>Maak 1 L Krebs-Henseleit (KH) perfusiebuffer en breng deze over naar het waterreservoir Langendorff-systeem.</li>
	<li>Sluit de luchtslang aan op het waterreservoir en schakel de luchtstroom in om de KH-buffer met 5% CO 2 en 95% O2 gedurende minimaal 30 minuten in evenwicht te brengen.</li>
	<li>Stel het waterbad in op 41,5 °C en laat het water in de buitenste laag van het Langendorff-systeem circuleren om het systeem en de KH-buffer op te warmen. NOTITIE: De temperatuur van het waterbad moet voor elk systeem worden geoptimaliseerd. Voor dit systeem zal de temperatuur van het waterbad de KH op 37-37,5 °C houden bij perfusie in het hart.</li>
</ol>3. Isolatie, montage en canulatie van het muizenhart
<ol><li>Voor antistolling, toediening 200 eenheden heparine in zoutoplossing door intraperitoneale (i.p.) injectie in het rechterkwadrant van C57/B6 muizenbuik. Zuig de spuit vóór de injectie op om te bevestigen dat de afschuining van de naalden zich niet in de blaas of het lumen van het maagdarmkanaal bevindt. Gebruik ten minste vier muizen in elke experimentele conditie (maar houd ook rekening met de grootte van het behandelingseffect).<ol><li>Dien na 30 minuten 80 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine i.p. toe om de muis te verdoven. Controleer of de verdoofde muis bewusteloos is door een teenknijp uit te voeren en ervoor te zorgen dat er geen reactie wordt waargenomen. Acepromazine 2 mg/kg kan aan de ket/xyl-cocktail worden toegevoegd als de gebruikte muizenstam geen adequaat niveau van anesthesie bereikt met alleen ket/xyl.</li>
		<li>Maak een incisie net onder het borstbeen. Gebruik een schaar om de borstkas te openen door het middenrif en de ribben door te knippen. Vouw de voorste borstwand om de borstkas volledig bloot te leggen. Snijd bij de dalende aorta (gesloten tot aan de aortaboog). Breng het hart, de longen en de thymus van de muis over naar koude histidine-tryptofaan-ketoglutaraat (HTK)-buffer. Isoleer de organen onder ijskoude HTK-buffer. Leg de aorta bloot door eventueel bindweefsel te verwijderen. NOTITIE: Maximaliseer de lengte van de aorta door zowel de aorta ascendens als de aortaboog in de excisie op te nemen, zodat er voldoende ruimte is om verbinding te maken met een naald.</li>
	</ol></li>
	<li>Sluit het uiteinde van de aorta aan op een naald van 22 G en bind vast met een 6-0 zijden hechtdraad. Zorg ervoor dat de canule zich boven de aortawortel bevindt om de aortaklep niet te hinderen. Doordrenk de aorta met 10 ml koude (4 °C) HTK-buffer gedurende ongeveer 10 minuten. OPMERKING: Het duurt minder dan 15 minuten vanaf het verwijderen van het hart tot het canuleren van de aorta; Het is echter belangrijk om de perfusiesnelheid op het juiste niveau te houden. Injecties die te snel en krachtig zijn, kunnen hoge druk veroorzaken en vasculaire/hartschade veroorzaken.</li>
	<li>Bewaar het hart gedurende 8 uur in een buisje van 50 ml met ijskoude HTK of voer onmiddellijk de perfusie uit (bewaar de controle niet) en vermijd direct contact met ijs. NOTITIE: Direct contact van het hartweefsel met ijs kan leiden tot koudeletsel.</li>
	<li>Verbind het met de naald gemonteerde hart met de canule in het Langendorff-apparaat en bind het vast met een zijden hechtdraad. NOTITIE: Om de procedure te standaardiseren, wacht u in totaal 3 minuten op het canulatieproces vóór perfusie.</li>
	<li>Start de perfusie met een constante stroommodus van 3 ml/min; schakel vervolgens over naar de constante drukmodus bij 70-80 mmHg en stel het hart in op ~6 ml/min. OPMERKING: Het zacht palperen van het hart kan de hartreanimatie helpen versnellen. Als het perfusiedebiet veel hoger is dan 6 ml/min bij constante druk, kan er een lek in de canulatie zijn of werkt de aortaklep mogelijk niet goed. Pas de aansluitingen aan om het lek te verhelpen. De constante stroommodus heft de vasculaire tonuszelfregulatie van het hart op. De constante drukmodus stelt het hart in staat om de coronaire perfusiestroom te regelen. Daarom meet de constante drukmodus nauwkeurig de hartfunctie en de kwaliteit van het behoud van het hart.</li>
	<li>Sluit een leeggelopen, met water gevulde ballon aan op een druktransducer en een met water gevulde spuit met een driewegkraan. Na een evenwichtsperiode van 15-20 minuten, snijdt u het rechter atrium (RA) door en steekt u de ballon via de RA in de RV. Gebruik tape om de ballon in de camper te houden. Minimaliseer het open gebied van de RA om de ballon in het ventrikel te beperken (zie afbeelding 1 voor de opstelling). OPMERKING: Een periode van evenwicht is noodzakelijk, omdat de samentrekking en ontspanning van het hart in het begin niet stabiel zijn en de meting minder nauwkeurig en representatief is. Als de AV-knoop beschadigd raakt tijdens het openen van de RA, zal het hart frequente aritmieën vertonen.</li>
	<li>Na 20 minuten functionele verzameling van RV-gegevens, snijdt u het linker atrium (LA) door en steekt u een leeggelopen met water gevulde ballon door de LA naar de LV. Gebruik tape om de ballon in de LV te houden. OPMERKING: Het hart moet gedurende meer dan 1,5 uur een stabiele hemodynamica behouden.</li>
</ol>4. Functionele gegevensregistratie
<ol><li>Kalibratie van de drukopnemer<ol><li>Vul een spuit van 10 ml met warme zoutoplossing en sluit de spuit aan op de koepel via een driewegkraan. Open de kraan en vul de koepel langzaam met zoutoplossing, en sluit vervolgens alle kranen en verwijder de spuit. Bevestig de gevulde koepel aan de transducer; Sluit de manometer aan op het derde uiteinde van de driewegkraan.</li>
		<li>Selecteer in de opnamesoftware de Bridge Amp in het vervolgkeuzemenu van het kanaal dat op de transducer is aangesloten. Wijzig de naam van het kanaal in Geperfuseerde druk. Klik op Nul om de transducer op nul te zetten.</li>
		<li>Start de opname door op Start te klikken, zodat de transducer nu 0 mmHg aangeeft. Na enkele seconden opnemen duwt u langzaam op de spuit en verhoogt u de druk tot 100. Klik op stop om de opname te stoppen.</li>
		<li>Selecteer in het dialoogvenster Eenheden conversie een opnamegebied voor 0 mmHg en klik op de pijl naar Punt 1 en typ 0 mmHg. Selecteer het opnamegebied voor 100 mmHg, klik op de pijl naar punt 2 en typ 100 mmHg. Klik op OK om de transducer te kalibreren.</li>
	</ol></li>
	<li>Wijzig de naam van het kanaal dat overeenkomt met de druktransducer met de ballon in Ventrikeldruk. Start de opname wanneer het hart is aangesloten op het systeem. Nadat u de ballon in het ventrikel hebt ingebracht, past u het watervolume in de ballon aan met behulp van een micrometerspuit door de driewegkraan om de einddiastolische druk op 5-10 mmHg te houden. OPMERKING: De einddiastolische maat kan tijdens de meting afnemen, bij voorkeur vanaf bijna 10 mmHg.</li>
	<li>Wijzig de naam van een leeg kanaal in dP/dt. Selecteer in het vervolgkeuzemenu Derivaat | bronkanaal als Ventrikeldruk. Het kanaal registreert de verhouding van de drukverandering in de ventriculaire holte tijdens de contractieperiode.</li>
	<li>Selecteer een stabiele meetperiode en klik vervolgens op Instellingen in de module Bloeddruk.<ol><li>Selecteer de ventrikeldruk als ingangskanaal en klik op selectie voor een berekeningsperiode | Oké.</li>
		<li>Klik op Classificatieweergave om de uitschieter van de hartcyclus te verwijderen (bijvoorbeeld abnormale cyclustijd of druk).</li>
		<li>Klik op tabelweergave om de tabellen te genereren met het gemiddelde van max dP/dt (contractie) en min dP/dt (relaxatie) voor de geselecteerde periode. NOTITIE: Sla het opnamebestand voor elk monster op en sla de tabel met de gemiddelde hartfunctie op voor statistische analyse.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Kim, I. C., Youn, J. C., Kobashigawa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+past%2C+present+and+future+of+heart+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Korean+Circulation+Journal%22%5BJournal%5D)">The past, present and future of heart transplantation.</a> Korean Circulation Journal. 48 (7), 565-590 (2018).</li>
<li>Gaffey, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+%26%2334%3Bhigh-risk%26%2334%3B+donor+hearts%3A+Implications+for+infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Transplantation of &#34;high-risk&#34; donor hearts: Implications for infection.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 152 (1), 213-220 (2016).</li>
<li>Hsich, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matching+the+market+for+heart+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%3A+Heart+Failure%22%5BJournal%5D)">Matching the market for heart transplantation.</a> Circulation: Heart Failure. 9 (4), 002679(2016).</li>
<li>Piperata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+transplantation+in+the+new+era+of+extended+donor+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiac+Surgery%22%5BJournal%5D)">Heart transplantation in the new era of extended donor criteria.</a> Journal of Cardiac Surgery. 36 (12), 4828-4829 (2021).</li>
<li>Huckaby, L. V., Hickey, G., Sultan, I., Kilic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+the+utilization+of+marginal+donors+for+orthotopic+heart+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiac+Surgery%22%5BJournal%5D)">Trends in the utilization of marginal donors for orthotopic heart transplantation.</a> Journal of Cardiac Surgery. 36 (4), 1270-1276 (2021).</li>
<li>Singh, S. S. A., Dalzell, J. R., Berry, C., Al-Attar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+graft+dysfunction+after+heart+transplantation%3A+a+thorn+amongst+the+roses%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Failure+Reviews%22%5BJournal%5D)">Primary graft dysfunction after heart transplantation: a thorn amongst the roses.</a> Heart Failure Reviews. 24 (5), 805-820 (2019).</li>
<li>Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+heart+perfusion%3A+the+Langendorff+technique+of+isolated+heart+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).</li>
<li>Rossello, X., Hall, A. R., Bell, R. M., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Langendorff+perfused+isolated+mouse+heart+model+of+global+ischemia-reperfusion+injury%3A+impact+of+ischemia+and+reperfusion+length+on+infarct+size+and+LDH+release%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Langendorff perfused isolated mouse heart model of global ischemia-reperfusion injury: impact of ischemia and reperfusion length on infarct size and LDH release.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 21 (3), 286-295 (2016).</li>
<li>Matsuura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+inotropic+effects+of+ATP+released+via+the+maxi-anion+channel+in+Langendorff-perfused+mouse+hearts+subjected+to+ischemia-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+Development+Biology%22%5BJournal%5D)">Positive inotropic effects of ATP released via the maxi-anion channel in Langendorff-perfused mouse hearts subjected to ischemia-reperfusion.</a> Frontiers in Cell Development Biology. 9, 597997(2021).</li>
<li>Tse, G., Hothi, S. S., Grace, A. A., Huang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventricular+arrhythmogenesis+following+slowed+conduction+in+heptanol-treated%2C+Langendorff-perfused+mouse+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Ventricular arrhythmogenesis following slowed conduction in heptanol-treated, Langendorff-perfused mouse hearts.</a> The Journal of Physiological Sciences. 62 (2), 79-92 (2012).</li>
<li>Kobashigawa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Report+from+a+consensus+conference+on+primary+graft+dysfunction+after+cardiac+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Heart+and+Lung+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Report from a consensus conference on primary graft dysfunction after cardiac transplantation.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 33 (4), 327-340 (2014).</li>
<li>Lei, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+inflammatory+responses+of+the+native+left+and+right+ventricle+associated+with+donor+heart+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Differential inflammatory responses of the native left and right ventricle associated with donor heart preservation.</a> Physiological Reports. 9 (17), 15004(2021).</li>
<li>Miller, A., Wright, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+murine+ventricular+balloons+for+the+Langendorff+heart+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology+%26+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Fabrication of murine ventricular balloons for the Langendorff heart preparation.</a> Journal of Biotechnology & Biomaterials. 1 (101), (2011).</li>
<li>Madsen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+immunology+of+heart+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Heart+and+Lung+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Advances in the immunology of heart transplantation.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 36 (12), 1299-1305 (2017).</li>
<li>Voelkel, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Right+ventricular+function+and+failure%3A+report+of+a+National+Heart%2C+Lung%2C+and+Blood+Institute+working+group+on+cellular+and+molecular+mechanisms+of+right+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Right ventricular function and failure: report of a National Heart, Lung, and Blood Institute working group on cellular and molecular mechanisms of right heart failure.</a> Circulation. 114 (17), 1883-1891 (2006).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.

Dit protocol beschrijft de retrograde perfusie Langendorff-methode via aortacanulatie. Deze techniek kan worden gebruikt om de LV- en RV-functie van muizenharten na koude opslag te evalueren. De resultaten laten zien dat de langdurige koude opslag van donorharten leidt tot een verminderde hartfunctie in zowel de LV als RV met behulp van dit protocol. 
De studies van acute en chronische afstoting na harttransplantatie richten zich sterk op immunobiologie14. De effecten van inheemse cellen op PGD tijdens koude opslag zijn minder goed onderzocht. PGD komt voor bij ~10%-20% van de harttransplantaties en is verantwoordelijk voor 66% van de vroege sterfte binnen 30 dagen na transplantatie. Met name de incidentie van PGD die de LV beïnvloedt versus de RV verschilt na transplantatie11. Zonder de bijdrage van cellulaire responsen van de ontvanger, richt deze ex vivo-methode zich op de bijdragen van inheemse hartcellen aan PGD na koude bewaring van donorharten. Verdere studies kunnen de reacties van de ontvanger opnemen in een muizenharttransplantatiemodel. 
In dit protocol concentreerde de Langendorff-perfusie van koud geconserveerde donorharten zich op de natuurlijke hartreacties op warme kristalloïde perfusie zonder cellulaire immuniteit te infiltreren. Om reproduceerbare resultaten te bereiken, werden verschillende kritische stappen gestandaardiseerd. De muizenharten werden gearresteerd met behulp van HTK-oplossing en opgeslagen in ijskoude HTK, vergelijkbaar met de klinische praktijk. Het perfusievolume en de infusietijd van de HTK-oplossing voor elk hart werd nauwlettend in de gaten gehouden met een timer. Het donorhart werd bewaard in voorgekoelde buisjes op ijs met HTK in een ruimte van 4 °C. De canulatietijd is gestandaardiseerd op ~3 minuten voorafgaand aan de perfusie. Al deze stappen zorgden ervoor dat de duur van koude bewaring de belangrijkste variabele in het onderzoek was. 
Een periode van onregelmatige cardiale contractiliteit gedurende ~20 minuten werd vaak gezien aan het begin van de perfusie. Deze evenwichts- en herstelperiode werd vergemakkelijkt door geleidelijke opwarming en zuurstofvoorziening van hartweefsels. Na de eerste 20 minuten werd een relatief stabiele periode verwacht. De ballon werd ~18 minuten na de eerste evenwichtsperiode in de ventrikelholte ingebracht. We begonnen met het opnemen van hemodynamica nadat het hart ~25 minuten stabiel was, nadat de ballon was ingebracht. Perfusie met KH-buffer handhaafde stabiele cardiale prestaties gedurende ~1,5-2 uur. We hebben er daarom voor gekozen om de hemodynamica gedurende 20 minuten in elk van de linker- en rechterventrikels op te nemen.
Er zijn verschillende beperkingen van retrograde perfusie voor het bestuderen van de PGD van harten na koude opslag. Ten eerste, vanwege de grootte van de ballon en een gebrek aan ruimte in elke ventriculaire holte (in het bijzonder de RV), is het gelijktijdig inbrengen van twee ballonnen in zowel de LV als de RV een grote uitdaging. Zo meten we de functie van RV en LV opeenvolgend. Het is belangrijk op te merken dat het interventriculaire septum aanzienlijk bijdraagt aan zowel de linker- als de rechterventrikelfunctie. Het septum draagt bij aan ~50% van de rechterventrikelfunctie, dus er is sprake van interventriculaire afhankelijkheid15. Het is ook belangrijk op te merken dat, terwijl de procedures voor reperfusie van het muizenhart in het Langendorff-apparaat ~3 minuten duren, chirurgische implantatie van het menselijk hart in het relatief warme operatieveld ~45 minuten duurt. Ter vergelijking: het muizenhart in dit Langendorff-systeem heeft minder ischemische tijd. Hiermee moet rekening worden gehouden bij het overwegen van klinische vertaling.
Omdat we KH-buffer gebruikten om het hart zonder bloed te doordringen, kan dit ook minder efficiënt zijn in de zuurstofafgifte. De hartfunctie is echter relatief stabiel gedurende de eerste 1,5-2 uur van de perfusie, waardoor betrouwbare hemodynamische metingen mogelijk zijn. Helaas zijn er momenteel geen levensvatbare werkende hartperfusiemodellen voor deze kleinere muizenharten, en het effect van ventriculaire belasting kan in dit systeem niet worden geëvalueerd. Desondanks is het perfusiesysteem zeer reproduceerbaar en minder arbeidsintensief en tijdrovend dan transplantatiemodellen. Het is ook minder duur dan transplantatiestudies, waardoor het geschikter kan zijn voor het screenen van verschillende therapeutische opties en verschillende moleculaire routes. Met aanpassingen aan conserveringsoplossingen door het toevoegen van kandidaat-geneesmiddelen, kan dit platform worden gebruikt om de effecten van farmacologische middelen op het verminderen van PGD in zowel de LV als RV te evalueren.

Harttransplantatie verbetert de overleving en de kwaliteit van leven bij patiënten met eindstadium hartfalen1. Helaas beperkt het tekort aan hartdonoren het aantal patiënten dat baat zou kunnen hebben bij deze therapie en beperkt het het vermogen van clinici om donoren optimaal te matchen met ontvangers 2,3,4. Bovendien heeft het nieuwe toewijzingssysteem bijgedragen tot langere ischemische tijden en is het gebruik van marginale donoren sinds 2018 aanzienlijk toegenomen5. Bijgevolg neemt de gemiddelde leeftijd van hartdonoren en de ischemische tijd in de loop van de tijd toe, wat leidt tot een hoger percentage primaire transplantaatdisfunctie (PGD) ondanks aanzienlijke verbeteringen in de strategieën voor hartbehoud 6.
PGD kan de linker-, rechter- of beide ventrikels aantasten en blijft een levensbedreigende complicatie die de belangrijkste oorzaak is van vroege sterfgevallen na harttransplantatie. Het onderzoeken van de mechanismen van PDG en de ontwikkeling van strategieën voor een beter behoud van het hart zijn belangrijke overwegingen, gezien de potentiële levensreddende impact op hartontvangers. Daarom zijn experimentele modellen die een robuuste en betrouwbare beoordeling van de hartfunctie van de donor na een langere bewaartijd mogelijk maken, essentieel om ons begrip van PGD te vergroten en de ontwikkeling van nieuwe therapieën te vergemakkelijken. De mogelijkheid om de hartfunctie in het hart van muizen nauwkeurig te beoordelen, geeft toegang tot een uitgebreid repertoire van transgene muizenmodellen die PGD-mechanismen nauwkeurig kunnen identificeren.
In fysiologische en farmacologische studies wordt het Langendorff retrograde perfusiemodel veel gebruikt om de hartfunctie tebeoordelen7. In het bijzonder worden cardiale prestaties gedetecteerd door een siliconenballon die is aangesloten op een druktransducer in de linkerventrikelholte (LV). Een belangrijk kenmerk van PGD is de onvoldoende samentrekking en ontspanning van de ventriculaire spier. Eerdere Langendorff-studies hebben zich gericht op het gebruik van een LV-ballon om betrouwbare en reproduceerbare resultaten te produceren bij LV-functionele beoordeling 8,9,10. Het gebruik van een intracavitaire ballon om de rechterventrikelfunctie (RV) te beoordelen met behulp van het ballonsysteem wordt echter minder goed herkend.
Gezien een significant PGD-percentage waarbij de RV na transplantatie betrokken is11, zouden experimentele methoden om zowel LV als RV-functie te bestuderen helpen bij het bepalen van de moleculaire en fysiologische mechanismen die bijdragen aan RV PGD. Dit protocol toont aan dat intracavitaire siliconenballonnen betrouwbare beoordelingen kunnen geven van de LV- en RV-functie in hetzelfde muizenhart12. Om het mogelijke gebruik van het Langendorff-systeem in de PGD-studie te evalueren, onderzochten we de hartfuncties met verschillende opslagperioden en vonden we een verminderde hartfunctie bij samentrekking en ontspanning bij de langdurige koude opslag van muizenharten. Interessant is dat de LV een hogere functionele reductie heeft dan de RV. Samenvattend kan het hier beschreven protocol worden gebruikt voor het beoordelen van het effect van een kandidaat-geneesmiddel en moleculaire routes op zowel de LV- als de RV-functie. De mogelijkheid om deze methode op muizenharten te gebruiken, zal de uitvoering van gedetailleerde mechanistische studies vergemakkelijken.

<table><tbody><tr><td>4-0 zijdedraad</td><td>Braintree Scientific</td><td>SUTS108</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Zijde draad</td><td>Braintree Scientific</td><td>SUTS104</td><td></td></tr><tr><td>Meel voor alle doeleinden</td><td>Kroger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Algemeen gebruik en PrecisionGlide Hypodermische naalden 22 G</td><td>Fisher scientific</td><td>14-826-5A</td><td></td></tr><tr><td>BD Spuit met Luer-Lok Tips (Zonder naald)</td><td>Fisher scientific</td><td>14-823-16E</td><td></td></tr><tr><td>Maïsstroop</td><td>Kroger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Custodiol HTK Oplossing</td><td>Essential Pharmaceuticals LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissectie schaar&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>14393/14394</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL kegelbuisjes</td><td>Fisher scientific</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>Heparine natriumzout uit varkensdarm mucosa&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4784</td><td></td></tr><tr><td>Krebs Henseleit buffer</td><td>Sigma</td><td>K3753</td><td></td></tr><tr><td>Nusil siliconendispersies</td><td>Avantor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfusiesysteem</td><td>Radnoti</td><td>130101BEZ</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab</td><td>ADInstruments</td><td>PL3508</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazied</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Sigma</td><td>X1126</td><td></td></tr></tbody></table>

beoordeling van ex vivo muizen biventriculaire functie in een langendorff-model

Assessment of Ex Vivo Murine Biventricular Function in a Langendorff Model

Primaire transplantaatdisfunctie (PGD) blijft de belangrijkste oorzaak van vroegtijdig overlijden na harttransplantatie. Langdurige ischemische tijd tijdens koude bewaring is een belangrijke risicofactor voor PGD, en betrouwbare evaluatie van de hartfunctie is essentieel om de functionele responsen van het donorhart na koude bewaring te bestuderen. De begeleidende video beschrijft een techniek om de rechter- en linkerventrikelfunctie van muizen te beoordelen met behulp van ex vivo perfusie op basis van een Langendorff-model na koude conservering gedurende verschillende duur. Kortom, het hart wordt geïsoleerd en opgeslagen in een koude histidine-tryptofaan-ketoglutaraat (HTK) oplossing. Vervolgens wordt het hart gedurende 60 minuten geperfundeerd met een Kreb-buffer in een Langendorff-model. Een siliconenballon wordt in de linker- en rechterhartkamer ingebracht en cardiale functionele parameters worden geregistreerd (dP/dt, druk-volumerelaties). Dit protocol maakt een betrouwbare evaluatie van de hartfunctie mogelijk na verschillende protocollen voor het behoud van het hart. Belangrijk is dat deze techniek het mogelijk maakt om hartconserveringsreacties te bestuderen, specifiek in inheemse hartcellen. Het gebruik van zeer kleine muizenharten geeft toegang tot een enorm scala aan transgene muizen om de mechanismen van PGD te onderzoeken.

Volwassen C57Bl/6 muizenharten, 3 maanden oud, werden geoogst en op het Langendorff-systeem gemonteerd. Het donorhart werd 0 en 8 uur opgeslagen in HTK en vervolgens geperfundeerd met zuurstofrijke KH-buffer. Een siliconenballon die werd aangesloten op een druktransducer werd gebruikt om de samentrekking en ontspanning van de LV- en RV-functie te meten.
De aortadruk werd gehandhaafd in het bereik van 70-80 mmHg. De hartslag was vergelijkbaar in muizenharten met 0 en 8 uur opslag. De LV- en RV-functie werden onderzocht door de systolische en diastolische druk te meten. dP/dt, een afgeleide om de verhouding van de drukverandering te berekenen, werd berekend om de drukdynamiek te bepalen. Het absolute aantal max dP/dt en min dP/dt zou het niveau van spiercontractie en ontspanning kunnen vertegenwoordigen. Bij 0 uur opslag had de LV een hogere systolische druk in vergelijking met de RV (Figuur 2C en Figuur 3A). De LV vertoonde meer spiercontractie en ontspanning dan de RV na perfusie van 0 uur opslag (Figuur 2C en Figuur 3B,C). Na 8 uur koude opslag vertoonden zowel de LV als de RV echter een significante functionele reductie in vergelijking met een basislijn van 0 uur (Figuur 2A-D en Figuur 3B,C). De afname van de cardiale contractie was ernstiger in de LV. Na 8 uur opslag was de contractie en ontspanning van de LV 25,1% en 30,7% van de 0 uur basislijn, terwijl de RV 32,5% en 29,1% van de functie had in vergelijking met de 0 uur basislijn (Figuur 3B,C). Deze resultaten toonden aan dat de PGD van de LV na langdurige opslag een significantere cardiale contractievermindering had dan de RV.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64384/64384fig01.jpg"> Figuur 1: Montage en canulatie van het muizenhart . (A) Algemene opstelling van de perfusie-opstelling. 1. Perfusie reservoir. 2. Zuurstofkamer. 3. De kamer van de luchtvanger. 4. Hartkamer. 5. Waardeschakelaar voor constante stroom en druk. 6 en 7. Zuurstoftoevoer. (B) Gecanuleerde harten met de camper aan de voorkant. (C) Positie van de RV om te snijden voor het openen van de holte. (D) Tik met de canule op de ballonbuis. Afkorting: RV = rechterventrikel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64384/64384fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64384/64384fig02.jpg"> Figuur 2: Vergelijking van de functie van de LV versus RV. (A) Tracering van max en min dP/dt in de RV en LV in het donorhart met 0 uur opslag. (B) De registratie van max en min dP/dt in de RV en LV in het donorhart met 8 uur opslag. (C,D) Details van dP/dt, LV-druk, hartslag en perfusiedruk in de LV en RV na 0 uur en 8 uur. Afkortingen: RV = rechterventrikel; LV = linker ventrikel; dP/dt = druk-tijd relatie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64384/64384fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64384/64384fig03.jpg"> Figuur 3: Vergelijking van de functie van de LV versus RV na opslag en perfusie. (A) Systolische en diastolische druk van de LV en RV na 0 uur en 8 uur opslag. (B) Max dP/dt en (C) Min dP/dt van de LV en RV na perfusie met 0 uur en 8 uur opslag. Deze figuur is afkomstig van Lei et al.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64384/64384fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Hier wordt een protocol gepresenteerd om de rechter- en linkerventrikelfunctie van donorharten na koude bewaring betrouwbaar te kwantificeren met behulp van een ex vivo perfusiesysteem.

Beoordeling van ex vivo muizen biventriculaire functie in een Langendorff-model

Primary graft dysfunction (PGD) remains the leading cause of early death following heart transplantation. Prolonged ischemic time during cold preservation ...

Met het beschreven protocol kunnen we de linker hartkamer van het donorhart vergelijken met de functie van de ventrikel na behoud, en kunnen we het verschil in conserveringsbiologie in beide ventrikels tijdens dit conserveringsproces onderzoeken. Deze techniek maakt gebruik van een ex vivo perfusiesysteem om de hartfuncties na conservering te onderzoeken. Het biedt robuuste en betrouwbare hulpmiddelen om nieuwe behandelingen te screenen om de hartfuncties van donoren na behoud te verbeteren.Begin met de bereiding van deeg zoals beschreven in de tekst en vorm een klein stukje deeg in een ovale vorm om de kop te verkrijgen. Bevestig het aan het uiteinde van een droge spaghettistreng. Dompel de kop in de reeds bereide suikeroplossing en verwijder deze langzaam zodra deze goed bedekt is met een dunne film van de oplossing.Hang de spaghettistreng vervolgens op een polystyreenschuimblok of andere houders om de vorming van een gelijkmatige en glanzende hoes over het hoofd mogelijk te maken en droog deze een nacht. Dompel de vorm de volgende dag in siliconenelastomeer gedispergeerd in xyleen en plaats de spaghettistreng terug in het polystyreenschuimblok bij 37 graden Celsius gedurende twee uur of tot het droog is. Herhaal deze stap nog een keer.Plaats vervolgens de mal in het water om de ballon te scheiden en op te vangen. Bewaar de ballon in 0,02% natriumazide. Knip nu een twee stompe uiteinde van een 22-gauge naald en monteer het ene stompe uiteinde op de siliconenballon en het andere stompe uiteinde op een PE-slang.Gebruik een 4-0 zijden hechtdraad om de ballon op zijn plaats op de naald te binden. Neem de C57Black/6 muis en injecteer intraperitoneaal 200 eenheden heparine in de buik van het dier voor antistolling. Nadat u de juiste anesthesie hebt bevestigd met een teenknijp, maakt u een incisie net onder het borstbeen.En open met een schaar de borst door het middenrif in de ribben af te snijden. Vouw vervolgens de voorste borstwand om de borstkas volledig bloot te leggen voordat u een snede maakt in de dalende aorta dicht bij de aortaboog. Breng nu het hart, de longen en de thymus van de muis over naar ijskoude histidine-tryptofaan-ketoglutaraat, of HTK-buffer, om de organen te isoleren.Leg de aorta bloot door eventueel bindweefsel te verwijderen. Verbind het uiteinde van de aorta met een naald van 22 gauge en bind deze vast met een 6-0 zijden hechtdraad. Zorg ervoor dat de canule zich boven de aortawortel bevindt, om de aortaklep niet te hinderen.Doordrenk de aorta gedurende ongeveer 10 minuten met 10 milliliter HTK-buffer, voorgekoeld tot vier graden Celsius. Afhankelijk van het type experiment, bewaar je het hart acht uur in een buis van 50 milliliter met ijskoud HTK of voer je de overdaad onmiddellijk uit. Om overvloed uit te voeren, sluit u het met de naald gemonteerde hart aan op de canule in het Langendorff-apparaat en bindt u het vast met een zijden hechtdraad.Start de overdaad in een constante stroommodus met drie milliliter per minuut en pas na het overschakelen naar een constante drukmodus bij 70 tot 80 millimeter kwik de perfusiesnelheid aan tot ongeveer zes milliliter per minuut. Sluit vervolgens een leeggelopen met water gevulde siliconenballon aan op een druktransducer en een met water gevulde spuit met behulp van een driewegkraan. Na 15 tot 20 minuten van een evenwichtsperiode na de vorige perfusie, snijdt u het rechter atrium of RA door en steekt u de ballon via de RA in de rechterhartkamer, of RV. Gebruik tape om de ballon in de camper te houden en minimaliseer het open gebied van de RA om de ballon in het ventrikel te beperken.Na 20 minuten functionele gegevensverzameling voor de RV, snijdt u het linkeratrium of LA door en steekt u een leeggelopen met water gevulde ballon in de linker hartkamer, of LV, via de LA. Gebruik tape om de ballon in de LV.To te houden, kalibreer de druktransducer, vul eerst een spuit van 10 milliliter met warme zoutoplossing en sluit de spuit aan op de koepel via een driewegkraan. Open de kraan en vul de koepel langzaam met zoutoplossing voordat u alle kranen sluit en de spuit verwijdert. Bevestig vervolgens de gevulde koepel aan de transducer door de manometer aan te sluiten op het derde uiteinde van de driewegkraan.Selecteer in de opnamesoftware in het vervolgkeuzemenu van het kanaal dat op de transducer is aangesloten de optie Bridge Amp. Klik op 0 voordat u de opname start om de transducerwaarde in te stellen op nul millimeter kwik. Na enkele seconden opnemen duwt u langzaam op de spuit en verhoogt u de druk tot 100.Klik op Stoppen om de opname te beëindigen. Selecteer in het dialoogvenster Conversie van eenheden het opnamegebied voor nul millimeter kwik en klik op de pijl naar 1 voordat u nul millimeter kwik typt. Selecteer op dezelfde manier het opnamegebied voor 100 millimeter kwik.Klik op de pijl naar 2 en typ 100 millimeter kwik. Klik nu op OK om de transducer te kalibreren. Nadat de kalibratie is voltooid, wijzigt u de naam van het kanaal dat overeenkomt met de druktransducer met de ballon in Ventrikeldruk of LV-druk en begint u met opnemen wanneer het hart is aangesloten op het systeem.Nadat u de ballon in het ventrikel hebt ingebracht, past u het watervolume in de ballon aan met behulp van een micrometerspuit door de driewegkraan om de einddiastolische druk op vijf tot 10 millimeter kwik te houden. Wijzig vervolgens de naam van een leeg kanaal in dP/dt en behoud het afgeleide bronkanaal als ventrikeldruk. Dit kanaal registreert de verhouding van de drukverandering in de ventriculaire holte tijdens contractie.Selecteer de stabiele meetperiode voordat u naar de instelling in de bloeddrukmodule gaat. Selecteer vervolgens de LV-druk als het ingangskanaal en klik op selectie voordat u op OK drukt. Klik nu op Classificatieweergave om eventuele uitschieters in de hartcyclus te verwijderen en op Tabelweergave om de tabellen te genereren voor het gemiddelde van de maximale dP/dt en de minimale dP/dt voor de geselecteerde periode. Wanneer het muizenhart nul uur voorafgaand aan de perfusie in HTK-buffer werd bewaard, werd een hogere systolische druk geregistreerd voor de LV in vergelijking met de RV. Bovendien vertoonde de LV, in vergelijking met de RV, ook aanzienlijk meer spiercontractie en ontspanning.Wanneer echter perfusie op het hart werd uitgevoerd na acht uur koude opslag, vertoonden zowel de LV als de RV een significante functionele vermindering in vergelijking met de nulurenfase. De dalingen bleken ernstiger te zijn in de LV in vergelijking met de RV. De inkrimping en ontspanning van de LV na acht uur opslag waren 25,1% en 30,7% van de functie die overeenkomt met nulurenopslag, terwijl de RV 32,5% en 29,1% van de functie vertoonde, in vergelijking met de nulurenbasislijn. Indicatie van primaire transplantaatdisfunctie van LV na langdurige opslag was significanter dan die van RV. De conserveringskwaliteit is grotendeels afhankelijk van de perfusie van HTK.Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de perfusie consistent is om verschillende behandelingen nauwkeurig te kunnen vergelijken. Met nauwkeurige meting van de conserveringsfunctie van een donorhart, kan deze methode gemakkelijk worden aangepast om geneesmiddelen te screenen die de hartfunctie van de donor kunnen verbeteren en vervolgens verder te valideren met behulp van een heterotopisch transplantatiemodel.

assessment-ex-vivo-murine-biventricular-function-langendorff

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Het doel is om de mitochondriale redox toestand van geïsoleerde harten te volgen in het kader van fysiologische preload en afterload druk. Een biventriculaire werken konijn hart model wordt gepresenteerd. Hoge resolutie tijdruimtelijke fluorescentie beeldvorming van NADH wordt gebruikt om de mitochondriale redox staat epicardiale weefsel volgen.

NADH fluorescentie beeldvorming van geïsoleerde Biventriculaire Werken Rabbit Hearts

In this video, we perform Langendorff retrograde perfusion of an isolated mouse heart. During the procedure, the cardiac activity of the heart is maintained by perfusing it retrogradely with a perfusion solution via the coronary arteries using a cannula inserted into the ascending aorta. The model is used to study the cardiac pathophysiology of the heart.

Langendorff Retrograde Heart Perfusion: An Ex Vivo Technique to Perfuse Isolated Mouse Heart

Hier presenteren we een protocol voor de modulatie van het intracardiac autonome zenuwstelsel en de beoordeling van de invloed daarvan op fundamentele electrofysiologie, arrhythmogenesis en kamp dynamiek met behulp van een ex vivo Langendorff setup.

Impact van Intracardiac neuronen op cardiale electrofysiologie en Arrhythmogenesis in een Ex Vivo Langendorff systeem

Het doel van deze studie was het vaststellen van een methode voor het onderzoeken van de cardiale dynamiek met behulp van een translationeel diermodel. De beschreven experimentele aanpak omvat Dual-emission optocardiografie in combinatie met een elektrofysiologisch onderzoek om elektrische activiteit te beoordelen in een geïsoleerd, intact varkens hart model.

Optocardiografie en elektrofysiologie studies van ex vivo Langendorff-perfused Hearts

Hier wordt een protocol gepresenteerd om de biventriculaire hartfunctie bij muizen te beoordelen door druk-volume (PV)-lussen te genereren van de rechter- en linkerventrikel in hetzelfde dier met behulp van gesloten thorakatheterisatie. De focus ligt op het technische aspect van chirurgie en data-acquisitie.

Biventriculaire beoordeling van hartfunctie en druk-volumelussen door katheterisatie met gesloten borstkas bij muizen

Het huidige protocol beschrijft aortacantnulatie en retrograde perfusie van het ex-vivo neonatale muizenhart.  Een tweepersoonsstrategie, met behulp van een ontleedmicroscoop en een stompe kleine naald, maakt betrouwbare cannulatie mogelijk. Kwantificering van longitudinale contractiele spanning wordt bereikt met behulp van een krachttransducer die is verbonden met de top van de linker ventrikel.

Aangepaste techniek voor het gebruik van neonatale muizenharten in het Langendorff-preparaat

Het huidige protocol beschrijft methoden voor transgene expressie in ratten- en muizenharten door directe intramyocardiale injectie van het virus onder echocardiografiebegeleiding. Methoden voor de beoordeling van de gevoeligheid van harten voor ventriculaire aritmieën door de geprogrammeerde elektrische stimulatie van geïsoleerde, langendorff-doordrenkte harten worden hier ook uitgelegd.

Virale transgene expressie in knaagdierharten en de beoordeling van het risico op hartritmestoornissen

Het huidige protocol beschrijft het verkrijgen van de druk-volumerelatie door middel van transoesofageale stimulatie, wat dient als een waardevol hulpmiddel bij het evalueren van de diastolische functie in muismodellen van hartfalen.

Een pacing-gecontroleerde procedure voor de beoordeling van hartslagafhankelijke diastolische functies in muizen hartfalen modellen

Dit protocol schetst geavanceerde materiaalfabricage en ex vivo rattenhartmethoden voor optische en elektrische bidirectionele bio-interfacing, waardoor nauwkeurige hartstimulatie, registratie en infarctmodellering voor bio-elektronicaonderzoek mogelijk zijn.

Bidirectionele elektrische en opto-elektronische interfaces in gezonde en ischemische ex vivo rattenharten

Atherosclerose is een chronisch ontstekingsproces. Dit manuscript illustreert een eenvoudig te ex vivo model te gebruiken om verse arteria carotis of coronaire plaques onderzoeken. De ex vivo model maakt het onderzoeken van potentiële stoffen op de inflammatoire milieu in humane atherosclerotische laesies en de resultaten worden geanalyseerd op verschillende manieren.

Een Menselijke<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Atherosclerotische plaque Model naar Letsel Biologie studeren

Leer hoe u ex vivo hartperfusie toepast om biventriculaire functie in muizen te beoordelen na koude preservatie. Deze methode biedt betrouwbare gegevens voor transplantatieonderzoek.

Beoordeling van ex vivo muizen biventriculaire functie in een Langendorff-model

Meer video's verkennen