Beoordeling van ex vivo muizen biventriculaire functie in een Langendorff-model

Met het beschreven protocol kunnen we de linker hartkamer van het donorhart vergelijken met de functie van de ventrikel na behoud, en kunnen we het verschil in conserveringsbiologie in beide ventrikels tijdens dit conserveringsproces onderzoeken. Deze techniek maakt gebruik van een ex vivo perfusiesysteem om de hartfuncties na conservering te onderzoeken. Het biedt robuuste en betrouwbare hulpmiddelen om nieuwe behandelingen te screenen om de hartfuncties van donoren na behoud te verbeteren.

Begin met de bereiding van deeg zoals beschreven in de tekst en vorm een klein stukje deeg in een ovale vorm om de kop te verkrijgen. Bevestig het aan het uiteinde van een droge spaghettistreng. Dompel de kop in de reeds bereide suikeroplossing en verwijder deze langzaam zodra deze goed bedekt is met een dunne film van de oplossing.

Hang de spaghettistreng vervolgens op een polystyreenschuimblok of andere houders om de vorming van een gelijkmatige en glanzende hoes over het hoofd mogelijk te maken en droog deze een nacht. Dompel de vorm de volgende dag in siliconenelastomeer gedispergeerd in xyleen en plaats de spaghettistreng terug in het polystyreenschuimblok bij 37 graden Celsius gedurende twee uur of tot het droog is. Herhaal deze stap nog een keer.

Plaats vervolgens de mal in het water om de ballon te scheiden en op te vangen. Bewaar de ballon in 0,02% natriumazide. Knip nu een twee stompe uiteinde van een 22-gauge naald en monteer het ene stompe uiteinde op de siliconenballon en het andere stompe uiteinde op een PE-slang.

Gebruik een 4-0 zijden hechtdraad om de ballon op zijn plaats op de naald te binden. Neem de C57Black/6 muis en injecteer intraperitoneaal 200 eenheden heparine in de buik van het dier voor antistolling. Nadat u de juiste anesthesie hebt bevestigd met een teenknijp, maakt u een incisie net onder het borstbeen.

En open met een schaar de borst door het middenrif in de ribben af te snijden. Vouw vervolgens de voorste borstwand om de borstkas volledig bloot te leggen voordat u een snede maakt in de dalende aorta dicht bij de aortaboog. Breng nu het hart, de longen en de thymus van de muis over naar ijskoude histidine-tryptofaan-ketoglutaraat, of HTK-buffer, om de organen te isoleren.

Leg de aorta bloot door eventueel bindweefsel te verwijderen. Verbind het uiteinde van de aorta met een naald van 22 gauge en bind deze vast met een 6-0 zijden hechtdraad. Zorg ervoor dat de canule zich boven de aortawortel bevindt, om de aortaklep niet te hinderen.

Doordrenk de aorta gedurende ongeveer 10 minuten met 10 milliliter HTK-buffer, voorgekoeld tot vier graden Celsius. Afhankelijk van het type experiment, bewaar je het hart acht uur in een buis van 50 milliliter met ijskoud HTK of voer je de overdaad onmiddellijk uit. Om overvloed uit te voeren, sluit u het met de naald gemonteerde hart aan op de canule in het Langendorff-apparaat en bindt u het vast met een zijden hechtdraad.

Start de overdaad in een constante stroommodus met drie milliliter per minuut en pas na het overschakelen naar een constante drukmodus bij 70 tot 80 millimeter kwik de perfusiesnelheid aan tot ongeveer zes milliliter per minuut. Sluit vervolgens een leeggelopen met water gevulde siliconenballon aan op een druktransducer en een met water gevulde spuit met behulp van een driewegkraan. Na 15 tot 20 minuten van een evenwichtsperiode na de vorige perfusie, snijdt u het rechter atrium of RA door en steekt u de ballon via de RA in de rechterhartkamer, of RV. Gebruik tape om de ballon in de camper te houden en minimaliseer het open gebied van de RA om de ballon in het ventrikel te beperken.

Na 20 minuten functionele gegevensverzameling voor de RV, snijdt u het linkeratrium of LA door en steekt u een leeggelopen met water gevulde ballon in de linker hartkamer, of LV, via de LA. Gebruik tape om de ballon in de LV.To te houden, kalibreer de druktransducer, vul eerst een spuit van 10 milliliter met warme zoutoplossing en sluit de spuit aan op de koepel via een driewegkraan. Open de kraan en vul de koepel langzaam met zoutoplossing voordat u alle kranen sluit en de spuit verwijdert. Bevestig vervolgens de gevulde koepel aan de transducer door de manometer aan te sluiten op het derde uiteinde van de driewegkraan.

Selecteer in de opnamesoftware in het vervolgkeuzemenu van het kanaal dat op de transducer is aangesloten de optie Bridge Amp. Klik op 0 voordat u de opname start om de transducerwaarde in te stellen op nul millimeter kwik. Na enkele seconden opnemen duwt u langzaam op de spuit en verhoogt u de druk tot 100.

Klik op Stoppen om de opname te beëindigen. Selecteer in het dialoogvenster Conversie van eenheden het opnamegebied voor nul millimeter kwik en klik op de pijl naar 1 voordat u nul millimeter kwik typt. Selecteer op dezelfde manier het opnamegebied voor 100 millimeter kwik.

Klik op de pijl naar 2 en typ 100 millimeter kwik. Klik nu op OK om de transducer te kalibreren. Nadat de kalibratie is voltooid, wijzigt u de naam van het kanaal dat overeenkomt met de druktransducer met de ballon in Ventrikeldruk of LV-druk en begint u met opnemen wanneer het hart is aangesloten op het systeem.

Nadat u de ballon in het ventrikel hebt ingebracht, past u het watervolume in de ballon aan met behulp van een micrometerspuit door de driewegkraan om de einddiastolische druk op vijf tot 10 millimeter kwik te houden. Wijzig vervolgens de naam van een leeg kanaal in dP/dt en behoud het afgeleide bronkanaal als ventrikeldruk. Dit kanaal registreert de verhouding van de drukverandering in de ventriculaire holte tijdens contractie.

Selecteer de stabiele meetperiode voordat u naar de instelling in de bloeddrukmodule gaat. Selecteer vervolgens de LV-druk als het ingangskanaal en klik op selectie voordat u op OK drukt. Klik nu op Classificatieweergave om eventuele uitschieters in de hartcyclus te verwijderen en op Tabelweergave om de tabellen te genereren voor het gemiddelde van de maximale dP/dt en de minimale dP/dt voor de geselecteerde periode. Wanneer het muizenhart nul uur voorafgaand aan de perfusie in HTK-buffer werd bewaard, werd een hogere systolische druk geregistreerd voor de LV in vergelijking met de RV. Bovendien vertoonde de LV, in vergelijking met de RV, ook aanzienlijk meer spiercontractie en ontspanning.

Wanneer echter perfusie op het hart werd uitgevoerd na acht uur koude opslag, vertoonden zowel de LV als de RV een significante functionele vermindering in vergelijking met de nulurenfase. De dalingen bleken ernstiger te zijn in de LV in vergelijking met de RV. De inkrimping en ontspanning van de LV na acht uur opslag waren 25,1% en 30,7% van de functie die overeenkomt met nulurenopslag, terwijl de RV 32,5% en 29,1% van de functie vertoonde, in vergelijking met de nulurenbasislijn. Indicatie van primaire transplantaatdisfunctie van LV na langdurige opslag was significanter dan die van RV. De conserveringskwaliteit is grotendeels afhankelijk van de perfusie van HTK.

Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de perfusie consistent is om verschillende behandelingen nauwkeurig te kunnen vergelijken. Met nauwkeurige meting van de conserveringsfunctie van een donorhart, kan deze methode gemakkelijk worden aangepast om geneesmiddelen te screenen die de hartfunctie van de donor kunnen verbeteren en vervolgens verder te valideren met behulp van een heterotopisch transplantatiemodel.