Een in-house gebouwd en licht-emitting-diode-gebaseerd fotodynamisch therapie-apparaat voor het verbeteren van verteporfine cytotoxiciteit in een 2D-celcultuurmodel

Fotodynamische therapie, PDT, biedt verschillende voordelen voor de behandeling van kanker, en de werkzaamheid ervan hangt af van een lichtbron om een fotosensitizer te activeren. Hoewel recente ontwikkelingen in het veld, is er een gebrek aan toegang tot een duur en reproduceerbaar apparaat voor PTD voor in vitro modellen. Om aan deze vraag te voldoen, beschrijft dit werk een nieuw, eenvoudig en goedkoop apparaat om PDT-testen uit te voeren op celculturen, genaamd PhotoAct.

Om de bouw te starten, zag drie millimeter dikte vezelplaten met gemiddelde dichtheid, MDF, om stukken met de volgende afmetingen te verkrijgen. Bouw twee dozen met de volgende afmetingen. Boor de achterkant van de grotere doos om een barrel jack-connector te installeren.

Boor ook de bovenkant van de grotere doos, de bovenkant en de onderkant van de kleinere doos om een doorgang te bieden voor elektrische kabels. Verf alle interne oppervlakken met zwarte inkt om een homogene lichtinval te bevorderen. Bevestig parallel drie LED-tapes met elk 10 LED's aan het bovenste binnenoppervlak van de kleinere doos.

Installeer bovendien een helderheidssensor in het midden van het onderste binnenoppervlak van de kleinere doos. Druk de structuur van de besturingseenheid af met behulp van het aanvullende 3D-afdrukbestand. Installeer alle componenten, aan / uit-knop, potentiometers, time start touchpad, LED's, helderheidssensor, LCD, zoemer en voeding, en de onderdelen van een ESP-32 controller board gemonteerd op de controle-eenheid interieur.

Upload de programmeercode die beschikbaar is in het aanvullende bestand en voer een test uit om te controleren of alle verbindingen werken. Monteer de dozen en bevestig ze aan elkaar om gaten en bijgevolg externe verlichtingsinterferentie en onmiddellijk lichtverlies te voorkomen. Bevestig de gemonteerde besturingseenheid aan het geboorde gebied aan de bovenkant van het prototype.

Bouw een voordeur van hetzelfde materiaal in de volgende afmetingen en bevestig deze op de buitenste doos met scharnieren en klittenband om kamersluiting en ononderbroken testen te garanderen. Installeer ook een handgreep om de voordeur met gemak en precisie te manipuleren. Bevestig vier rubberen voetkussens aan de onderkant van het prototype om meer stabiliteit tijdens de bewerkingen te garanderen.

Cultiveer HeLa cellijn in Dulbecco's Modified Eagle Medium lage glucose met 10% foetaal runderserum en 1% gentamycine. Houd de kweekkolven op 5% van koolstofdioxide en 37 graden Celsius. Beheer en inspecteer de celcultuur totdat 80 tot 90% van de samenvloeiing is bereikt.

Start het protocol voor de levensvatbaarheid van cellen met het zaaiproces. Verwijder het medium uit de kolf met samenvloeiende HeLa-celcultuur. Was de kolf met fosfaatbufferzoutoplossing, PBS, en maak de cultuur los met trypsine na gemarkeerde details.

Tel de resuspendcellen met een hemocytometer en zaai ze in een multi-well microplaat met een concentratie van 20.000 cellen per put. Bereid twee platen voor op donkere en lichte behandelingsomstandigheden en incubeer ze gedurende 24 uur tot celaanhechting. Om door te gaan met de behandeling met een fotosensitizer, verwijdert u het medium uit beide platen en behandelt u de cellen met 100 microliter toenemende concentraties Verteporfine.

Houd de cellen 24 uur in behandeling om Verteporfin internalisatie mogelijk te maken. Verwijder na incubatie de behandeling, was de cellen met PBS en voeg een medicijnvrij medium toe. Bedek een microplaat met aluminiumfolie om het te beschermen tegen blootstelling aan licht en incubeer het gedurende 24 uur.

Deze microplaat biedt controlegegevens voor verdere analyse van PDT-resultaten. De andere microplaat zal worden gebruikt bij blootstelling aan licht bij de PhotoAct. Om de apparatuur te bedienen, sluit u deze aan op het stopcontact en schakelt u deze in met een druk op de aan / uit-knop.

Plaats de multi-well microplaat in de PDT-kamer en sluit de apparatuur door de voordeur vast te maken met de zijklittenband. Om de apparatuur in te stellen, gebruikt u de potentiometers om de RGB-configuratie van de lichtemissie aan te passen. Druk op het plus/min touchpad om de tijdconfiguratie aan te passen en de duur van de test in te stellen.

Controleer of de juiste informatie over de test op het display wordt weergegeven en breng indien nodig de laatste aanpassingen aan. Druk op het start-touchpad om de test te starten. Aan het begin van het experiment moet een zoemer met één pieptoon te horen zijn.

Tijdens het experiment kan voortgangsinformatie op het display worden waargenomen, zoals bestraling en resterende tijd. Open de voordeur niet en wijzig geen configuratie tijdens de PDT-test. Aan het einde van de test moet een zoemer met vier piepjes worden gehoord en het elektronische systeem schakelt alle LED's uit.

Een voltooid bericht en de uiteindelijke hoeveelheid energie die tijdens het experiment is uitgebreid, kunnen op het display worden waargenomen. De fluence eindwaarde wordt berekend volgens de gemarkeerde vergelijking. Bedek de microplaat die licht heeft ondervonden en ga verder met de 24-uurs incubatie.

Verwijder na de incubatietijd het medium van beide platen, was de monolaag van cellen met PBS en voeg MTT-oplossing toe. Incubeer beide platen gedurende vier uur donkere en lichte omstandigheden om de vorming van formazankristallen mogelijk te maken. Verwijder de MTT-oplossing voorzichtig en los de paarse kristallen op met een DMSO- en ethanoloplossing.

Na volledige kristaloplossing voert u de absorptiemeting uit met behulp van een microplaatlezer op 595 nanometer. Het eindproduct bestaat uit een donkere kamer met het bovenste binnenoppervlak uitgerust met een set van 30 verstrooide lichtgevende diodes, LED's, geprogrammeerd om verschillende spectrums van zichtbaar licht uit te zenden. Een homogene lichtinval wordt vastgesteld door de lage reflectiviteit van binnenoppervlakken en de uniforme verdeling van de LED-configuratie.

De installatie-interface is gebruiksvriendelijk en de vaste experimentele toestand was reproduceerbaar. Als proof of concept werd het apparaat gebruikt om het cytotoxische effect van Verteporfine in 2D HeLa-celcultuur na blootstelling aan licht te versterken. Zoals te zien is in de figuur, was de GI50-waarde 3,1 micromolair voor de lichtconditie.

en 13,8 micromolair voor de donkere toestand Daarom bevestigt de toename van meer dan het viervoudige van de efficiëntie bij het vergelijken van de omstandigheden het gebruik van Verteporfin als fotosensitizer en de toepasbaarheid van PhotoAct op PDT-assays. Om het gebruik van het prototype dat in dit werk wordt beschreven te valideren, werd een commercieel PDT-apparaat gebruikt onder dezelfde experimentele omstandigheden, inclusief photosensitizer, cellen en fluence, en de resultaten werden vergeleken. Zoals te zien is in de figuur, fotoactiveerden beide apparaten Verteporfine in gelijke mate, waardoor het cytotoxische effect werd versterkt.

Ten slotte werd de ROS-gemedieerde celdood veroorzaakt door Verteporfin na blootstelling aan licht bevestigd door flowcytometrie met behulp van DCFDA-assay. Kortom, het apparaat is eenvoudig gebouwd met commercieel verkrijgbare goedkope componenten met een totale kostprijs van minder dan 50. Het belangrijkste andere voordeel van het apparaat is draagbaarheid, lage onderhoudsvraag, capaciteit om meerdere soorten kweekplaten te bestralen, het gelijktijdige gebruik van maximaal vier eenheden per test, nauwkeurige en reproduceerbare bestraling, gebruiksvriendelijke en eenvoudige installatie-interface die geen verbinding met computers of andere machines vereist.

Daarnaast wordt een beslissingsstroomdiagram gepresenteerd om een systematische probleemoplossende aanpak te bieden om problemen of fouten tijdens de operatie te vinden en te corrigeren. Deze bevindingen maken het mogelijk om de voordelen van PhotoAct uit te breiden om PDT te vergemakkelijken tot wetenschappelijk onderzoek, waarbij het werkingsmechanisme van fotosensitizers en hun klinische toepassingen wordt onderzocht.