Compost microkosmos als microbieel diverse, natuurlijk-achtige omgevingen voor microbioomonderzoek in Caenorhabditis elegans

Dit protocol beschrijft hoe wormen en compostmicrokosmos kunnen worden gekweekt, waardoor de interactie tussen gastheer en microbioom in een natuurlijk-achtige context in het laboratorium kan worden verkend. Deze methode biedt een alternatief voor het isoleren van wilde wormen uit de natuur of het gebruik van synthetische microbiële gemeenschappen met beperkte microbiële diversiteit. Dit protocol is eenvoudig en kan in elk laboratorium worden uitgevoerd en is zelfs geschikt voor beginners.

Om te beginnen, verkrijg compost of tuinaarde van elke handige bron en bewaar het in het laboratorium in een standaard plastic keukencontainer met gaten in het deksel voor beluchting. Dicht de gaten met watten om fruitvliegjes en andere ongewervelde dieren buiten te houden. Verrijk de compost of grond met gehakte producten of een mengsel van verschillende producten in de grond om een verhouding van twee op één in massa te produceren.

Meng de compost eenmaal per dag en voeg M9 medium toe als dat nodig is om vocht te behouden zonder het modderig te maken. Voeg voor elke microkosmos 10 gram verrijkte compost toe aan een glazen bekerglas van 30 milliliter bedekt met tinfoil. Voeg 30 gram verrijkte compost toe aan elke buis van 50 milliliter.

Vul de buis met M9 en vortex. Centrifugeer de buizen bij 560 G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Verwijder met behulp van een serologische pipet de supernatanten zonder de pellet te verstoren en combineer ze in een nieuwe buis van 50 milliliter.

Concentreer het bacteriële extract door de buis gedurende 15 minuten op maximale snelheid bij kamertemperatuur te centrifugeren. Resuspendeer de pellets in voldoende M9 om 200 microliter voor elke microkosmos en 200 microliter te hebben voor een plaat die zal dienen als een zichtbare proxy voor microkosmos. Voeg 200 microliter van het geconcentreerde microbiële extract toe aan het geautoclaveerde compostbekerglas en de zichtbare proxy NGM-plaat.

Voeg 500 tot 1000 L1-larven toe aan elke microkosmos en de proxyplaat. Bekleed een cilindrische PVC-buis met tissuepapier. Deze cilinder moet een nylon gaas van één millimeter hebben dat aan de onderkant in de trechter is gelijmd.

Plaats de cilinder in de Baermann-trechter zittend in een kolf. Voeg 20 milliliter M9 toe aan de microkosmos van de worm. Roer het mengsel en giet het mengsel vervolgens uit het bekerglas in de met tissuepapier beklede cilinder in de Baermann-trechteropstelling.

Dompel de compost volledig onder in de trechter door meer M9 toe te voegen. Maak de klem los om het filtraat met de geoogste wormen in een buis van 50 milliliter vrij te maken. Concentreer vervolgens de wormen door de buis gedurende twee minuten bij kamertemperatuur op 560 G te centrifugeren. Herhaal deze stappen en trek de filtrates uit verschillende rondes als er meer wormen gewenst zijn.

Verwijder het supernatant met een serologische pipet terwijl u 15 milliliter in de buis laat. Breng de resterende vloeistof over in een buis van 15 milliliter en centrifugeer opnieuw gedurende één minuut om de wormen verder te concentreren. Verwijder 14 milliliter van het supernatant met een serologische pipet.

Verzamel tegelijkertijd een gram van de resterende microkosmosgrond in een buis van 1,5 milliliter tijdens het verwerken van de bodemmonsters die de omgevingsbacteriële gemeenschap bevatten zoals beschreven in het manuscript. Breng een milliliter van de geconcentreerde geoogste wormen over in een buis van 1,5 milliliter met behulp van een glazen pipet. Incubeer gedurende twee minuten om de wormen op de bodem van de buis te laten bezinken.

Verwijder het supernatant terwijl u 100 microliter van de pellet ongemoeid laat op de bodem van de buis. Was de pellet met 1,5 milliliter M9 plus Triton X, zodat de wormen zich telkens op de bodem kunnen nestelen. Breng de gewassen wormen in een volume van 100 microliter over op een nieuwe buis van 1,5 milliliter met behulp van een glazen pipet.

Om de wormen te verlammen, voegt u 100 microliter 25 millimolar levamisolhydrochloride toe en incubeert u gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Voeg 200 microliter 4% bleekoplossing toe en incubeer gedurende twee minuten. Verwijder het supernatant en laat de onderste 150 microliter ongestoord en was de wormpellet driemaal met M9 plus Triton X.Deze oppervlakte-gesteriliseerde wormen kunnen worden bewaard bij min 20 graden Celsius tot gebruik en kunnen later worden gebruikt voor downstream-toepassingen.

Het vergelijken van de darmmicrobiomen van de worm en milieugemeenschappen met behulp van principecoördinatenanalyse op basis van ongewogen of gewogen UniFrac-afstand toonde een duidelijke clustering van wormdarmmicrobiomen weg van die in hun respectieve omgevingen. Hoewel principecoördinaatanalyse op basis van ongewogen UniFrac-afstanden geen onderscheid maakte tussen bodem- en wormmicrobiomen, onthulde clustering op basis van gewogen afstanden een duidelijke scheiding van wormdarm- en compostmicrobiomen. In deze studie werden wormen gekweekt in compostmicrokosmos gebruikt voor 16S-sequencing, maar kunnen ook worden gebruikt om de effecten van verschillende omgevingsmicrobiomen op de resistentie van de gastheer tegen ongunstige omstandigheden te testen.

Als alternatief kunnen nieuwe bacteriële taxa worden geïsoleerd uit wormen die zijn geoogst uit compostmicrokosmos om de bekende taxonomische en functionele diversiteit van wormdarmenammens uit te breiden. Na de ontwikkeling ervan vergemakkelijkte de microkosmospijplijn de beoordeling van de bijdragen van genetische factoren uit het milieu versus de gastheer bij het vormgeven van het darmmicrobioom.