Extractie, etikettering en zuivering van afstammingsspecifieke cellen uit menselijke antrale follikels

Het hier gedemonstreerde protocol maakt het labelen en isoleren mogelijk van specifieke cellijnen die aanwezig zijn in ovariële follikels vanaf vroege antrale stadia, waardoor de analyse en cultuur met hoge resolutie mogelijk wordt. Deze zeer nauwkeurige benadering maakt gebruik van combinaties van fluorofoor geconjugeerde antilichamen om celoppervlakmarkers te targeten die robuust en specifiek tot expressie komen tussen discrete granulosa-, stroma- en theca-afstammingslijnen. Begin met het plaatsen van de eierstok in een steriele petrischaal en giet er een gekoeld medium bij om het weefsel te hydrateren, zodat de eierstok half ondergedompeld is in het medium.

Verwijder eventuele hechtingen of ander materiaal en ontleed het resterende omliggende weefsel weg van de eierstok. Om de antrale follikels te isoleren, identificeert u individuele follikels en kiest u gezonde follikels. Sluit met bloed gevulde, donkere of niet-symmetrische follikels uit.

Isoleer de gekozen antrale follikels uit de eierstok met behulp van scalpels, houd het antrum intact en exciseer het corticale weefsel dat de follikel omvat. Plaats elke weggesneden intacte antrale follikel in een put van de zes putplaat. Gebruik een liniaal die onder de schaal is geplaatst om de follikeldiameter te bepalen voor beschrijvende doeleinden.

Gebruik een scalpel om de intacte antrale follikel te bisecteren om de antrale holte te beoordelen en voeg zes milliliter enzymatisch celloslatingsmedium toe voordat u de plaat gedurende 10 minuten in een bevochtigde incubator incubeert. Voeg na incubatie zes milliliter beschikbaar medium toe dat 20% foetaal runderserum of FBS bevat en spoel met het medium door herhaaldelijk krachtig pipetteren over de doorsneden follikels met een P-1000 micropipette. Verzamel vervolgens het medium en laat het door een filter van 100 millimeter lopen.

Na het centrifugeren van het gefilterde supernatant op 300 G en vier graden Celsius gedurende drie minuten eerder, zuigt u het supernatant op. Plaats het resterende weefsel in een mengsel van 100 eenheden per milliliter collagenase en één eenheid per milliliter dispase verdund in een uitgebalanceerde zoutoplossing vóór 30 minuten incubatie. het weefsel mechanisch verstoren door twee keer na 10 en 20 minuten tritureren en krachtig pipetteren.

Als u klaar bent, herstelt u het weefsel en spoelt u door pipetteren, door een P-1000 micropipette-tip en zeeft u door een filter van 100 milliliter. Centrifugeer het gespannen weefsel op 300 G en vier graden Celsius gedurende drie minuten voordat u de celpellet verrijkt met de thecacellen en stromacellen op ijs zet voor etikettering en FACS. Om granulosacellen en thecacellen te identificeren, resuspendeert u de celpellets in een blokkerende oplossing met direct geconjugeerde antilichamen en incubeert u gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.

Na het wassen en centrifugeren van de cellen, resuspensie de cellen in FACS-buffer met 4-6 diamidino-2-fenylindool, of DAPI, en voer de celsuspensie door een FACS-instrument om een kleine populatie van de cellen te vangen, met behulp van de fluorescerende intensiteit van fluorofoor geconjugeerde antilichamen voor gating. Bisect de rest van de eierstok. Snijd de medulla weg met een gebogen fijne schaar en scalpels en vermijd schade aan de ovariële cortex.

Ga door met het verwerken en dunner worden van de ovariële cortex door zachtjes te schrapen totdat er minimale medulla overblijft. Verdeel het corticale weefsel in twee tot drie millimeter brede stroken langs de eierstoklengte. Voor het bevriezen van eierstokweefsel plaatst u één corticale strip in elke gekoelde cryogene injectieflacon met de vriesoplossing.

Schud de cryogene injectieflacons met de corticale strips op een roterende plaat gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Nucleate ijskristalvorming door elke cryoflacon aan te raken met een katoenen tip kort ondergedompeld in vloeibare stikstof. De eierstokcellen werden verzameld en de celfracties werden gesorteerd van de antrale follikels FACS tot meer dan 95% zuiverheid.

CD99 specifiek gelabelde granulosacellen in PVRL1, of nectine, werd steeds meer gelokaliseerd in het oophorus granulosa-celcompartiment naarmate de antrale follikels in omvang toenamen. Er werd gezien dat de antilichamen tegen endoglin of CD55 specifiek alle stroma- en thecacellen afbakenden en dat alanineaminopeptidase specifiek tot expressie werd gebracht door androgene thecacellen. De cellen werden gelabeld met een antilichaam gericht tegen CD99 om granulosacellen te identificeren en antilichamen tegen CD45 werden gebruikt om hematopoëtische cellen uit te sluiten.

Antilichamen tegen PVRL1 scheidden de granulosacelpopulatie in oophorus- en muurschilderingscompartimenten. Na enzymatische vertering met collagenase dispase, maakten de celpreparaten gelabeld met antilichamen tegen CD55, CD34 en alanine aminopeptidase de vangst van alle stroma- of thecacellen of androgene thecacellen mogelijk met uitsluiting van endotheelcellen uit de populaties van de thecacellen. Let er vooral op dat u het antrum van follikels niet verstoort tijdens de eerste follikelisolatie door binnen een veilige marge rond de follikelranden te snijden.

Stroomafwaarts van deze procedure kunnen de cellen worden gebruikt voor moleculaire of diagnostische analyse of als alternatief in vitro worden gekweekt voor toxicologische studies, experimentele analyse of recapitulatie van de follikelmicro-omgeving. Tot op heden werden deze methoden gebruikt om endocriene stoornissen waarbij de eierstok betrokken is te modelleren en om nieuwe subpopulaties van follikelgerelateerde cellen te identificeren.