In vitro Selectie van gemanipuleerde transcriptionele repressoren voor gerichte epigenetische uitschakeling

De epigenetische uitschakelingstechnologie die we hebben ontwikkeld, behoort tot een grotere arena van technologieën, namelijk gen-uitschakelingstechnologieën. Voordat we begonnen met het ontwikkelen van de behoefte aan epigenetische uitschakeling, waren er twee alternatieven in het veld. De ene is gen-knock-down door RNA-interferentie, en de andere was genverstoring door kunstmatige nucleasen.

En de genverstoring door kunstmatige nucleasen werkt op DNA-niveau. Dus je hebt je doelgen dat je wilt inactiveren, en je levert aan de cel enkele kunstmatige nucleasen, die een dubbele snaarbreuk veroorzaken. Dit soort dubbele snaarbreuk kan de degeneratiesom, frameshift-mutatie, uitvoeren die uiteindelijk ofwel degeneratie van niet-functioneel eiwit oplegt, ofwel tegelijkertijd transcriptionele degradatie.

Epigenetische uitschakeling werkt dus door de cel af te leveren, zogenaamde gemanipuleerde transcriptie-repressoren. Dit zijn enkele kleine eiwitten die in staat zijn om zich te binden aan je doel-DNA, en zich vervolgens alleen op te leggen aan je doelgen, de zogenaamde epigenetische marx. Dit zijn enkele chemische modificaties die, eenmaal afgezet op het DNA, kunnen leiden tot chromatineverdichting.

Chromatineverdichting leidt dan tot transcriptieremming, zodat je geen expressie meer hebt van je doelgen. En heel belangrijk, dit soort transcriptie-onderdrukkende toestand kan langdurig door de cellen worden verenigd. Om cellijnen te identificeren die het doelgen tot expressie brengen dat tot zwijgen moet worden gebracht, bladert u door het doelgen in The Human Protein Atlas en navigeert u door de sectie Cellijn om cellijnen te identificeren die representatief zijn voor het somatische weefsel van belang.

Geef uit de geïdentificeerde cellijnen prioriteit aan de cellijnen waarvoor efficiënte protocollen voor voorbijgaande genafgifte beschikbaar zijn. Open vervolgens een genviewer en identificeer het gebied van het doelgen om de fluorofoorexpressiecassette te integreren. Gebruik vervolgens CHOPCHOP om GNRA te identificeren en te selecteren, dat in het doelgebied in het eerste intron van het Beta-2M-gen zal knippen.

Ontwerp vervolgens een donorsjabloon voor de GNRA-snijplaats, bestaande uit een linker homologie-arm, een promotorvrije transgenexpressiecassette en een rechterhomologie-arm. Lever het CRISPR Cas9-nucleasesysteem en de donorsjabloon in de K-562-cellijn via nucleofectie, volgens de instructies van de fabrikant. Kweek de K-562-cellen gedurende ten minste 14 dagen.

Bewaak de expressieniveaus van de fluorescerende reporter in de loop van de tijd met behulp van een flowcytometer. Activeer het FICO-etherinekanaal om de fluorescentie-intensiteit van de tdTomato-reporter te meten. Blader door het doelgen in de UCSC Genome Browser en extraheer de nucleotidesequentie van regio's die mogelijk de transcriptionele activiteit reguleren, zoals CpG-eilanden en locaties die zijn verrijkt voor H3K27-acetylering.

Plak de geselecteerde sequenties in de CHOPCHOP online tool, en selecteer repressie als het doel van de GNRA's die moeten worden opgehaald. CHOPCHOP zal een lijst van GNRA's opleveren die in kaart zijn gebracht op basis van de genetische sequentie van belang en gerangschikt op basis van een score, rekening houdend met het aantal off-target matches en de voorspelde doelefficiëntie. Selecteer ten minste 10 GNRA's per doelsequentie.

Probeer GNRA's te selecteren die de hele regio bestrijken om te worden geïntegreerd zonder volledige overeenkomsten met andere intergene sequenties in het hele genoom. Na het transformeren van de plasmiden die coderen voor de ETRS in chemisch competente E.coli-cellen, screent u de kolonies op de aanwezigheid van het ETR-dragende plasmide door middel van restrictie-enzymvertering en Sanger-sequencing. Om de GNRA's in de phU6 GNRA-ruggengraat te klonen, genereert u eerst oligo's met behulp van moleculair-biologische ontwerpsoftware.

Voeg een sequentie van vijf nucleotides toe stroomopwaarts van de proto-spacer en label deze 25-nucleotide lange oligo. Voeg op dezelfde manier een vijf-nucleotidesequentie toe van het omgekeerde complement van de proto-spacer en een cytosine stroomafwaarts ervan, om een 25-nucleotide lange oligo te genereren en deze te labelen. Laat deze oligo's synthetiseren als zoutvrije enkelstrengs DNA-oligo's geresuspendeerd in water op 100 micromolair.

Voeg één microliter van elke oligo toe aan twee microliter gloeibuffer en 16 microliter water. Voer oligogloeien uit door de oplossing gedurende 10 minuten in een thermocycler bij 95 graden Celsius te plaatsen. Koel vervolgens geleidelijk af tot 25 graden Celsius gedurende 45 minuten.

Verdun één microliter van de gegloeide oligo's met 99 microliter nucleasevrij water. Bind vervolgens één microliter van deze verdunning met 50 nanogram phU6 GNRA-plasmide, eerder verteerd met het Bsa1-restrictie-enzym. 20 microliter chemisch competente E.coli-cellen getransformeerd met twee microliter van het ligatieproduct.

Kies meerdere kolonies voor plasmide-DNA-productie en bevestig het succesvol klonen van de proto-spacer door Sanger-sequencing. Om de GNRA's en op CRISPR dCas9 gebaseerde DTR's in de reportercellijn in array af te leveren, bereidt u eerst afzonderlijke buisjes voor die 500 nanogram van elk van de plasmiden bevatten en voegt u 125 nanogram verschillende GNRA-coderende plasmiden toe om te testen. Voeg een GNRA- en ETR-vrije nucleofectieconditie toe als nepbehandeld monster.

Bereid ten minste drie technische replicaten per monster voor. Pellet vijf keer 10 tot de vijfde Beta-2M tdTomato K-562-cellen per buis en nucleoffect ze met de plasmidemix. Resuspendeer de cellen in 200 microliter eerder opgewarmde RPMI 1640 zoogdiercelkweekmedia en plaats ze in de incubator.

Gebruik flowcytometrie om het percentage tot zwijgen gebrachte cellen op verschillende tijdstippen na toediening van de ETR's te meten. Gebruik wildtype cellen zonder de Flora 4-coatingsequentie. Om de drempel van negatieve cellen van de verslaggever in te stellen.

Gebruik het nep-behandelde monster om de poort in te stellen voor reporter-positieve cellen. Identificeer de top drie GNRA's in termen van uitschakelingsefficiëntie op lange termijn. Gebruik feiten om de negatieve subpopulaties van de verslaggever te selecteren die stabiel in die steekproeven worden gehandhaafd.

Voer ook feiten uit van de nagebootste behandelde monsters onder dezelfde behandeling om een goede vergelijking mogelijk te maken bij volgende analyses. Een tdTomato fluorescerende reporter werd geïntegreerd in het eerste intron van het menselijke Beta-2M-gen door CRISPR Cas9-geïnduceerd tomologiegericht herstel. Reporter-positieve K-562-cellen verschijnen na integratie in het behandelde monster.

Na voorbijgaande toediening van de drievoudige ETR-combinatie, samen met GNRA's, werd longitudinale flowcytometrie-analyse uitgevoerd om de expressie van de fluorescerende reporter te beoordelen. Er werd een piek waargenomen in de repressie van de verslaggever bij acute analyses, die gedeeltelijk werd geabsorbeerd als gevolg van mitotische verdunning van de ETR-coderende plasmiden in de loop van de tijd. Effectieve afzetting van CpG-methylering op de doellocus door de GNRA-combinatie van de ETR was duidelijk door permanente onderdrukking van de verslaggever in een aanzienlijk deel van de behandelde cellen.

Verschillende GNRA's vertoonden een wisselende efficiëntie van het tot zwijgen brengen op lange termijn. Een van de belangrijkste stappen in het bereiken van permanente en efficiënte epigenoomuitschakeling is de identificatie van effectief enkelvoudig gRNA. Om dit te doen, moet elke vorm van toepassing beginnen met de identificatie van de meest responsieve sequenties, inclusief promotor en antwoord op andere sites voor transcriptionele regulatoren.

Eenmaal geïdentificeerd wat de meest responsieve en effectieve regio zou kunnen zijn, zou iedereen een ander soort enkelvoudig gRNA moeten ontwerpen, een test als individu of een combinatie van enkelvoudig gRNA. Een van de meest voor de hand liggende toepassingen van epigenoombewerking is zeker de preklinische vertaling in elke winst van functionele mutatie, waarbij het uitschakelen van dit gen nuttig zou kunnen zijn om specifieke ziekten te genezen. Als alternatief moeten we hoe dan ook in gedachten houden dat de mogelijkheid om specifiek de epigenetische regulatie van een bepaalde promotor te veranderen, een super nuttig hulpmiddel kan zijn voor zowel klinische als fundamentele translationele wetenschap.